За последние годы достижения в области геномики привели к открытию того, что геном гораздо более широко транскрибируется, чем считалось ранее. Большая часть вновь обнаруженного транскриптома представляет собой длинные не-кодирующие РНК (lncRNAs), гетерогенную группу в основном не охарактеризованных транскриптов [1,2,3]. Эти lncRNAs имеют много общих черт с транскриптами РНК, кодирующими белки, например, наличие эпигенетических меток, указывающих на дифференциальную экспрессию [4], наличие интронов, транскрипция, опосредованная РНК-полимеразой II или, в некоторых случаях, РНК-полимеразой III, и существование сплайсированных вариантов. Многие, но не все lncRNA являются полиаденилированными, также есть данные, указывающие на то, что многие lncRNA существуют как в полиаденилированной, так и в не-полиаденилированной форме [5]. LncRNA могут перекрывать кодирующие гены, и, по оценкам, 20% человеческих транскриптов содержат пары "смысловой - анти-смысловой" [6]. Эти транскрипты могут перекрывать весь ген или только его часть, а некодирующий транскрипт может происходить как из смысловой, так и из анти-смысловой нити [7].

Хотя уровень экспрессии lncRNAs очень низок по сравнению с белковыми кодирующими РНК, lncRNAs демонстрируют гораздо более ограниченную временную и тканевую экспрессию [8]. Такая специфичность является ключевой в той роли, которую множество lncRNA играют в определенных биологических процессах. На клеточном уровне lncRNA могут располагаться как в цитоплазме, так и в ядре, и даже могут быть обнаружены в обоих субклеточных местах. Действительно, субклеточное расположение является отражением функциональной роли этих lncRNA в клетке [9]. Так, цитоплазматические lncRNAs выполняют регуляторную функцию в основном на пост-транскрипционном уровне, а ядерные lncRNAs - на транскрипционном, хотя есть примеры ядерных lncRNAs, которые могут экспортироваться в цитоплазму и таким образом выполнять регуляторные функции на пост-транскрипционном уровне [10-12].

Вкратце, lncRNA чаще всего классифицируются на шесть хорошо известных групп, основанных на их геномном расположении и генетических элементах, которые их окружают. Первая группа - это lncRNAs, транскрибируемые с того же промотора, что и соседний с ними ген. Этот тип lncRNA может транскрибироваться в 3' или 5' направлениях и может транскрибироваться с одной и той же нити ДНК или с комплементарной нити. Экспрессия lncRNA и мРНК соседнего гена обычно коррелируют, причем экспрессия мРНК модулируется действием lncRNA. Вторая группа - это lncRNAs, расположенные между двумя белок-кодирующими генами на расстоянии примерно 10 кб между ними в так называемых геномных пустынях. Эти lncRNAs обозначаются как межгенные длинные не-кодирующие РНК (lincRNAs) и составляют основной класс lncRNAs в геноме [13]. Третья группа - lncRNAs, транскрибируемые c интронов генов, кодирующих белки, или из промоторных областей (ilncRNAs). Существует подкласс интронных lncRNA, называемых snoRNAs. Этот подкласс не имеет типичной структуры других lncRNAs и имеет исключительно ядерное расположение [14]. Четвертая группа - lncRNAs, происходящие из промоторных областей, расположенных внутри активных промоторов, которые транскрибируются (eRNAs) [15,16]. Пятая группа - циркулярные lncRNA (circRNA), которые могут образовываться в процессе альтернативного сплайсинга белок-кодирующих генов [17]. Наконец, существует еще один класс lncRNAs, которые содержат микроРНК в своих генетических структурах, примером чего является H19, первый экзон которой кодирует miR-675 [18].

Проект Cancer Genome Atlas Consortium и другие крупномасштабные проекты секвенирования, направленные на характеристику раковых геномов, а также возможных эпигенетических и генетических нарушений, которые их конфигурируют, обеспечили точную молекулярную характеристику приблизительно 11 000 первичных раков, обнаружив значительную часть неописанных соматических аномалий (например, точечные мутации, генетические перестройки и изменения числа копий) [19-22]. Khuruna et al. (2013) сообщили, что 99% соматических SNV в различных карциномах возникают в не-кодирующих областях (ncRNAs, псевдо-генах и сайтах связывания транскрипционных факторов) [23]. Более того, исследование, основанное на данных TCGA и данных экспрессии lncRNA из TANRIC, показывает, что частота мутаций в lncRNA, на экспрессию которых влияют соматические изменения (MutLncs), низка, и что в некоторой степени их изменение, как правило, специфично для типа заболевания [24].

Интересно, что многочисленные исследования выявили ранее неизвестную роль lncRNAs как условных и конститутивных онкогенов или генов-супрессоров опухолей благодаря их способности регулировать все характеристики рака, такие как аберрантная пролиферация, клеточная инвазия, измененный липидный метаболизм, метастазирование и избегание иммунитета. Более того, регуляция, осуществляемая lncRNAs, может происходить как на транскрипционном уровне - эпигенетическом и генетическом, так и на пост-транскрипционном [25-30]. Эти данные, и особенно специфическая для рака экспрессия большинства из них, указали на lncRNAs как на возможные биомаркеры или терапевтические мишени.

Ядерное распределение lncRNAs и их взаимодействие с несколькими ядерными элементами, такими как факторы транскрипции, комплексы ремоделирования хроматина или даже с ДНК, образующей комплекс ДНК-РНК, выявили их важность в регуляции транскрипции генов и их эпигенетического ландшафта [31-33]. Большинство типов рака требуют многочисленных изменений в гомеостазе ядерной транскрипции, чтобы выйти из-под контроля клеточных систем управления. Эти изменения приводят к повышению и понижению регуляции множества генов, онкогенов и генов-супрессоров опухоли с помощью различных механизмов, приводящих к инициации, прогрессии и метастазированию опухоли [34]. В соответствии с этим, многие исследования указывают на то, что lncRNAs являются основными модуляторами ядерной транскрипции, изменяя как транскрипционный, так и эпигенетический клеточный контекст, ответственный за усиление или подавление туморогенеза (Рисунок 1).



Figure 1. MRepresentative scheme of the main human carcinomas and related lncRNAs. Note that the red lncRNAs act as oncogenes, while the green lncRNAs act as tumor suppressor genes.

Эпигенетика, лежащая в основе рака, широко изучается, учитывая ее ключевую роль в инициации, прогрессировании и метастазировании большинства типов рака, а также ее потенциал в качестве мишени для различных генотерапий [35-37]. Эпигенетику можно определить как набор модификаций, которые изменяют структуру или состояние хроматина, дифференциально регулируя экспрессию генов без изменений в последовательности ДНК [38]. Эпигенетические изменения могут быть включены в две основные группы. Первая - это модификации в ДНК, в основном происходящие путем добавления метильных групп на 5 конце определенных цитозинов, расположенных в так называемых островках CpG, где длинные участки динуклеотидов CG являются промоторными областями генома, обеспечивающими высокую, точную и интенсивную регуляцию генов [39]. Метилирование цитозинов препятствует связыванию факторов транскрипции с промоторными областями, что приводит к репрессии генов. Интересно, что многие виды рака демонстрируют специфический паттерн гиперметилированных CpG-островков в промоторах нескольких генов-супрессоров опухолей, подавляя их экспрессию и приводя к увеличению различных субпопуляций раковых клеток и, таким образом, усилению развития опухоли [40-42]. Вторая группа - это модификации в хвосте гистонов, вызванные метилированием, ацетилированием или фосфорилированием определенных лизинов, расположенных в N-концевой области гистонов 3', изменяющие заряд нуклеосом, влияющие на состояние хроматина и тем самым позволяющие или препятствующие рекрутированию в него транскрипционных ко-активаторов [43]. Эти модификации осуществляются комплексами ремоделирования хроматина, которые добавляют открытые или закрытые метки к геному, делая его доступным для транскрипции [44]. В отличие от гиперметилирования островков CpG, при многих видах рака наблюдается гипометилирование генома, что приводит к эктопической активации специфических онкогенов, экспрессия которых подавлена в гомеостатических условиях. Эктопическая активация этих онкогенов необходима для того, чтобы клетка приобрела онкогенный фенотип и вышла из-под контроля клеточных систем управления [45,46]. Точно так же некоторые из этих комплексов ремоделирования хроматина проявляют повышенную или пониженную активность в злокачественных клетках, что приводит к дисрегуляции хроматиновой структуры, способствуя экспрессии генов, усиливающих развитие опухоли [47-49].

Появившиеся исследования о роли lncRNAs в канцерогенезе указывают на них как на сложные регуляторы в эпигенетике рака. Как следствие, многие сообщения о связанных с раком lncRNA были описаны как ключевые модуляторы эпигенетического ландшафта путем взаимодействия с хроматином на четырех уровнях, которые описаны ниже: (1) lncRNAs как модуляторы метилирования гистонов; (2) lncRNAs как модуляторы ацетилирования гистонов; (3) lncRNAs как модуляторы метилирования ДНК; (4) lncRNAs как пост-транскрипционные регуляторы эпигенетического аппарата и (5) (Рисунок 2).



Figure 2. Epigenetic mechanism involved in carcinogenesis. (A) Histone methylation exerted by HOTAIR-PRC2 complex to repress expression of several genes such as Hoxd10, PGR, PCDH, or Jam2 with a protective role against metastasis in breast cancer cell line. (B) TCF21 promoter demethylation exerted by TARID1-GADD45A, which positively modulates expression of the TCF21 gene, a protective factor against head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC). (C) Ubiquitination of EZH2, a subunit of PRC2, by ANCR reducing negative marks at Hoxd10 or E-Cadherin genes, exerting a protective role against EMT and metastasis in breast cancer cell line. (D) Required binding SPKQ-Neat1 for the formation of paraspeckles. Downregulation of Neat1 is translated in the high availability of SPKQ and therein the upregulation of apoptosis genes such as BLC2 or BAX.

Взаимодействие между комплексом ремоделирования хроматина PRC2 и HOTAIR стало первым зарегистрированным примером lncRNA, вовлеченной в эпигенетическую регуляцию хроматина [50]. При раке молочной железы HOTAIR необходима для привлечения PRC2 к своим геномным мишеням, что требуется для установления репрессорных меток H3K27me3 в определенных генах-супрессорах опухоли, играющих ключевую роль в подавлении метастазирования, таких как Hoxd10, PGR (рецептор прогестерона), PCDH (протокадхерин 10) или Jam2 (молекула функциональной адгезии). Более того, потери функции HOTAIR достаточно для предотвращения инвазии и метастазирования клеток при раке молочной железы, что отражает роль этой lncRNA как мощного онкогена и указывает на нее как на возможную терапевтическую мишень [51].

Субъединицы PRC2 могут взаимодействовать с различными ядерными белками или транскрипционными факторами, образуя белковые комплексы, которые устанавливают эпигенетические метки на своих геномных мишенях [52]. Tug1, активируемая lncRNA в различных глиомах, действует как молекула-каркас, необходимая для взаимодействия PRC2 с YPP1, фактором транскрипции нейронов. Такой новый комплекс может увеличить экспрессию различных генов, участвующих в дифференцировке нейронов, таких как BDNF, NGF или NFT3, поддерживая плюрипотентность злокачественных клеток и тем самым увеличивая агрессивность глиомы. Интересно, что экспрессия Tug1 обнаруживается и в цитоплазме, где он действует как губка для miR-142, защищая SOX2 и MYC от деградации [53].

Поддержание эпигенетических меток, индуцируемых PRC2, требует участия другого комплекса: PRC1 [54]. ANRIL, длинная не-кодирующая РНК, расположенная в генетической пустыне с высокой распространенностью SNPs [55-57] (на сегодняшний день многие из этих SNPs связаны с более высокой распространенностью рака), взаимодействует как с PRC1 через субъединицу CBX7, так и с PRC2 через субъединицу SUZ12 для подавления экспрессии локуса CDKN2A/B и, таким образом, поддержания его молчания. Этот локус подавляется при многих видах рака, таких как лейкемия, рак молочной железы, рак поджелудочной железы, рак яичников и глиомы [58-62]. Репрессия локуса CDNK2A/B под действием ANRIL увеличивает клеточную пролиферацию злокачественных клеток, способствуя прогрессии и метастазированию. Напротив, истощение ANRIL снижает клеточную пролиферацию и изменяет баланс в сторону гибели клеток, тем самым снижая риск метастазирования, что указывает на ANRIL как на мощную терапевтическую мишень, особенно при лейкемии и раке простаты, где он повышен [63,64].

HOTTIP представляет собой еще один пример lncRNA, повышающейся в нескольких типах рака, таких как гепатоцеллюлярная карцинома, рак желудка, колоректальный рак, рак поджелудочной железы, рак легких, рак простаты и остеосаркома [65,-71]. HOTTIP взаимодействует с WDR5, индуцируя раскрытие хромосом через комплекс WDR5/MTT. Этот комплекс повышает экспрессию локуса HOXA через метки H3K4me3. В свою очередь, гены локуса HOXA репрессируют экспрессию нескольких генов-супрессоров опухоли. Кроме того, обнаружение HOTTIP в образцах экзосом пациентов было признано возможным маркером прогноза при колоректальном раке [72].

В отличие от описанных выше lncRNAs, MEG3 представляет собой межгенетическую lncRNA, связанную с репрессивными метками хроматина, которая действует как мощный ген-супрессор опухоли. MEG3 физически взаимодействует с субъединицей EZH2 комплекса PRC2 для репрессии экспрессии нескольких генов, вовлеченных в передачу сигналов TFG-β (например, SMAD2 или TGFBR1), что повышает агрессивность рака, способствуя инвазии и метастазированию. Эта репрессия опосредована образованием триплексного комплекса ДНК-РНК в GA-богатых областях промоторов генов, находящихся в состоянии покоя [73].

На сегодняшний день описано немного случаев участия lncRNAs в ацетилировании гистонов. Wan et al. (2013) описали ключевую роль lncRNA JADE на самых ранних этапах механизмов ответа на повреждение ДНК (DDR) путем модуляции механизма ацетилирования. Как показывают фундаментальные и доклинические исследования, DDR является одним из основных противораковых барьеров в процессе опухолеобразования и находится под сложной и жесткой регуляцией, включая изменение паттернов ацетилирования многочисленных промоторов генов [74-76]. Клинические исследования, проведенные у больных раком молочной железы, показали повышенную экспрессию lncRNA JADE по сравнению с контролем. Механистически, lncRNA JADE необходима для правильной экспрессии JADE1, белка, необходимого для определения субстратной специфичности гистона H4 для HBO1, который в свою очередь опосредует ацетилирование гистона H3-H4 [77]. Некоторые виды рака демонстрируют повышенную регуляцию HBO1, положительно модулируя экспрессию генов, способствующих пролиферации и связанных с плохим прогнозом развития рака [78,79]. Истощение lncRNA JADE сказывается на снижении роста рака молочной железы in vivo, а также в клетках с дефицитом HBO1, что предполагает потенциальный эффект в качестве индукторов пролиферации злокачественных клеток [74].

Другой случай ацетилирования гистонов, опосредованного lncRNA, был зарегистрирован для lncPRESS1, который играет ключевую роль в переключении плюрипотентного или дифференцированного состояния эмбриональных стволовых клеток (ESCs), действуя как молекула-приманка SIRT6. LncPRESS1 конкурирует с SIRT6 за свои геномные мишени, избегая деацетилирования этим ферментом и, таким образом, активной экспрессии генов, необходимой для обеспечения клеточной дифференцировки [80].

Модели аберрантного метилирования промоторов lncRNA были описаны при многих видах рака, что указывает на их важность в эпигенетическом контроле канцерогенеза [81]. Однако лишь некоторые случаи вовлечения lncRNA в метилирование ДНК были глубоко изучены, и их функции еще не до конца выяснены. TARID1 - межгенная lncRNA, промоторная область которой расположена в пределах третьего CpG-островка промотора TFC21, известного гена-супрессора опухоли. TARID1 связывает GADD45A, белок репарации ДНК, который способствует активному деметилированию в многочисленных промоторах. Комплекс TARID1-GADD45A направляет его вместе с TDG, белком, необходимым для взаимодействия GADD45A с его геномными мишенями, к промотору TFC21, где он устраняет метилирование и обеспечивает экспрессию TFC21, который, в свою очередь, играет ключевую роль в защите от плоскоклеточной карциномы головы и шеи (HNSCC). Интересно, что TARID1 образует R-петлю с промотором TCF21, которая распознается GADD45A как область, помеченная для деметилирования [82,83].

Merry et al. (2015) обнаружили 148 lncRNAs, связанных с DNMT1 в клетках рака толстой кишки с помощью RIP-seq. Среди них была выделена одна lncRNA, названная DNMT1-ассоциированной репрессированной lncRNA 1 (DACOR1), которая высоко и специфически экспрессируется в нормальной ткани толстой кишки, но репрессируется в клеточных линиях рака толстой кишки. Более того, избыточная экспрессия DACOR1 в клетках рака толстой кишки привела к усилению метилирования ДНК во многих локусах без изменения уровня экспрессии DNMT1. Интересно, что DNTM1 является важным репрессором опухолевого генеза [84]. Анализ ChIRP-seq показал, что DACOR1 занимает в общей сложности 338 геномных локусов, из которых 161 пик находятся вблизи 150 аннотированных генов. Примечательно, что 31 из этих участков перекрывается с дифференциально метилированными регионами, ранее обнаруженными в образцах рака толстой кишки по отношению к нормальным тканям. Эти данные свидетельствуют о том, что DACOR1, взаимодействуя с хроматином и DNMT1, направляет белковый комплекс DNMT1 на точные геномные локусы. Кроме того, было обнаружено, что DACOR1 подавляет экспрессию цистатионин β-синтазы (CBS) и, в свою очередь, увеличивает количество метионина, который является субстратом для производства S-аденозилметионина (SAM). SAM является необходимым донором метила для метилирования ДНК в клетках млекопитающих. Таким образом, DACOR1 может также влиять на метилирование ДНК, регулируя уровень SAM в клетках [85,86].

Взаимодействие между lncRNAs и соответствующим эпигенетическим белковым ландшафтом не ограничивается функциями рекрутирования, строительных лесов или активных элементов, необходимых для ремоделирования хроматина. Более того, lncRNAs были зарегистрированы как ключевые игроки в модуляции стабильности белкового комплекса хроматина, способствуя деградации белков, выполняя протективную роль в большинстве случаев для запуска про-онкогенных эпигенетических меток или ингибирования деградации белков, действуя как онкогены. Например, ANCR способен напрямую связываться с субъединицей EZH2, способствуя ее деградации. Связывание ANCR-EZH2 необходимо для CDK1, чтобы нацелить EZH2 на убиквитин-протеасомную деградацию через фосфорилирование Thr-345 и Thr-487 в клетках рака молочной железы. Любопытно, что при раке молочной железы экспрессия ANCR неактивна, что приводит к гиперактивности EZH2, который, в свою очередь, устанавливает несколько репрессивных меток в генах-супрессорах опухоли, таких как Hoxa10 или E-Cadherin, которые участвуют в прогрессии и передаче сигналов для EMT [87]. Следует отметить, что модуляция ANCR была исследована и в других карциномах [88,89].

Деградация EZH2 модулируется не только ANCR. MEG3 способствует убиквитинированию EZH2, что приводит к повышению уровня LATS2, опухолевой киназы-супрессора, которая подавляет пролиферацию клеток и метастазирование через сигнальный путь Hippo в нескольких типах рака [90]. При раке желчного пузыря также наблюдается подавление MEG3, сопровождаемое подавлением LAST2, что приводит к увеличению пролиферации клеток и метастазированию [91].

В отличие от ANCR или MEG3, LUCAT1 считается онкогеном, поскольку защищает деградацию белка DNMT1 в плоскоклеточной карциноме пищевода. Истощение экспрессии LUCAT1 коррелирует со снижением уровня экспрессии DNMT1 и повышением уровня UHRF1, белка, участвующего в убиквитинировании и, следовательно, деградации DNTM1 [92].

Ядерный компартмент не только содержит хроматин в его различных фазах и ядрышко, но и различные структуры преимущественно неправильной формы, известные как ядерные тельца [93]. Эти структуры играют ключевую роль в транскрипционной регуляции нескольких путей, связанных с различными клеточными процессами, такими как дифференцировка, пролиферация, поддержание гомеостаза и, следовательно, развитие заболеваний [94-97]. Во многих докладах подчеркивается роль этих структур в патогенезе рака, вовлекая их в основную транскрипционную регуляцию опухолеобразования [98-100]. Наряду с различными ядерными тельцами, paraspeckles, субструктуры, расположенные на периферии ядра, были впервые обнаружены в 2002 году [101] и оказались ключевыми регуляторами модуляции ядерной функции. Во-первых, они распределяют белки ядра и доступны для взаимодействия с хроматином или транскрипционным механизмом [102]. Во-вторых, они удерживают мРНК, избегая их переноса в цитоплазму и, таким образом, трансляции. Интересно, что мРНК, удерживаемые параспекулами, позже экспортируются в цитоплазму, что значительно увеличивает количество молекул мРНК и их трансляцию. Однако основные биологические процессы, определяющие временной интервал экспорта, изучены плохо [103,104]. Наконец, в-третьих, они секвестрируют белки, связанные с биогенезом и преобразованием миРНК [105]. Для образования параспекул необходимо присутствие NEAT1, или транскрипта 1 сборки ядерных параспекул длинных не-кодирующих РНК [106,107]. NEAT1 транскрибируется в двух изоформах - Neat1.1 и Neat1.2 - демонстрируя различный процессинг РНК, что приводит к образованию двух различных транскриптов как по длине, так и по структурным мотивам. В то время как первая изоформа не участвует в биогенезе параспекул [108], вторая изоформа отвечает за сборку параспекул, являясь лимитирующим фактором для формирования этих ядерных тел и тем самым определяя тенденцию ядра к их формированию [109]. Zeng et al. (2018) сообщили о ключевом значении Neat1.2 и его параспекул как промоторов агрессивности хронического миелоидного лейкоза (ХМЛ). SPKQ, бивалентный белок, который может действовать как фактор сплайсинга, необходимый для формирования параспекул, или как транскрипционный фактор, оказывающий влияние на активацию апоптотических белков, таких как BLC2, BBC3 или BAX, связан с Neat1.2 через С-мотив. Связывание Neat1.2-SPKQ уменьшает доступность этого белка для действия в качестве транскрипционного фактора, тем самым снижая экспрессию факторов апоптоза BLC2, BBC3 и BAX и заставляя клетку избегать апоптоза, тем самым усиливая рост и пролиферацию CML. Любопытно, что экспрессия Neat1.2 снижается под действием c-Myc, известного репрессора прогрессии ХМЛ. Репрессия Neat1.2, опосредованная c-Myc, уменьшает образование параспекул и приводит к связыванию SPKQ с промоторами апоптотических генов, упомянутых выше, активируя их экспрессию и, следовательно, способствуя апоптозу и достижению лучшего прогноза [102].

Трехмерная архитектура генома необходима для регуляции транскрипции генов. РНК-полимеразам необходим контакт с промоторными областями генов для транскрипции [110]. Контакт между дистальными областями генома облегчается факторами транскрипции и активными областями энхансеров, которые создают хромосомные петли. Изменение трехмерной структуры хроматина позволяет РНК-полимеразам распознавать дистальные промоторные области и инициировать синтез различных транскриптов [111]. Активные энхансеры незаменимы для одновременного руководства транскрипцией генов, расположенных в геноме далеко друг от друга [112-114]. В гомеостатических условиях активные энхансеры контролируют поддержание различных типов клеток. Однако во многих видах рака человека они разрегулированы. Наряду с ними, lncRNA, полученные в результате транскрипции активных энхансеров, дифференциально экспрессируются в раковых тканях и действуют как онкогены, способствуя транскрипционной активации онкогенных путей и даже вызывая хромосомные перестройки и геномную нестабильность [115-118].

Регуляторное влияние связанных с энхансером lncRNAs было выяснено, особенно при Т-клеточном остром лимфобластном лейкозе человека (T-ALL). Лейкемией индуцированная не-кодирующая активаторная РНК-1 (LUNAR1) была распознана в интегрированном транскриптомном профиле пациентов с T-ALL как специфическая lncRNA, вовлеченная в рост клеток как in vitro, так и in vivo на ранних стадиях. Активность LUNAR1 повышается под действием комплекса активаторов Notch1/Rbp-jk, который играет ключевую роль в инициации канцерогенеза T-ALL [119,120]. Экспрессия LUNAR1 необходима для повышения уровня мРНК IGF1R и поддержания передачи сигналов IGF1, необходимой для стимулирования роста опухоли. Истощение LUNAR1 приводит к подавлению IGF1R и снижению связывания комплекса Mediator и RNA Pol II с энхансером и промотором IGF1R [119].

Недавно Tan et al. (2019) описали ARIEL, связанную с ARID5B длинную не-кодирующую РНК, индуцирующую энхансер, - еще один пример eRNA, вовлеченной в патогенез T-ALL. Экспрессия ARIEL связана с энхансерной активностью ARID5B и необходима для рекрутирования комплекса Mediator к промотору ARID5B и, таким образом, повышения экспрессии этого транскрипционного фактора. ARID5B необходим для активации TAL1-индуцированной транскрипционной программы и онкогена MYC [121]. Любопытно, что TAL1 положительно модулирует экспрессию ARIEL, демонстрируя систему регуляции с обратной связью. В то время как нокдаун ARIEL в клетках приводит к ингибированию роста, мутанты мышиной модели ARIEL демонстрируют блок прогрессирования заболевания, что отражает важность этой lncRNA в патогенезе T-ALL и указывает на возможную превентивную терапевтическую мишень [122].

Пост-транскрипционная регуляция генов включает модуляцию мРНК, способствуя или подавляя их стабильность, взаимодействие с рибосомальным механизмом, облегчающим или блокирующим процесс трансляции белка, и, наконец, влияние на альтернативный сплайсинг для создания различных транскриптов. Хотя эпигенетическая и генетическая регуляция исторически считались стержневой осью развития большинства карцином, появляющиеся данные показывают, что пост-транскрипционная регуляция ряда генов, вовлеченных в раковые заболевания, также играет ключевую роль [123,124].

Функциональная сложность lncRNAs, наряду с их динамичной клеточной локализацией, позволяет им осуществлять пост-транскрипционную регуляцию генов на различных уровнях как в цитоплазме, так и в ядре [125,126] следующим образом: (1) конкурировать, связываясь с микроРНК и действуя таким образом как губка, которая в конечном итоге препятствует запуску их мишеней; (2) стимулировать или ингибировать трансляцию мРНК; (3) взаимодействовать с рибосомным механизмом, модулируя биогенез, транслокацию и связывание рибосомных субъединиц; и (4) вмешиваться в процесс сплайсинга через модуляцию различных белков сплайcесом [127,128] (Рисунок 3).



Figure 3. Main regulatory mechanisms of lncRNAs at the post-transcriptional level. (A) Competing sponge lncRNAs act to form an lncRNA-miRNA complex, avoiding the degradation of 3?UTR target genes, therein repressing the translation of them. (B) lncRNAs binding mRNA targets and avoiding the ribosome-initiated translation process. In sharp contrast, the mRNA-lncRNA complex attenuates the binding of repressed protein translation. (C) lncRNAs can act as positive modulators of rRNA synthesis, increasing the ribosome pool necessary for the increased protein demand in cancer cells. (D) lncRNAs can modulate the splicing process, leading to transcription of different isoforms that exert pivotal roles in several carcinomas.

Многие lncRNAs, расположенные в цитоплазме, выступают в качестве главных регуляторов пост-транскрипционной модуляции генов, конкурируя с 3'UTR кодирующей РНК белка и таким образом связываясь с микроРНК [129,130]. Механистически, конкурирующие эндогенные особенности заключаются в сходстве между последовательностью определенной lncRNA и 3'UTR областью мРНК, содержащей повторяющиеся сайты связывания для определенной микроРНК. Комплекс связывания lncRNA-микроРНК предотвращает ее загрузку в комплекс AGO2/RISC, и поэтому микроРНК не способна физически взаимодействовать со своими мРНК-мишенями.

Phosphatase and tension homolog pseudogene 1 (PTENP1) был первым примером ceRNA, вовлеченной в канцерогенез [131]. PTENP1 имеет высокую гомологию с геном PTEN, сохраняя при этом сайты связывания последовательностей для различных микроРНК, которые распознают область 3 UTR PTEN (miR20a, miR19b, miR21, miR26a и miR214). Экспрессия обоих генов снижена в различных карциномах, хотя экспрессия PTENP1 не зависит от PTEN. Нокдаун обоих генов приводит к ускорению роста, в то время как активация PTENP1 достаточна для подавления роста при раке простаты. На сегодняшний день во многих отчетах отмечается, что ингибирующая роль генов PTENP1-PTEN не ограничивается раком простаты, а распространяется на несколько видов рака, таких как колоректальный рак, рак молочной железы или плоскоклеточная карцинома полости рта [132-134]. Таким образом, PTENP1 считается главным геном-супрессором опухолей, что подтверждается сохранением функциональности между различными видами рака.

В резком контрасте, HULC представляет собой пример онкогенной губчатой длинной некодирующей РНК, вовлеченной в нескольких карциномах, способствуя опухолевому ангиогенезу при раке печени и аберрантной клеточной пролиферации при лейкемии, а также нарушая липидный обмен при раке гепатомы [135-139]. Например, секвестрирование miR-107 с помощью HULC при раке печени необходимо для продвижения ангиогенеза и повышения агрессивности злокачественных клеток. miR-107, нацеленный на мРНК E2F1, важнейший защитный фактор, способствует ангиогенезу путем ингибирования SPHK1, специфической киназы, активируемой при раке печени [140]. HULC - не единственный пример lncRNA, способной распознавать и связываться с miR107. Neat1, обладающий ядерными функциями, которые были описаны выше, также играет ключевую роль в качестве онкогена как в плоскоклеточном раке гортани, так и в глиоме, связывая miR107 и репрессируя путь miR107/Cdk6, который играет защитную роль в индуцировании апоптоза и остановки клеточного цикла в фазе G1 [141,142]. Более того, большое подмножество миРНК распознается и нацеливается с помощью Neat1 (который во всех представленных случаях действовал как мощный онкоген) в нескольких опухолях, такие как miR-214 в эндометрии и карциноме щитовидной железы [143,144], miR-101, miR-218 и mR-211 в раке молочной железы или miR-506 в карциноме поджелудочной железы [145-148]. Таким образом, связывание Neat1 с губчатыми миРНК приводит к стимулированию роста опухолевых клеток, их пролиферации, миграции, инвазии, метастазированию и поддержанию фенотипа, подобного стволовым клеткам.

Многие lncRNA модулируют экспрессию мРНК, способствуя или подавляя трансляцию специфических мишеней мРНК, которые взаимодействуют с ними напрямую. Анализ транскриптома клеток карциномы шейки матки человека (HeLa) прояснил пост-транскрипционную роль lncRNA-p21, которая находится в цитоплазме в тесной связи с рибосомами. lncRNA-p21 взаимодействует с мРНК двух апоптотических клеточно-защитных белков - CTNNB1 и JUNB - оба из которых активируются геном HuR [149-151]. Интересно, что экспрессия lncRNA-p21 подавляется HuR, известным индуктором клеточной миграции и опухолевой агрессивности в клетках HeLa [152,153]. Комплекс РНК-РНК, образованный мРНК lncRNA-p21 и участками CTNNB1 и JUNB 3'UTR, вызывает ассоциацию этих мРНК с трансляционными репрессорами RCK и FMRP, что приводит к ослаблению их трансляции [151,153].

Немногие lncRNA были описаны как модуляторы биогенеза белка на уровне рибосомы, влияющие на биогенез, транслокацию или формирование рибосомных субъединиц. SLERT - яркий пример lncRNA, участвующей в регуляции биогенеза рибосомы. SLERT (Sno-RNA-terminated lncRNA enhances pre-ribosomal RNA transcription) действует как онкоген в нескольких линиях раковых клеток человека, который положительно модулирует транскрипцию пре-рРНК [154]. Развитие опухоли требует повышенного биогенеза белка и, следовательно, повышенного биогенеза рибосом для удовлетворения потребности в синтезе белка de novo клеток карциномы [155]. Механически SLERT взаимодействует непосредственно с DEAD-box РНК-геликазой DDX21 и не дает ей покрывать полимеразу I, тем самым снижая транскрипцию рибосомных РНК. Более того, связывание SLERT и DDX21 позволяет РНК-полимеразе I транскрибировать пре-рРНК. В соответствии с этим, ингибирование SLERT снижает опухолеродный потенциал как in vitro, так и in vivo, что свидетельствует о положительной роли этой lncRNA в канцерогенезе [154,156].

Альтернативный сплайсинг - это сложная регуляторная система, которая позволяет генерировать различные транскрипты РНК из одного и того же гена. Модуляция альтернативного сплайсинга молекулами lncRNA до сих пор неясна, но о некоторых случаях уже сообщалось. ZEB2-NAT был впервые описан как анти-смысловой транскрипт ZEB2, ключевого гена, участвующего в уменьшении EMT путем репрессии E-Cadherin [157]. Любопытно, что ZEB2 имеет последовательность IRES, содержащую интрон, расположенный выше по течению между первым и вторым экзонами. Последовательность IRES играет важную роль в рекрутировании рибосом, факторов инициации и РНК-связывающих белков. Для репрессии Е-кадхерина с помощью ZEB2 требуется такая IRES-последовательность. Сохранение последовательности IRES в зрелой мРНК ZEB2 опосредовано активностью ZEB2-NAT, который взаимодействует непосредственно с последовательностью IRES и избегает сплайсинга. Подавление E-Cadherin под действием ZEB2-NAT указывает на него как на возможный онкоген, поскольку он способствует поддержанию и метастазированию нескольких карцином человека [158].

Терагностика является точкой соприкосновения терапии и диагностики и описывает систему индивидуализации здравоохранения с использованием молекулярно-генетических инструментов для принятия решений о лечении с учетом индивидуальных особенностей пациента [159]. Появившиеся функции многих lncRNAs как онкогенов в некоторых карциномах, способствующих различным этапам канцерогенеза, таким как выход из-под контроля клеточных систем, клеточная пролиферация и миграция, аберрантный и усиленный метаболизм, нарушенный и дерегулированный эпигенетический ландшафт и метастазирование, указывают на lncRNAs как на потенциальные терапевтические мишени в разрушении опухолевого генеза [160,161]. Важность lncRNA в каждом из этих процессов привела к разработке различных стратегий и молекул, позволяющих подавлять функцию или экспрессию lncRNA, поскольку в большинстве описанных примеров блокирование функции lncRNA приводило к подавлению агрессивности рака и снижению нескольких процессов, способствующих канцерогенезу [162]. Таким образом, lncRNA являются идеальной терагностикой для разработки персонализированных лекарств, основанных на молекулярных особенностях каждой опухоли. В настоящее время против lncRNAs с прямой или косвенной онкогенной функцией разработано несколько стратегий воздействия путем модуляции на (1) геномном уровне, подавляя уровень экспрессии lncRNAs или онкогенов-мишеней путем делеции гена, и (2) пост-транскрипционном уровне РНК, влияя на стабильность молекул lncRNAs и вызывая их деградацию.

Сложная геномная архитектура lncRNAs, наряду с ограниченными знаниями о биологии их промоторов и лежащего в их основе транскрипционного контекста, ограничивает использование CRISPR-системы типа II, классической и базовой системы на основе CRISPR, которая в течение короткого времени была широко распространена в анализах генетического редактирования. Любопытно, что Goyal et al. (2017) определили, что около 62% всех lncRNA могут быть классифицированы как "не-CRISPable" из-за присутствия внутренних или двунаправленных промоторов в их последовательности [163]. Более того, во многих случаях двунаправленные промоторные lncRNA связаны с транскрипцией соседних генов и их правильной экспрессией. В настоящее время для нокдауна экспрессии lncRNAs было проведено несколько модификаций системы CRISPR, включая систему двойного нокаута CRISPR (DECKO) и тандем систем интерференции CRISPR (CRISPRi) и "dead"-Cas9 (dCas9) [164-166]. Эффективность обеих систем в понижении уровня экспрессии lncRNAs была исследована для более чем 500 lncRNAs, вовлеченных в раковые заболевания [167-69].

Анти-смысловые олигонуклеотиды (ASOs) - это одноцепочечные анти-смысловые олигонуклеотиды, содержащие центральный участок дезоксирибонуклеотидов, фланкированный с обеих сторон нуклеотидами РНК. Участок ДНК часто фосфоротиоатируется для повышения ядерной стабильности ASOs, а в нуклеотиды добавляются химические модификации для повышения эффективности и содействия ядерной транслокации. В ядре ДНК, содержащаяся в последовательности ASO, распознает небольшой фрагмент комплементарного гетеродуплекса ДНК-РНК lncRNA, который затем расщепляется ядерной эндогенной РНКазой H1, вызывая деградацию и, таким образом, снижение экспрессии lncRNA [170,171]. ASOs широко используются для подавления экспрессии ядерных lncRNAs или цитоплазматических lncRNAs, которые выполняют свои функции на ядерном уровне [172-175]. Различные модификации базовой последовательности ASO позволили получить дополнительные типы репрессивных молекул с различными характеристиками, среди которых важно выделить LNA GapmeRs, antagoNATs и mixmers. Прежде всего, они очень похожи на ASOs, за исключением добавления LNA к фланкирующему плечу для улучшения сродства связывания и устойчивости к нуклеазе [176]. LNA GapmeRs функционируют как эффективные регуляторы, нацеленные на эпигенетические модификации in vivo для терапевтического применения, как было продемонстрировано [177]. AntagoNATs - это короткие одноцепочечные олигонуклеотиды, которые демонстрируют высокую гомологию со специфическими анти-смысловыми lncRNA. Комплекс, образованный AntagoNATs и lncRNA, позволяет избежать распознавания последних в качестве мишени. Modarresi et al. (2012) добились подавления BDNF-AS1, используя специфический AntagoNAT с заменой LNA на каждом конце и фосфоротиоат-модифицированной основой. Репрессия BDNF-AS1 повышает экспрессию BNDF и активирует мозговой нейротрофический фактор, который является защитным модулятором в некоторых глиомах. В отличие от LNA GapmeRs и AntagoNATs, репрессия, осуществляемая миксмерами, не опосредуется РНКазой H1 [178].

Малые интерферирующие РНК (siRNAs) - это короткие двухцепочечные РНК, которые, попадая в клетку, расщепляются до одноцепочечной РНК, способной создать пару оснований, комплементарную интересующей lncRNAs. Базовая пара РНК-lncRNAs распознается комплексом РНК-индуцированного сайленсинга (RISC), который следует за ее Argonautic деградацией [179]. Многие типы siRNA были опробованы для лечении рака путем подавления lncRNA в попытке достичь лучшего нокдауна экспрессии. Хотя в нескольких отчетах приводится пример подавления связанных с раком lncRNAs с помощью классических siRNA, это представляет собой временное ограничение, поскольку эффект лечения исчезает через 24-72 часа, в зависимости от клеточной экспрессии и расположения lncRNAs. Например, Prensner et al. (2013) снизили клеточную пролиферацию и инвазивность нескольких клеточных линий простаты с помощью различных siRNA против SChLAP1, известной связанной с простатой lncRNA, которая способствует развитию агрессивного рака простаты через ингибирование опухолеподавляющей активности комплекса SWItch/Sucrose Non-Fermentable (SWI/SNF) [180]. Более стабильной и эффективной формой siRNA является короткая шпилечная РНК (shRNA). Этот тип siRNA способен к интеграции в ДНК и состоит из двух комплементарных последовательностей РНК длиной 19-22 п.н., соединенных короткой петлей длиной 4-11 нт со шпилькой, имеющейся в миРНК. После транскрипции последовательность shRNA экспортируется в цитозоль, где распознается эндогенным ферментом Dicer и обрабатывается, образуя двухцепочечные дуплексы РНК [181]. shRNA широко используются для лечения как in vitro, так и in vivo. Например, Sun et al. (2016), используя вектор Malat-shRNA, были способны предотвратить метастазирование и инвазию in vitro и in vivo при раке шейки матки. Лечение вектором Malat-shRNA приводило к подавлению Malat1 и, соответственно, нижележащих мишеней, таких как β-катенин, Snail или виментин, маркеров EMT в раковых клетках [182]. Любопытно, что векторы shRNA могут не только содержать интересующую последовательность lncRNA, но также могут содержать последовательности, распознающие другие онкогенные факторы, создавая более одной shRNA в клетке и приводя к более эффективному снижению ракового фенотипа. Пример этого был представлен Zong et al. (2019) при лечении карциномы глиомы. В этом типе опухоли LMX1A активирует экспрессию NLRC5, стимулируя сигнальный путь Wnt/β-катенин, что способствует злокачественному перерождению клеток глиомы. Экспрессия LMX1A подавляется протектором miR-499, который распознает 3'UTR LMX1A и запускает деградацию его мРНК. Кроме того, в клетках глиомы наблюдается повышение уровня SCAMP1, губчатой lncRNA, которая связывается с miR-499, избегая репрессии LMX1A. Снижение уровня SCAMP1 приводит к снижению пролиферации, миграции и инвазии клеток и усилению апоптоза, что позволяет предположить, что секвестрирование miR-499 через SCAMP1 играет важную роль в патогенезе карциномы глиомы [183].

В настоящее время поиск малых молекул, способных связываться с lncRNAs и блокировать их действие, является основной целью при разработке эффективных и новаторских методов лечения ряда онкологических заболеваний. Исследуя данный тип подхода с целью выявления возможных блокирующих молекул функций онкогена Malat при раке молочной железы, Fardokht et al. (2019) провели стратегию микрочипов малых молекул, получив два различных лиганда, обладающих способностью специфически распознавать ENE-триплекс Malat1, что защищает его от деградации, приводя к накоплению высокого уровня транскриптов Malat1 в ядре. Введение лигандов приводит к снижению экспрессии Malat1 как в клеточных линиях рака молочной железы, так и к морфогенезу ветвления в модели опухоли молочной железы путем индукции структурных изменений. Любопытно, что структура одного лиганда похожа и на триплекс Neat1 ENE. Однако, несмотря на высокую степень гомологии, он не способен взаимодействовать с Neat1 или снижать уровень его экспрессии, показывая, что дизайн этих репрессорных лигандов специфичен для одной lncRNA [184].

Изучение транскриптома человека изменило наше представление об экспрессии и регуляции генов. lncRNA, участвующие в многочисленных клеточных регуляторных сетях, выявили их значение в гомеостазе, их последствия для рака и их революционное влияние на наше представление о болезни от ее происхождения до разработки новых терапевтических стратегий. Теоретически, влияние сетей lncRNA, модулирующих клеточный метаболизм при раке, может повлиять на регуляцию клеточного метаболизма и энергетического гомеостаза. Однако эти исследования все еще находятся в зачаточном состоянии и далеки от использования lncRNA в их реальном состоянии на клинической арене, а одной из самых больших проблем является идентификация последовательностей и структурных элементов, которые позволяют lncRNA выполнять свои клеточные функции. lncRNA являются перспективными молекулами для применения в терапии, особенно для регуляторных сетей раковых клеток, но одним из основных требований является лучшее понимание функций и механизмов lncRNA как в физиологических, так и в патологических условиях. Необходимо сосредоточить наши усилия на их функциональном изучении, и, следовательно, интенсивные исследования в паре с характеристикой lncRNA приведут к прогрессу в понимании кода lncRNA. Наконец, структурная и функциональная новизна lncRNAs предлагает перспективную противораковую терапию, которая может избежать возникновения лекарственной устойчивости, подобной той, которая наблюдается при использовании современных методов лечения. Дальнейшие исследования, направленные на лучшее понимание молекулярных механизмов действия lncRNAs в раке, открывают перспективы разработки более эффективных методов лечения рака.