Соматическая не-интегрированная ген-заместительная генотерапия может переносить копии нормально функционирующих генов (или кодирующую последовательность, кДНК) в нефункциональные клетки для компенсации, что позволяет использовать их для лечения моногенных заболеваний (4). После встраивания в соматические клетки чужеродные гены экспрессируются независимо от соматического генома. Таким образом, непреднамеренные генетические манипуляции в геноме, особенно в зародышевых клетках, должны быть безоговорочно предотвращены (5). Хотя замена соматического гена может увеличить долгосрочную выживаемость и фертильность жертвы, но такие генетические нарушения будут унаследованы следующим поколением через репродукцию, поэтому доля генных дефектов в общей популяции увеличивается (4).

Терапия редактирования соматических генов может необратимо изменить целевой ген мишень с помощью эндонуклеазы путем разрушения гена, удаления гена, вставки гена, замены гена и замены нуклеотидов (6). Его можно рассматривать как усовершенствованный вариант не-интегрированной ген-заместительной терапии, поскольку он позволяет избежать вставки ДНК и исключить образование ошибочных продуктов, вызывая мутацию генов in situ (7).

В 2017 году Комитет по редактированию генов человека: Scientific, Medical, and Ethical Considerations (учрежденный Национальной академией наук и Национальной академией медицины) опубликовал доклад под названием "Редактирование генома человека: Наука, этика и управление" (8). В докладе рекомендуется разрешить терапию путем редактирования соматического генома только в качестве лечения или профилактики заболеваний или инвалидности. На практике необходимо всесторонне учитывать технологию платформы, тип клеток, расположение целевого генома и другие факторы, чтобы взвесить риск и пользу. Кроме того, перед утверждением клинических испытаний необходимо провести открытые и всесторонние общественные обсуждения.

Терапия путем редактирования зародышевых генов может исправить патогенные мутации в гаметах или эмбрионах и в дальнейшем прервать наследование тяжелых генетических заболеваний (9). Риски соматического редактирования генов значительно превосходят его преимущества в лечении и долгосрочной эффективности. При редактировании зародышевых генов необходимо учитывать несколько рисков: (1) любая инсерционная/indel мутация в клетках зародышевой линии может вызвать непредсказуемые изменения в следующем поколении; (2) невозможно получить информированное согласие следующего поколения (10). Фактически, для большинства моногенных заболеваний assisted reproductive technology (ART), использующие экстракорпоральное оплодотворение (ЭКО) и pre-implantation genetic diagnosis (PGD), достаточно эффективны, чтобы избежать передачи болезни по наследству (11). Однако, когда оба родителя гомозиготны по рецессивному моногенному заболеванию или один родитель гомозиготен по доминантному моногенному заболеванию, наследуемость будет 100%, и редактирование генов зародышевой линии может быть единственным решением в данных обстоятельствах.

В 2020 году Международная комиссия по клиническому использованию редактирования зародышевого генома человека (созданная Национальной академией наук и Национальной академией медицины) опубликовала консенсус-отчет по исследованию под названием "Редактирование наследуемого генома человека", в котором были определены практические и всеобъемлющие рекомендации по клиническому применению Heritable Human Genome Editing (HHGE) (12). В отчете области клинического применения HHGE классифицированы по шести категориям (см. табл. 1). Согласно докладу, HHGE подходит для всех тяжелых моногенных заболеваний со 100% наследственностью и подмножества тяжелых моногенных заболеваний с 25-50% наследственностью. В докладе также рекомендовано, что для применения HHGE в клинической практике необходимо наличие подробного протокола, информированного согласия и долгосрочного мониторинга эффективности.

Table 1 Category of applications of HHGE and the recommendation from International Commission on the Clinical Use of Human Germline Genome Editing.

HHGE может эффективно предотвратить наследование моногенных заболеваний благодаря точному и эффективному редактированию генома. Однако доказательств применения HHGE при сложных полигенных заболеваниях пока недостаточно. В настоящее время ни один метод не может полностью контролировать восстановление ДНК после двухцепочечного разрыва (DSB), и ни один аналитический метод не может всесторонне оценить эффективность и нецелевые эффекты редактирования генов человека.

С точки зрения экономической выгоды, огромные затраты на производство, транспортировку, хранение, клиническое применение и пост-лечебный мониторинг генотерапии делают ее неподъемным бременем для медицинского страхования почти во всех странах. Другим ограничением является неясность патогенных генов и механизмов, вовлеченных в фенотипы. Например, в возникновении атеросклероза участвуют многочисленные пути и гены. В текущих экспериментах на животных тестировались модификации на нескольких мишенях, но идеальный ген-мишень пока не определен. В заключение следует отметить, что этическое ограничение генотерапии должно учитывать тяжесть заболевания, пользу для пациентов и все потенциальные риски.

Некоторые ученые утверждают о ненужности проверки методики CRISPR на животных, таких как мыши и приматы, из-за различий в экспрессии генов у людей и животных (13). Для HHGE прямые эксперименты на человеческих эмбрионах представляются необходимыми, учитывая различия в клеточных механизмах восстановления ДНК, а также в раннем эмбриональном развитии разных видов. Несмотря на то, что CRISPR/Cas9, как наиболее популярный метод редактирования генов, усовершенствовался по сравнению с предыдущими поколениями, недостатки низкой эффективности и низкой специфичности все еще остаются (7). Нежелательные эффекты вне мишени могут вызвать неизвестные фенотипические изменения (14). А постоянные нецелевые эффекты могут вызвать патогенное редактирование, токсичные вещества или рак клеток, что часто происходило в ранних экспериментах на животных.

ZFNs - это разновидность искусственно синтезированных рестрикционных эндонуклеаз. ДНК-связывающий домен цинкового пальца был слит с доменом расщепления ДНК ферментов рестрикции (15). Исследователи сконструировали ДНК-связывающие домены ZFNs так, чтобы они были нацелены на различные последовательности ДНК, что позволяет ZFNs связываться с целевыми последовательностями в сложных геномах и выполнять специфическое расщепление в домене расщепления ДНК (16).

Первоначально ZFNs были обнаружены в наблюдении Chandrasegaran над FokI (17). Это природный рестрикционный фермент типа IIS с областью узнавания и структурой расщепления. Специфичность области расщепления не наблюдалась, и сайт расщепления может быть перенаправлен путем замены исходной области узнавания (18, 19). Если взять в качестве примера цинковый пальчик Cys2His2, то его структура состоит из атома цинка, обернутого ~30 аминокислотами. ДНК-связывающий домен цинкового пальца обычно содержит три независимых повтора цинкового пальчика (ZF), и каждый ZF-повтор распознает три последовательных основания (рис. 1A) (20). В 1998 году Bitinaite и др. обнаружили, что домены расщепления ДНК должны функционировать в форме димера из-за слабой связывающей способности доменов расщепления с цепями ДНК (21). Последующие исследования показали, что при конструировании нуклеазы ZF следует проектировать две ZFN последовательности для соседних областей каждой цепи ДНК. Домен расщепления ДНК может быть расположен в точном положении двойной нити для достижения наилучшего эффекта расщепления. Между двумя ZFN существует спейсерная структура, называемая "спейсерной зоной". Длина этой структуры составляет 5~6 п.н., но обычно может работать и 7 п.н. Только разумный дизайн "спейсерной зоны" может обеспечить димеру ZFNs наилучшее рабочее пространство (22).



Figure 1 Four kinds of gene-editing technologies. (A) The DNA binding domain of the Zinc finger generally contains three independent Zinc finger (ZF) repeats, and each ZF repeat recognizes three consecutive bases. (B) TALENs comprise translocation activation domain (AD), DNA binding domain, nuclear localization signals (NLS), and nuclease domain. Every repeat in DNA binding domain corresponds to nucleotides in a one-to-one relationship. (C) CRISPR/Cas9 system functions through protein nucleic acid complex. The whole system incorporates crRNA, tracrRNA, and Cas9 protein. crRNA contains single guide RNA (20 nt) and PAM sequence (NGG). (D) rAPOBEC1 is a cytidine deaminase that deaminates cytosine to uracil and then the uracil will be replaced by thymine. Uracil DNA glycosylase inhibitor (UGI) could elevate editing efficiency by inhibiting reversing the U-G pair to the original C-G pair.

ZFNs считаются самой ранней технологией искусственного редактирования генома. После разработки и синтеза ZFNs в соответствии с последовательностью целевого гена, ДНК может быть точно разрезана с образованием DSB. Затем целевой ген деактивируется путем нарушения негомологичного соединения концов (NHEJ) или полностью восстанавливается путем гомологичной рекомбинации (HR) (23).

Основной недостаток ZFNs-опосредованного редактирования генов заключается в том, что для разрезания ДНК ZFNs требуется димеризация двух областей разрезания FokI, а для связывания ДНК требуется по крайней мере одна единица распознавания (24). Хотя домен узнавания ДНК обладает прочной способностью специфического узнавания, процесс разрезания ZFNs не полностью зависит от образования гетеродимера. Поэтому образование гомодимера, скорее всего, вызовет нецелевой эффект и в конечном итоге может привести к несоответствию ДНК и изменению последовательности, что приведет к цитотоксичности (25). Когда внецелевые эффекты накапливаются до определенного уровня и превышают порог способности клетки к самовосстановлению, происходит апоптоз клетки. С другой стороны, эта техника все еще ограничена существующими методами биологических исследований, поэтому трудно предсказать точность и последствия внутриклеточного воздействия. Если ZFNs вызывает мутации в нецелевых генах, то это может привести к ряду катастрофических последствий, особенно в применении к человеку. Кроме того, среди нескольких методов редактирования генов, ZFNs с большей вероятностью вызовет иммунный ответ in vivo. Учитывая существующие технические достоинства, невозможно предсказать, вызовет ли введенный белок ZFNs атаку иммунной системы. В настоящее время технология ZFNs может быть применена только для операций in vitro. Выделенные клетки редактируются in vitro, а затем вводятся обратно пациенту, в то время как прямое введение соответствующих элементов ZFNs в организм пациента для редактирования генов in vivo имеет более значительные потенциальные риски и более низкую эффективность (26).

TALENs были собраны из активатор-подобных эффекторов транскрипции (TALEs) и нуклеаз. TALEs были впервые обнаружены у Xanthomonas, патогена растений, и состоят из домена активации транслокации (AD), домена связывания ДНК, сигналов ядерной локализации (NLS) (рис. 1B). ДНК-связывающий домен определяет специфичность TALENs (27, 28). Нуклеазный домен TALENs относится к FokI. Аминокислотные повторы TALEs расположены в центральном положении ДНК-связывающего домена и обычно состоят из 34 аминокислот (29). Однако нередки варианты повторов с 33 или 35 аминокислотами, а последний повтор этого домена усечен на 20-й аминокислоте. Большинство TALE имеют 5-30 повторов, в среднем 17 повторов. Полиморфизм среди повторов зависит от аминокислотных остатков 12 и 13, называемых "repeat variable diresidue" (RVD). Последний повтор содержит только 20 аминокислотных остатков и часто называется "половинным повтором". Существует более 20 комбинаций RVD, наиболее распространенными являются "HD", "NG", "HG", "NN", "NS", "NI" и "N*". "N*" относится к повторяющемуся домену, образованному 33 остатками (RVD теряет один остаток). RVD соответствует нуклеотиду в отношениях один к одному. Например, HD, NG, Ni и NN соответствуют нуклеотидам C, T, A и G.

Первый синтетический TAL-эффектор, dHAX3, состоит из 11 канонических повторов и полуповтора (всего 533 остатка) (30). Естественно встречающийся эффектор TAL, PthXo1, содержит два скрытых повтора на N-конце доменов канонических повторов, упорядоченных 0 и -1. Домен скрытого повтора -1 не имеет RVD-связи с основанием T0 на нити ДНК (основание T0 высоко консервативно в сайте распознавания TAL и необходимо для активации эффектора TAL) (30). Каждый повтор TAL образует два левосторонних спиральных пучка, а RVD расположен на стыке двух спиральных пучков (31). Каждый TAL-эффектор соединен с цепью ДНК на 13-м аминокислотном остатке, в то время как 12-й аминокислотный остаток играет в основном вспомогательную роль в структуре, образуя водородную связь с карбонильным кислородом 8-го остатка. "HD" и "NN" обладают самой сильной силой связывания, а "NI" имеет слабый эффект.

Наиболее часто используемые TALENs лучше всего предопределяют (compromise) TALEs, которые определяют местоположение сайта-мишени, и нуклеазу FokI, которая отвечает за расщепление сайта-мишени. Поскольку нуклеаза FokI требует гомодимеризации для активации расщепления, была разработана пара TALEN для локализации в восходящей и нисходящей последовательностях сайта-мишени (32). Помимо нуклеаз, TALE могут соединяться с активаторами транскрипции для продвижения транскрипционных процессов (33); соединяться с репрессорами транскрипции для подавления экспрессии генов (34); соединяться с рекомбиназами для модификации и рекомбинации ДНК (35). Хотя в последние годы CRISPR привлекает больше внимания, и в большинстве опубликованных экспериментов на животных по генно-редактирующей терапии для генетической модификации использовался CRISPR, TALEN по-прежнему имеет уникальные преимущества в клиническом применении. По сравнению с CRISPR, хотя редактирование TALENs характеризуется более низкой эффективностью, преимущество в виде меньшего количества внецелевого редактирования и минимальной цитотоксичности превосходит CRISPR в редактировании генов человека (36).

В 1987 году Ishino и др. обнаружили высокоупорядоченную и повторяющуюся последовательность ДНК в гене IAP Escherichia coli (37). В 2002 году Jansen и др. проанализировали и изучили эту последовательность с помощью in silico анализа. Последовательность была названа кластеризованными регулярно перемежающимися короткими палиндромными повторами (CRISPR) в соответствии с уникальной структурой ДНК (38). Ген, который примыкает к CRISPR и функционально связан с ним, они назвали Cas (CRISPR-associated) и обнаружили в общей сложности 4 гена Cas (Cas1, Cas2, Cas3, Cas4) (39). В июне 2012 года Jinek и др. впервые продемонстрировали, что CRISPR/Cas9 расщепляет любую нить ДНК in vitro, указали на способность CRISPR изменять гены в живых клетках и подробно обсудили возможность применения CRISPR для редактирования генома (40). В январе 2013 года Long и др. осуществили редактирование генов CRISPR в клетках млекопитающих, подтвердив, что технология редактирования генов CRISPR/Cas9 может быть успешно применена к геному человека (41).

CRISPR - это система адаптивной иммунной защиты, которая существует у бактерий и архей против вирусов, плазмид и чужеродных нуклеиновых кислот (39). Когда бактерии подвергаются вторжению вирусов или плазмид, или сталкиваются с вторжением экзогенной ДНК вирусов или плазмид, система может захватить последовательность ДНК и сохранить ее в спейсере. Последовательности в спейсере затем транскрибируются и далее сплайсируются и модифицируются белками CAS для образования crRNA (CRISPR РНК), которая распознает ДНК захватчика (42). crRNA соединяет транс-активируемую РНК (трасРНК) и нуклеазу Cas9, образуя комплекс Cas9 (рис. 1С). Комплекс сканирует всю последовательность экзогенной ДНК и определяет область геномной последовательности захватчика, которая комплементарна последовательности crRNA. Хотя DSB активирует механизм репарации ДНК, этот процесс подвержен ошибкам, могут происходить вставки и делеции, что приводит к генетической потере функции и наличию специфического гена-нокаута (43).

Согласно новому методу классификации, предложенному в 2020 году, CRISPR-Cas-ассоциированные системы (CASSs) были разделены на две большие категории. CASSs класса1 представляет тип I, тип IV и тип III, а также 33 подтипа. Новый класс2 CASSs представляет тип II и тип V, а также недавно классифицированный тип VI, всего 17 подтипов (44).

Искусственно созданная система редактирования генов CRISPR/cas9 действует через два компонента: Cas9 и однонаправленной РНК (sgRNA, состоящей из crRNA и tracrRNA). Первые 20 нуклеотидов crRNA могут быть искусственно синтезированы для специального связывания с целевой последовательностью (45). Затем нуклеаза Cas9 направляется с помощью сгРНК к целевому локусу в зависимости от дизайна первых 20 нуклеотидов (46). Определив PAM-последовательность гена-мишени NGG (N: A, T, C, G), Cas9 расщепляет обе нити ДНК с образованием DSB на 3-4 основания выше по течению от PAM-последовательности. Существует два основных механизма репарации DSB: негомологичное соединение концов (NHEJ) и гомологично-направленная репарация (HDR) (47). NHEJ преобладает в пути репарации, когда нет шаблона для репарации. NHEJ - это подверженный ошибкам механизм восстановления DSB, который вызывает непредсказуемые вставки, делеции или замены фрагментов оснований в месте DSB, что приводит к желаемой потере функции гена-мишени. В качестве альтернативы, если гомологичные донорные шаблоны имеются в изобилии, DSB будет преимущественно восстанавливаться путем HDR. HDR может восстанавливать более точно и генерировать knock-in, делецию, коррекцию и мутацию целевых генов.

По сравнению с технологией редактирования генов второго поколения (ZFNs и TALENs), CRISPR/Cas9 третьего поколения полагается на взаимодействие РНК-ДНК, а не белок-ДНК для распознавания целевого участка, что значительно повышает точность редактирования генов. Еще одним преимуществом является отсутствие необходимости модифицировать домен распознавания ДНК в соответствии с различными ДНК-мишенями через утомительный процесс белковой инженерии; вместо этого достаточно синтезировать 20 нуклеотидов. Поэтому CRISPR/Cas9 представляется более удобным для крупномасштабного редактирования генов и все шире используется в научных исследованиях (48).

Технология редактирования генома CRISPR/Cas9 применяется в генотерапии с большим потенциалом, включая редактирование, регулирование и мониторинг отдельных генов на геномном и эпигеномном уровнях. В 2013 году Wu и др. впервые продемонстрировали, что система CRISPR/Cas9 может напрямую исправлять генетические дефекты путем NHEJ или HDR-опосредованного редактирования генов в мышиной модели (49). В 2014 году Long и др. использовали технологию редактирования генов CRISPR/Cas9 для устранения мышечной слабости и сокращения продолжительности жизни в мышиной модели мышечной дистрофии Дюшена (МДД) - наследственного Х-сцепленного заболевания, характеризующегося тяжелой мышечной дистрофией (41). Отличные результаты CRISPR/Cas9 в доклинических исследованиях показали его большой потенциал для лечения генетических заболеваний у людей.

Технология редактирования генов, опосредованная нуклеазами, такая как CRISPR-Cas9 и TALENs, генерирует двунитевые разрывы ДНК (DSBs) и затем инактивирует гены, вызывая вставки и делеции (indels) в целевых сайтах. Однако нуклеазы связаны с непредсказуемыми результатами, такими как сложные смеси продуктов, транслокации генов и случайное редактирование вне мишени. Более того, технология редактирования генов, опосредованная нуклеазами, бессильна против врожденных заболеваний, вызванных точечными мутациями, вставками и делециями.

В 2016 году Liu и др. разработали первое поколение редактора оснований цитозина (CBE1) (50). Эта новая технология редактирования генома позволяет точно заменять одно основание на другое основание без разрывов dsDNA и необходимости использования гомологичных шаблонов. Система CBE1 происходит от CRISPR/Cas9 и включает каталитически мертвый Cas9 (dCas9), который был деактивирован мутациями Asp10Ala и His840Ala, поэтому система только распознает сайт нацеливания, но не расщепляет нить ДНК. N-конец dCas9 был соединен с цитидиндеаминазой (например, hAID, hAPOBEC3G, rAPOBEC1 и pmCDA1), которая выполняет функцию деаминирования цитозина до урацила (рис. 1D). В результате урацил будет заменен на тимин, а парный гуанин - на аденин после репликации ДНК. Тем не менее, эффективность редактирования 1-го поколения BE в клетках человека составляет 0,8-7,7%. Авторы приписывают неудовлетворительную эффективность редактирования оснований урациловой ДНК-гликозилазе (UDG), которая удаляет урацил из ДНК и меняет пару U-G на исходную пару C-G. Поскольку UDG конкурирует с BE 1-го поколения, David R. L создал редактор оснований 2-го поколения (BE2), присоединив ингибитор урациловой ДНК-гликозилазы (UGI) к С-концу BE1, добившись общей эффективности редактирования 20% в клетках человека. Между тем, в редакторе оснований третьего поколения (BE3), dCas9 был заменен на nCas9(D10A) для никирования не редактируемой нити, тем самым инициируя mismatch repair (MMR) не редактируемой нити. В этом процессе отредактированная нить (включающая U) служила в качестве шаблона, и на следующем этапе репликации ДНК образовывалось больше пар U-A и больше пар T-A. При таком подходе эффективность редактирования поднялась до 37% в клетках человека.

Вслед за редактором оснований цитозина (CBE) был быстро применен редактор оснований аденина (ABE) для преобразования пар A-T в пары G-C (51). Процесс преобразования заключается в том, что аденозин гидролитически дезаминируется адениндезаминазой для получения сначала инозина, а затем инозин считывается и реплицируется как гуанин на уровне ДНК. Поэтому пары A-T были заменены на пары G-C. Процесс преобразования эффективен и безопасен в клетках человека (редактирование ~50% ДНК и образование 0,1% iindels в целом).

Однако в эксперименте по редактированию эмбрионов мыши (52) были высказаны опасения по поводу нецелевого воздействия CBE. Среди различных усовершенствований, которые были сделаны для решения проблемы существенного внецелевого эффекта (53-55), два самых полезных усовершенствования - это праймер-редактор (PE) и двойной BE. Zhang et al. (56) и Grunewald et al. (57) одновременно разработали двойной деаминазный редактор оснований CRISPR, который может одновременно преобразовывать A и C в G и T путем слияния цитозиндезаминазы и адениндезаминазы с никазазой Cas9. Двойной BE продемонстрировал сопоставимую эффективность редактирования и нецелевые эффекты по сравнению с одиночным BE.

PE не только является инновационным обновлением по сравнению с обычным BE, но и превосходит CRISPR/Cas9, так как репарация ДНК опосредуется однонитевым разрывом, а не DSB, и не требует шаблона (58). Базовые CBE и ABE могут достигать четырех видов преобразования оснований (C-> T, G -> A, A -> G и T -> C), в то время как технология прайм-редактирования не только достигает всех 12 видов преобразования оснований, но и вызывает целевые вставки и делеции. Система прайм-редактирования состоит из (i) направляющей РНК для прайм-редактирования (pegRNA): включая сайт связывания праймера (PBS) и шаблон обратной транскрипции; (ii) обратной транскриптазы (RT); (iii) никазы nCas9 (слитой с RT) (58). Сначала pegRNA направляет слитый белок к целевому локусу, затем nCas9 разрезает одиночную нить ДНК (ту, которая не комплементарна pegRNA). На следующем этапе PBS pegRNA связывается с праймером в месте расщепления, и вскоре после этого шаблон pegRNA подвергается обратной транскрипции на нить ДНК, в результате чего происходит замена оснований, вставки и делеции. Несмотря на более эффективное редактирование, при этом образуются более серьезные indels, чем при использовании BE, поскольку PE по-прежнему вызывает однонитевой разрыв.

Применение BE при врожденных заболеваниях, вызванных точечными мутациями, в настоящее время находится в стадии доклинических исследований. В мышиной модели серповидноклеточной болезни (SCD) редактор адениновых оснований (ABE8e-NRCH) продемонстрировал способность ослаблять морфологическую характеристику ретикулоцитов, а также способность преобразовывать патогенную субъединицу гемоглобина бета (HBB) в доброкачественную HBB (59). Koblan и др. (60) недавно сообщили о своем исследовании с использованием ABE для коррекции мутации (c.1824 C>T, G608G) в гене Lamin A/C (LMNA), которая вызывает синдром Хатчинсона-Гилфорда-прогерии (HGPS). Эффективность коррекции составляет 90% на уровне клеток и 20-60% на уровне мышей. Коррекция мутации с помощью ABE успешно сохранила количество сосудистых гладкомышечных клеток и уменьшила адвентициальный фиброз.

Технология редактирования генов используется для выявления специфической роли генов в патофизиологии заболеваний и биологических механизмах, а также в качестве инструмента для профилактики и лечения заболеваний. Моногенные заболевания и катастрофические болезни могут стать мишенями генотерапии (61-63). В сердечно-сосудистой области инструменты редактирования генов уже применяются в фундаментальных исследованиях, изучающих механизм сердечно-сосудистых заболеваний, особенно атеросклероза (64). Это открывает путь к генотерапии сердечно-сосудистой системы.

Атеросклероз - это многофакторное системное сосудистое заболевание, которое включает местные иммунно-воспалительные процессы в стенке артерии, провоцирующие стеноз или окклюзию артерии на средней и поздней стадиях (65, 66). Кроме того, разрыв нестабильной атеросклеротической бляшки приводит к формированию острого тромбоза, поскольку воздействие внеклеточного матрикса и гладкомышечных клеток вызывает адгезию и активацию тромбоцитов и системы коагуляционного каскада (67). Ишемия жизненно важных органов является тяжелым последствием атеросклероза, таким как ишемический инсульт, ишемическая болезнь сердца, инфаркт миокарда и ишемия нижних конечностей. Руководство ACC/AHA 2019 года рекомендует пациентам с выраженным атеросклерозом регулярно принимать антитромбоцитарные препараты для вторичной профилактики, а пациентам с промежуточным или повышенным риском атеросклеротического сердечно-сосудистого заболевания (ASCVD) - получать терапию статинами (68). Однако длительный прием статинов и антитромбоцитарных средств приводит к повреждению печени и высокому риску кровотечений, соответственно. Эти недостатки традиционной медицинской терапии подчеркивают необходимость перехода к новым терапевтическим стратегиям, таким как генотерапия.

Патогенетический механизм атеросклероза сложен, поскольку в патогенез вовлечены многочисленные факторы, такие как генные мутации, образ жизни и факторы окружающей среды (69). В настоящее время генотерапия AS направлена в основном на факторы риска (например, гиперлипидемия, гипертония, диабет). Если факторы риска атеросклероза можно будет контролировать на генетическом уровне, то это приведет к революции от эры медикаментозной терапии к эре генотерапии. Процесс отложения липидов способствует раннему возникновению и развитию атеросклероза. Было показано, что гиперлипидемия, особенно холестерин липопротеин низкой плотности (LDL-C), является важнейшим триггером патогенеза атеросклероза и независимым фактором риска сердечно-сосудистых событий (70).

Естественно возникающие мутации с потерей функции в способствующих атеросклерозу генах оказывают защитное действие на атеросклеротическое заболевание сосудов (64, 71, 72), и даже в гомозиготном или сложном гетерозиготном состоянии, когда ген полностью выключен, не наблюдается серьезных негативных последствий для здоровья. Три наиболее известных способствующих атеросклерозу гена - это proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) (73-75), ангиопоэтин-подобный белок 3 (ANGPTL3) (76-78) и аполипопротеин C-III (ApoC3) (79-82), и все они связаны с липидным обменом.

PCSK9 - это белок, экспрессирующийся преимущественно в печени. Его функция была неизвестна до 2003 года, когда исследователи выявили мутантный ген PCSK9 во французской семье с аутосомно-доминантной гиперхолестеринемией (83), тем самым PCSK9 был признан третьим геном, помимо рецептора липопротеинов низкой плотности (LDLR) и ApoB, связанным с аутосомно-доминантной семейной гиперхолестеринемией. Белок PCSK9 соединяется с LDLR-LDL, образуя комплекс PCSK9-LDLR-LDL, и переносит комплекс в лизосомы для разрушения, этот процесс эффективно предотвращает рециркуляцию LDLR к клеточной мембране. Функциональная мутация PCSK9 увеличивает сродство к LDLR и ускоряет его деградацию, вызывая аутосомно-доминантную гиперхолестеринемию и ускоряя прогрессирование атеросклероза (84-86). Преднамеренное нарушение активности PCSK9 путем мутаций с потерей функции (87), терапевтических антител к белку PCSK9 или siRNA-опосредованного глушения гена (88) может значительно снизить уровень циркулирующего LDL-C, подавить аутофагию кардиомиоцитов и снизить риск развития ишемической болезни сердца. Поэтому PCSK9 стал одной из наиболее заинтересованных и перспективных мишеней генотерапии атеросклероза. Моноклональные антитела, нацеленные на PCSK9, были исследованы в испытаниях ODYSSEY (алирокумаб) (89), FOURIER (эволокумаб) (90) и SPIRE (бокоцизумаб) (91). Все они показали, что PCSK9 снижает уровень LDL-C в плазме крови на ~60% и уменьшает количество основных сердечно-сосудистых событий. При этом не было отмечено никаких проблем с безопасностью.

Технология CRISPR - еще один многообещающий способ раз и навсегда снизить уровень PCSK9 в печени человека. Команда Kiran's из Гарвардского университета занимается этой работой (69, 92). Команда впервые попыталась исследовать in vivo редактирование PCSK9 в печени мышей с помощью системы ADV-CRISPR-Cas9 (92). Они заметили, что более 50% генов PCSK9 имели мутацию с потерей функции. Однако не произошло нецелевого мутагенеза, что привело к снижению уровня белка PCSK9, повышению уровня LDLR в плазме и снижению общего уровня холестерина в плазме на 35-40%. Вскоре после этого команда пересадила человеческие гепатоциты мышам FRG KO (иммунодефицитные мыши), которых кормили NTBC, что привело к гибели эндогенных мышиных гепатоцитов. Следовательно, человеческие гепатоциты доминировали в работе печени мыши, чем родные мышиные гепатоциты. Затем авторы разработали систему аденовирусов-CRISPR/SpCas9 для воздействия на ген PCSK9 человека (69). Уровень мутаций с потерей функции составил 42-47%, что указывает на сходную эффективность доставки CRISPR/Cas9 аденовирусом (ADV) и адено-ассоциированным вирусом (AAV). Хотя уровень общего холестерина не снизился из-за компенсаторной экспрессии мышиного белка PCSK9, данное исследование подтвердило безопасность прямого редактирования генома человеческого PCSK9 в гепатоцитах человека. Недавно Musunuru и др. опубликовали результаты своего последнего исследования, в котором использовали редакторы оснований CRISPR для нокаута PCSK9 у обезьян циномолгус. Редакторы оснований CRISPR способствовали значительному снижению уровня PCSK9 в плазме (90%) и большему снижению уровня LDL-C в плазме (60%) (93).

Лаборатория Zhang Feng's разработала систему AAV-SaCas9 для разрушения PCSK9 в печени мыши, что привело к снижению уровня общего холестерина (94). Авторы также провели редактирование генома ApoB, но наблюдали накопление липидов. Соматическое нарушение ApoB приводит к микровезикулярному стеатозу печени, что может вызвать стресс эндоплазматического ретикулума, поскольку активируется регулируемый глюкозой белок 78 (GRP78/BIP) и фосфорилированный эукариотический фактор инициации 2 (p-eIF2?) (27).

В качестве еще одной перспективной мишени для борьбы с атеросклерозом ApoC3 экспрессируется преимущественно в печени и в меньшей степени в кишечнике. После секреции в плазму крови он располагается в мембране и формирует жизненно важный компонент мембраны high-density lipoproteins (HDL) и богатые триглицеридами липопротеины (TRL), включая липопротеины очень низкой плотности (VLDL)), липопротеины средней плотности (IDL) и хиломикроны (chylomicrons). Сверхэкспрессия ApoC3 приводит к прогрессирующему атерогенезу и послеоперационному рестенозу артерий за счет ускорения пролиферации SMC, а гиперлипидемия может быть дополнительным фактором (95). ApoC3 подавляет поглощение TRL через посредничество LDLR; ингибирует деградацию триглицеридов (TG) через ингибирование липопротеинлипазы (LPL) и печеночной липазы (HL) (96).

Модель хомячка с нокаутом ApoC3 была создана с помощью системы CRISPR/Cas9 (97). В результате, при питании chow диетой уровень триглицеридов значительно снижался, в то время как общий холестерин и HDL-C не снижались. При питании по западной диете уровень триглицеридов и общего холестерина значительно снижался, наблюдалось преобразование VLDL/LDL в HDL и уменьшение атеросклеротического поражения. Это исследование позволило рассматривать ApoC3 как перспективную мишень генной терапии атеросклероза, вызванного гиперлипидемией.

Другие потенциальные мишени для лечения атеросклероза также продемонстрировали многообещающую эффективность на животных моделях. АпоА-I является основным белком, входящим в состав HDL поверхности, и отвечает за reverse cholesterol transport (RCT) (98), способствует ускорению утечки (efflux) холестерина, оказывает противовоспалительное и антиоксидантное действие (99). Напротив, исследования показали, что HDL с низким уровнем ApoA-I, но высоким уровнем сывороточного амилоида А (SAA), церулоплазмина и ApoC3 оказывают провоспалительное и прооксидантное действие, поэтому их называют дисфункциональными HDL (100, 101). Wacker и др. перенесли аполипопротеин A-I в модель атеросклероза кролика с помощью аденовирусного вектора, наблюдая уменьшение объема бляшки и подавление воспаления (102).

Peroxisome proliferators-activated receptor γ - Liver X receptor α (PPARγ-LXRα) действует как ключевой регулятор, способствующий оттоку холестерина из макрофагов в плазму крови через активацию АТФ-связывающего кассетного транспортера 1 (ABCA1)/АТФ-связывающего кассетного транспортера G1 (ABCG1) (103, 104). Отток холестерина, наиболее важный этап обратного транспорта холестерина, помогает предотвратить образование пенистых клеток макрофагов и тем самым обратить вспять атеросклеротические поражения. Между тем, PPARγ в тканях печени способствует дифференцировке адипоцитов и накоплению холестерина в печени, что снижает уровень циркулирующего холестерина (98).

Hu и др. продемонстрировали, что избыточная экспрессия PPAR стабилизировала атеросклеротические бляшки за счет снижения отложения липидов, уменьшения инфильтрации макрофагов и пролиферации гладкомышечных клеток (105). Передача секретонейрина восстановила кровоток, скорость ампутации и плотности сосудов в модели ишемии задних конечностей, вызванной атеросклерозом, но не изменила площадь бляшки (106).

Атеросклероз считается хроническим воспалительным заболеванием. Иными словами, провоспалительные факторы способствуют развитию атеросклеротических бляшек. Еще в 2002 году ингибирование моноцитарного хемоаттрактантного протеина-1 (MCP-1) на уровне ДНК показало способность уменьшать инфильтрацию воспалительных клеток, тем самым стабилизируя атеросклеротические бляшки (107). Рецепторы печени X (LXRs), оксистерол-респонсивные транскрипционные факторы, регулирующие обмен холестерина, являются потенциальными мишенями для устранения воспалительной реакции при атеросклерозе (108). Li и др. трансфицировали hematopoietic stem cells (HSCs) лентикуляторами, нагруженными LXRα, затем пересадили HSCs в модель атеросклероза LDLR-/- мышей. Наблюдалось как снижение уровня триглицеридов в плазме, так и уменьшение объема атеросклеротических бляшек. Защитное действие на атеросклероз объясняется усилением экспрессии генов переноса холестерина ABCA1 и apoE под действием LXRα. Кроме того, поскольку LXRs участвуют в регуляции выработки цитокинов [например, интерлейкина 1 бета (IL-1 β), интерлейкина 6 (IL-6) и фактора некроза опухоли-α (TNF-α)], уровни IL-6 и TNF-a; были снижены, когда LXRα был усилен трансгеном. Таким образом, авторы предполагают, что трансгенный LXRα участвует в торможении прогрессирования атеросклероза путем регулирования как липидного обмена, так и воспалительной реакции (109).

Иммунная реакция и воспаление играют жизненно важную роль в прогрессировании атеросклеротических бляшек. Хемокины, участвующие в привлечении моноцитов (например, E-селектин, P-селектин, ICAM-1, VCAM-1), воспалительные цитокины и адаптивный иммунитет (вовлечены антиген-презентирующие клетки, Т-клетки, В-клетки) могут быть потенциальной мишенью для генотерапии. Однако остается неясным, влияет ли это на системный защитный ответ. В центре внимания данного исследования - ограничение генотерапии областью атеросклероза без ущерба для опухолевого надзора или функции иммунной защиты.

Длинные не-кодирующие РНК (lncRNAs) - это класс РНК, кодирующих более 200 нуклеотидов и не обладающих способностью транслировать белок (110). Был достигнут консенсус, что lncRNA участвуют в формировании атеросклеротических бляшек, а lncRNA являются потенциальными мишенями для терапевтического вмешательства (111-113). lncRNA, экспрессирующая последовательность, для рецептора печени X (LeXis), регулирует липидный обмен через посредничество рецепторов печени X (LXRs) и RALY (транскрипционный кофактор для генов биосинтеза холестерина) (114). Tontonoz и др. попытались лечить атеросклероз, вызванный семейной гиперхолестеринемией, путем трансфекции LeXis с помощью AAV8. Успешная трансфекция LeXis снизила уровень экспрессии Srebp2, Fdps, Cyp51, Sqle, Hmgcr и Fdft1 в печени, которые отвечают за липидный обмен. Уровень холестерина и триглицеридов был снижен, а площадь инвазии атеросклероза уменьшилась. В то же время, патологические срезы показали его защитное действие на печень c ожирением и не наблюдалось признаков гепатотоксичности (115).

Не-кодирующие РНК представляют собой совершенно новые мишени для борьбы с атеросклерозом, но они не подходят для ген-редактирующей терапии, поскольку мутации не происходят. Что касается ген-замещающей терапии, то прямая трансфекция не-кодирующей РНК может вызвать неизвестный биологический эффект, поскольку она имеет обширные сайты связывания с нижележащими генами-мишенями. Механизм и мишени генотерапии атеросклероза представлены на рисунке 2, а соответствующие эксперименты обобщены в таблице 2.



Figure 2 Targets for gene therapy of atherosclerosis and involved mechanism. The figure predominantly demonstrates two primary mechanisms of atherosclerosis: (1) lipid metabolism; (2) immunoreaction and inflammation. Low turbulent flow, oscillatory shear stress, LDL, and ApoB in plasma induce endothelial dysfunction and activate the inflammatory response in endothelial cells. Then endothelial inflammation triggers the expression of leukocyte adhesion molecules such as E and P-selectin, intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1) on endothelial cell surface. These molecules promote monocytes adhered to endothelial cells and infiltrated into subendothelial layer. Monocyte chemotactic protein-1 (MCP-1) also helps recruit circulating monocytes to migrate to intima. Thereafter, monocytes differentiate into macrophages and engulf the oxidative LDL. The excessive accumulation of oxLDL in macrophages leads to foam cell formation. When PPARγ-LXRα in macrophage is upregulated, the overexpressed ABCA1 and ABCG1 promote cholesterol efflux to HDL, which is helpful to inhibit foam cell formation and prevent plaque progression. However, in pathologic conditions, PPAR?-LXR? is down-regulated thereby promoting foam cell formation. Meanwhile, endothelial dysfunction leads to secretion of PDGF, TGF- β, IL-6, IL-8 initiating VSMC migration. Among two major subtypes of macrophage, M1 predominates in athersclerotic plaque and secrets inflammatory factors while M2 exerts anti-inflammatory effects and anti-atherogenic effects. Antigen-presenting cells present LDL and ApoB to T cells in lymph nodes to activate adaptive immune response. Lipid metabolism involved mechanism has been elucidated in the manuscript. Targets in existing gene therapy experiments investigating atherosclerosis are marked by gene therapy vectors. In summary, gene therapies inactivating/disrupting PCSK9, ApoC3, and ApoB and gene therapies activating/correcting LDLR, ApoA-I, and PPARγ-LXRα play a protective role in atherosclerosis.

Table 2 Experiments of gene therapy for atherosclerosis.

MFS - это заболевание соединительной ткани с аутосомно-доминантным наследованием, возникающее из-за мутаций FBN1, кодирующего фибриллин-1. Фибриллин-1, крупный структурный гликопротеин, существует во внеклеточном матриксе (ECM) и участвует в формировании микроволокон, которые поддерживают синтез и гомеостаз эластичных волокон в аорте. Мутация FBN1 с потерей функции приводит к истончению, разрушению, снижению прочности на разрыв и эластической отдачи эластичных волокон аорты у пациентов с MFS, что повышает вероятность развития аневризмы/диссекции аорты (116). Кроме того, мутировавший фибриноген 1 потерял способность связываться с латентным TGF - β 1-связывающим белком (LTBP) для поддержания неактивности TGF - β1, что делает сигнальный путь трансформирующего фактора роста-бета (TGF - β) склонным к чрезмерной активации (117-119). Хотя TGF- β1 способствует синтезу матрикса, активируя производство коллагена и эластина, исследования показали, что TGF- β1 может способствовать деградации матрикса, увеличивая производство активаторов плазминогена и стимулируя высвобождение матриксной металлопротеиназы (MMP)-2 и MMP-9 из сосудистых гладкомышечных клеток (VSMCs) в ECM (120, 121).

Преобладающими клиническими проявлениями являются скелетные, глазные и сердечно-сосудистые поражения. У пациентов может развиться пролапс митрального клапана и аортальная регургитация, в основном в синусе Вальсальвы, что приводит к расслоению аорты, разрыву аорты и даже смерти (116, 122). Zeng и др. впервые предприняли попытку геномной модификации мутаций FBN1 при MFS с помощью BE. У пациента с MFS была выявлена гетерозиготная мутация T7498C гена FBN1, которая может быть модифицирована с помощью BE для достижения преобразования C в T. Авторы сначала попытались создать и скринировать модель гомозиготной мутации FBN1T7498C на клетках, а затем с помощью разработанной sgRNA нашли мутацию T7498C и исправили ее. Результаты показали, что 8/20 колоний осуществляют правильную репарацию (преобразование C в T), но в 2/20 происходит неправильная репарация (преобразование C в G). Затем одиночные сперматозоиды пациентов с MFS и незрелые ооциты доноров были оплодотворены in vitro для получения модели эмбрионов. Через 16-18 ч после оплодотворения in vitro в семь зигот были введены мРНК BE3 и sgRNA , а в др. семь зигот были введены мРНК BE3 и scrambled sgRNA в качестве контроля. Через два дня после этого секвенирование по Сэнгеру показало, что у всех семи эмбрионов была достигнута почти 100% коррекция в сайте 7498. В то время как у одного эмбриона (с долей ~20%) произошла нежелательная конверсия C-to-T вблизи целевого сайта. Для проверки безопасности семь отредактированных эмбрионов и три контрольных эмбриона были проверены на потенциальные сайты вне мишени с помощью ПЦР, и было обнаружено четыре несовпадения нт. Цельногеномное секвенирование одного исправленного эмбриона и двух контрольных эмбрионов выявило сайт вне мишени. Исправление патогенной мутации FBN1 (T7498C) синдрома Марфана в клетках HEK293T и у гетерозиготных человеческих эмбрионов с помощью системы BE показало общий коэффициент исправления 89% и отсутствие обнаружения внецелевых вставок/делеций (indels) в намеченных сайтах. Исследование показало превосходство BE над CRISPR/Cas9 при лечении MFS, поскольку она не зависит от DSB и имеет меньше эффектов вне мишени (2).

Для лучшего понимания патогенеза MFS и разработки эффективных терапевтических средств технология редактирования генов была использована для создания моделей MFS, имитирующих генетический патогенез MFS. Borsoi и др. модифицировали ген FBN1 в индуцированных плюрипотентных стволовых клетках здорового донора (hiPSCs) с помощью CRISPR/Cas9 и продемонстрировали их плюрипотентность, потенциал дифференцировки трех зародышей и целостность генома (123). Благодаря физиологическому и анатомическому сходству между свиньями и людьми, Umeyama и др. сконструировали модель гетерозиготного мутантного свиного клона FBN1 с помощью технологии редактирования генома и технологии ядерного переноса соматических клеток, показав дефекты генов на этом специфическом генетическом фоне и продемонстрировав сложные фенотипы заболевания (124).

Помимо синдрома Марфана, другие синдромы имеют фенотипы, схожие с MFS, но с меньшей распространенностью, такие как синдром Лойса-Дитца (LDS) и синдром Шпринцена-Голдберга (SGS) и др. LDS и SGS демонстрируют значительное совпадение клинических проявлений с синдромом Марфана. По сравнению с MFS, LDS является аутосомно-доминантным заболеванием, которое развивается раньше, прогрессирует быстрее, имеет более широкий спектр аневризм аорты. При LDS чаще поражаются дуга аорты, позвоночные и сонные артерии, а также наблюдаются краниосиностоз, дальнозоркость, расщелина/широкий язычок или расщелина неба, склонность к тяжелым аллергиям и кишечные расстройства (125). Мутировавшие гены, вызывающие LDS, в основном являются частью сигнального пути TGF- β, включая TGFBR1, TGFBR2, SMAD3, TGFB2, TGFB3 и TGFB3. Гетерозиготные мутации в этих ключевых генах приводят к частичной потере функции сигнального пути TGF- β (126-130). Однако в тканях аорты пациентов с LDS может быть обнаружена избыточная экспрессия TGF- β сигнального пути, что вызвано гиперкомпенсацией неклассических путей, и точная роль TGF- β сигнального пути в прогрессировании аневризмы остается спорной (129).

Чтобы лучше изучить механизм мутации SMAD3 у пациентов с аневризмами корня аорты, Gong и др., используя технологию CRISPR-Cas9, ввели мутацию сдвига рамки считывания и нонсенс-опосредованный распад SMAD3 в человеческих плюрипотентных стволовых клетках (hPSCs) для создания модели LDS (131). Помимо характерных признаков MFS (поражение скелетной, глазной и сердечно-сосудистой систем), у пациентов с SGS также наблюдается тяжелая дистония скелетных мышц и задержка умственного развития (126). Считается, что мутация протоонкогена SKI (SKI) является пусковым механизмом SGS. SKI является транскрипционным супрессором, который ингибирует сигнальный путь TGF- β Однако в отношении роли сигнального пути TGF- β в патогенезе SGS (вызван ли он увеличением или уменьшением сигнального пути TGF- β) среди ученых до сих пор существуют разногласия. Одна точка зрения заключается в том, что при мутации SKI происходит чрезмерная активация TGF- β сигнального пути, что соответствует патогенезу MFS (126). Другая точка зрения заключается в том, что транскрипционный ко-репрессор, кодируемый SKI, может участвовать в блокировании передачи TGF- β сигнального пути, и первый быстро деградирует под действием лиганда; когда происходят мутации гена SKI, транскрипционный супрессор становится стабильным и, таким образом, устойчивым к деградации SKI под действием лиганда, что приводит к снижению экспрессии TGF- β сигнального пути (132).

В заключение следует отметить, что дисфункция сигнального пути TGF- β играет патогенную роль в LDS, и подробный механизм все еще нуждается в дальнейшем изучении и проверке. В настоящее время мы не нашли ни одного фундаментального исследования или клинического испытания генной терапии LDS и SGS, и это может быть связано с неизвестным патогенезом слишком большого количества мутировавших генов. Дальнейшие исследования должны быть направлены на выявление мутации основных патогенных генов и разработку технологии редактирования нескольких генов.

Под FTAAD понимается возникновение двух или более аневризм/диссекций грудной аорты в семье, кроме спорадических или вызванных синдромами (такими как синдром Марфана и т.д.), и у пациентов нет явных отклонений в других системах, кроме патологии аорты (133). В настоящее время основной причиной семейного TAAD считается мутация с потерей функции гена ACTA2, кодирующего альфа-гладкомышечный актин. Кроме того, мутировавшие гены, вызывающие такие синдромы, как MFS (FBN1, TGFBR2, TGFB2 и TGFB3), также могут вызывать FTAAD (131). В настоящее время нет данных о доклинических экспериментах с использованием генотерапии для лечения FTAAD. Поскольку FTAAD является полигенным заболеванием, отсутствие экспериментальной генотерапии объясняется технической сложностью создания животных моделей FTAAD. Кроме того, по-прежнему технически сложно редактировать несколько локусов одновременно, поэтому Международная комиссия по клиническому использованию редактирования зародышевого генома человека в настоящее время не рекомендует наследственную генную терапию при мультигенном заболевании (см. таблицу 1).

FH - распространенное аутосомно-моногенное генетическое заболевание, характеризующееся значительно повышенным уровнем холестерина и холестерина липопротеинов низкой плотности (LDC-C), ранней ксантомой и прогрессирующим ASCVD (3). Наиболее распространенная мутация происходит в гене, кодирующем LDLR, другие мутации были обнаружены в ApoB и PCSK9 (134). Все мутации наследуются по аутосомно-доминантному типу.

Были предприняты экспериментальные попытки исследовать потенциал генного редактирования в лечении FH, вызванной мутацией гена LDLR. В 1995 году Grossman и др. провели первое клиническое испытание генотерапии FH на человеке. Аутологичные гепатоциты были генетически модифицированы с помощью рекомбинантных ретровирусов, несущих функциональный человеческий LDLR, а затем были пересажены в печень пяти пациентов путем инфузии в воротную вену. Через четыре месяца после пересадки у 3 из 5 пациентов было достигнуто незначительное снижение уровня LDL-C (6-25%), общего холестерина (6-20%) и ApoB (10-21%). Испытание не удалось, поскольку в биопсии печени после 4 месяцев инфузии было обнаружено лишь небольшое количество гепатоцитов, экспрессирующих нормальный LDLR, а степень снижения уровня липидов в крови оказалась неудовлетворительной. Этот результат, вероятно, объясняется низкой эффективностью трансфекции ретровирусов in vivo, и, по-видимому, функциональные гены LDLR не были интегрированы в геном гепатоцитов (135). Мы считаем, что эффективность трансфекции может быть улучшена путем переключения соответствующей системы доставки.

Zhao и др. впервые использовали систему CRISPR/Cas9 для получения гомозиготного мутанта E208X (GAG>TAG) в четвертом экзоне гена LDLR путем гомологичной направленной репарации (HDR) в оплодотворенных яйцеклетках мыши, создав полную модель мыши с потерей функции LDLR (названную LDLRE^208X); для предотвращения связывания sgRNA и перерезания последовательности была введена дополнительная "молчащая" мутация в нижнем слое (ATC > ATA) (63). Мыши LDLRE^208X демонстрировали точно такие же фенотипы и патологические изменения, такие как атеросклеротические поражения, накопление липидов, изменение фенотипа SMC, инфильтрация макрофагами.

Впоследствии авторы использовали двойную систему AAV8 для переноса Cas9 и sgRNA отдельно в неонатальные гепатоциты (63). При этом специфический для печени промотор тироксин-связывающего глобулина был соединен с последовательностью Cas9 для нацеливания на ткань печени. Секвенирование по методу Сэнгера выявило 6,7% коррекции мутаций, и внецелевые сайты наблюдались, но располагались в интронах нескольких генов. Генно-редактирующая терапия восстановила уровень мРНК LDLR (11% от дикого типа) и уровень белка LDLR (18% от дикого типа), а также уменьшила площадь атеросклеротического поражения, накопление липидов, инфильтрацию макрофагов и фиброз бляшки. Как биохимический анализ, так и гистологическое окрашивание не выявили никаких признаков повреждения печени. Это исследование показывает большой потенциал редактирования генов в клетках печени для лечения FH, но неудовлетворительная эффективность редактирования и нежелательный внецелевой эффект должны быть устранены до клинического применения.

Первое исследование на людях, целью которого было оценить безопасность и эффективность генотерапии LDLR с помощью AAV-транспортировки для лечения гомозиготной семейной гиперхолестеринемии (HoFH), было завершено в ноябре 2020 года (NCT 02651675). Клиническое исследование включало девять участников без контрольной группы; первичной конечной точкой были неблагоприятные события, а вторичными конечными точками - процентное изменение параметров липидов, таких как LDL-C, общий холестерин (TC), non-HDL-C, HDL-C, TG, VLDL-C, липопротеин(a), аполипопротеин B и аполипопротеин A-I. Хотя исследование закончилось, его результаты не были опубликованы. Известно, что у всех пациентов не было симптоматических нежелательных явлений, и, хотя у них наблюдалось повышение трансаминаз, оно быстро купировалось стероидной терапией. Токсичность, связанная с дозой, не наблюдалась, когда доза вектора AAV8 составляла 6,0 х 10¹³ gc/кг или меньше. При дозе 7,5 х 10¹² gc/кг, уровень холестерина в сыворотке крови мышей снизился более чем на 80%. Однако дальнейшее увеличение дозы вектора не привело к дальнейшему снижению уровня холестерина в сыворотке крови (136).

У гетерозиготных людей с мутацией LDLR существует остаточная частичная функция LDLR (137). В сочетании с соответствующим лечением, таким как статины, LDLR может поддерживаться на приемлемом уровне. В то время как пациенты с гомозиготной мутацией LDLR, из-за практически полного отсутствия функционального LDLR, не реагируют ни на какую медицинскую терапию, даже на ингибиторы PCSK9. Предполагаемая эффективность генотерапии FH требует лишь частичного восстановления уровня LDLR, а комбинированная лекарственная терапия помогает существенно контролировать прогрессирование атеросклероза. Таким образом, генетической коррекции подлежит лишь часть клеток печени, что позволяет эффективно снизить вероятность побочных явлений. Современные экспериментальные образцы на животных и клинические испытания направлены на гомозиготный FH. Как только будет установлена безопасность генотерапии LDLR, можно будет попытаться использовать генотерапию для гетерозиготной FH или негенетических пациентов с AS.

Характерными патологическими проявлениями HPAH являются прогрессирующая пролиферация эндотелиальных клеток сосудов, гипертрофия гладкомышечных клеток и утолщение адвентиции. Эти патологические изменения приводят к ремоделированию сосудов и обструкции пре-капиллярных легочных артерий, что приводит к необратимому повышению легочного сосудистого сопротивления, перегрузке правого сердца давлением, правосердечной недостаточности и даже смерти (138, 139). В настоящее время наиболее важным патогенным фактором считаются мутации с потерей функции в рецепторе костного морфогенетического белка-2 (BMPR2), который кодирует рецептор TGF- βII. Это нарушает связывание лигандов TGF- β, влияет на активность серин/треониновой киназы и приводит к образованию гетеродимеров (140). Кроме того, было показано, что мутации в генах BMPR1B, ACVRIJ, ENG, SMAD9, CAV1 и KCNK3 также тесно связаны с HPAH. От пятидесяти до восьмидесяти процентов пациентов с HPAH несут мутации в BMPR2, причем пенетрантность мутации у мужчин-носителей составила около 14%, а у женщин-носителей - почти 42% (141). Снижение экспрессии BMPR2 и снижение передачи сигналов BMP вследствие гетерозиготных делеционных мутаций, по-видимому, является общим путем при наследственном PAH и идиопатическом PAH.

Терапевтические стратегии включают замену или усиление дефектных сигналов от лигандов BMP, восстановление или даже усиление сигнала BMPR2 и предотвращение его деградации, ингибирование сигнала TGF- β для поддержания баланса между BMP и TGF- β, а также изменение молекул нижележащего потока сигнала BMP/TGF- β (142-147). Вышеперечисленные стратегии регулируют эндотелиальный гомеостаз или пролиферацию гладкой мускулатуры для облегчения симптомов легочной гипертензии и задержки прогрессирования легочной гипертензии. Reynolds и др. использовали моноклональные антитела к angiotensin-converting enzyme (ACE) для переноса аденовирусом упаковки гена BMPR2 в эндотелиальные клетки легких крыс. В ходе исследования AD конъюгировали с биспецифическим антителом, что позволило направить AD в легочную артерию, поскольку антитело связывается с высоко экспрессированным ангиотензин-превращающим ферментом на эндотелиальных клетках легких. Были созданы модели крыс с хронической гипоксией и monocrotaline (MCT). Хотя экспрессия гена BMPR2 была снижена в этих двух моделях, это не могло полностью имитировать HAPH, поэтому модель нокаута BMPR2 является лучшим решением. Гипоксию оценивали через 3 недели, MCT - через 10 дней. По сравнению с крысами, не получавшими лечения, крысы, трансфицированные аденовирусом, показали значительное снижение легочного сосудистого сопротивления [общее легочное сосудистое сопротивление (TPVR) снизилось на 38%, а индекс легочного сосудистого сопротивления (PVRI) снизился на 48%], значительное снижение на 40% площади сосудистой гладкой мускулатуры на единицу площади поля зрения, а также снижение аномально повышенного уровня передачи сигналов TGF- β на ~29% (145). Однако необходимы дополнительные исследования для определения безопасности и эффективности редактирования этих мишеней.

В целом, генотерапия тяжелых моногенных сердечно-сосудистых заболеваний является этически осуществимой, а терапевтическая мишень может быть четко определена с помощью секвенирования ДНК. Существенным ограничением в настоящее время является неэффективность системы редактирования и проблема безопасности, вызванная эффектом "вне мишени". Эксперименты по генной терапии наследственных сердечно-сосудистых заболеваний были обобщены в таблице 3.



Table 3

Experiments of gene therapy for hereditary cardiovascular diseases.

Тяжелый стеноз или окклюзия артерии вследствие атеросклероза может привести к острой или хронической ишемии миокарда, мозга и периферических органов. В настоящее время ангиопластика и имплантация стентов стали одним из основных методов хирургического лечения облитерирующего атеросклероза (148). Однако in-stent restenosis (ISR) and stent thrombosis (ST) являются серьезными послеоперационными осложнениями, которые вызывают серьезные опасения. ISR может быть диагностирован как стеноз просвета стента более 50% при ангиографии. Основной причиной ISR является гиперплазия новой интимы в стентах (149). Перед имплантацией стента обычно используется баллон для предилатации узкой артерии, что приводит к локальному повреждению интимы артерии. Кроме того, местная стимуляция стентов может вызвать хроническое повреждение эндотелиальных клеток артерий. Раскрытие коллагена и фибронектина, вызванное повреждением эндотелиальных клеток, запускает местную агрегацию и активацию тромбоцитов, инициируя каскады коагуляции и привлечение лейкоцитов. При взаимодействии лейкоцитов и тромбоцитов высвобождаются многочисленные цитокины и хемокины (150). Макрофаги захватывают фрагменты клеток в тканях и выделяют цитокины, такие как TNF-α, IL-6, TGF- β, и реактивные виды кислорода (ROS) (150). Впоследствии VSMC пролиферировали и мигрировали в интиму под действием тромбоцитарного фактора роста (PDGF) A/B, TNF-α, IL-6, IL-8, TGF- β, ROS и других цитокинов. Частично VSMC могут трансформироваться из сократительного фенотипа в секреторный фенотип, выделяя протеиновые кислоты и протеогликаны, которые еще больше увеличивают

По сравнению с голыми стентами (ГОС), стенты с лекарственной элюцией (ЛС) снижают активацию и агрегацию тромбоцитов, подавляют миграцию и пролиферацию гладкомышечных клеток (SMCs) и эндотелиальных клеток (ECs), а также значительно снижают частоту повторного стеноза и раннего тромбоза стента за счет медленного высвобождения лекарственных препаратов, хранящихся в покрытии (152). Однако стенты с лекарственным покрытием все еще сталкиваются с проблемой цитотоксичности и неспецифического действия лекарств. Кроме того, DES тормозят процесс реэндотелизации, одновременно подавляя неоинтимную гиперплазию, что повышает риск позднего тромбоза стента (153). В результате пациентам приходится принимать антикоагулянтные препараты в течение более длительного времени, что усиливает кровотечения у пациентов (154). Кроме того, с точки зрения долгосрочных последствий, DES, по-видимому, только отсрочивает возникновение ISR , но не предотвращает позднюю ISR (155). Более того, неоатеросклероз, под которым понимается развитие новой атеросклеротической бляшки в стенте после имплантации стента, также способствует возникновению ISR. Некоторые исследования показали, что возникновение неоатеросклероза при DES первого поколения происходит даже раньше, чем в BES (156).

Интересным решением является то, что генны элюирующие стенты (ГЭС) увеличивают время элюции и обеспечивают более длительную проходимость стента за счет медленной локальной генной модификации. Было доказано, что локальный перенос определенных генов эффективно подавляет неоинтимальную гиперплазию и неоатеросклероз. Эти гены включают индуцибельный NOS (iNOS) (157), фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) (158), тканевый ингибитор металлопротеиназы 1 (TIMP-1) (159), моноцитарный хемоаттрактант протеин-1 (MCP-1) (160), мутацию Ras (161), рецептор TGF- β1 типа II (T βRII) (162). iNOS редко экспрессируется в физиологических условиях, но высоко экспрессируется при воспалительных стимулах. Доставка iNOS увеличивает локальное содержание NO, что способствует процессу реэндотелизации и ингибирует дальнейшую адгезию тромбоцитов и мононуклеарных макрофагов, тем самым подавляя пролиферацию и миграцию VSMCs (157). Местная высокая экспрессия VEGF способствует регенерации эндотелиальных клеток сосудов и дальнейшей реэндотелизации (163). Матриксные металлопротеиназы (MMPs) разрушают внеклеточный матрикс и привлекают лейкоциты для высвобождения большого количества цитокинов и хемокинов, способствующих пролиферации и миграции VSMC. Активность MMPs подавляется тканевыми ингибиторами матриксных металлопротеиназ (TIMPs). Поэтому Ramirez Correa и др. использовали AAV для доставки гена TIMP1 в крысиную модель гиперплазии интимы сонной артерии и наблюдали уменьшение толщины интимы сонной артерии на 70,5% по сравнению с модельной группой через 2 недели (159). Дикий тип р53 (WT-p53) инактивирует G1 циклин путем активации P21waf-1/Cip-1/SDI-1. Yonemitsu и др. трансфицировали японский вирус гемагглютинина/липосому, несущую ген WT-p53, в сонную артерию кролика после повреждения баллоном. Результаты показали подавление пролиферации VSMCs и образования неоинтимы, что может быть полезным для предотвращения ISR (164). Прото-онкоген C-H-RAS считается тесно связанным с ростом и пролиферацией клеток. После введения мутировавшего гена RAS в VSMCs аденовирусом мутировавшие белки играют доминирующую роль в VSMCs, полностью подавляя активацию митоген-активированной протеинкиназы и ингибируя синтез ДНК (161, 165). Механизм и мишени для генотерапии суммированы на Рис.1



Figure 3 Local intimal hyperplasia in arterial lumen after BMS and GES implantation. (A) Before stent implantation, A balloon is usually used to predilate the stenosis segment of the artery, resulting in local damage to the intima. In addition, chronic inflammation occurs surrounding the stents. Subsequently, platelet aggregation, invasion of inflammatory cells, and cause the release of TNF-?, PDGF, IL-6, IL-8, TGF-?, ROS, and other inflammatory mediators were observed. These factors trigger VSMCs proliferation, and even foam cells formation. (B) After the coating was added to the scaffold skeleton, vectors were loaded to the coating for delivering the target gene to local endothelial cells, smooth muscle cells, fibroblasts and macrophages, etc. These target genes include iNOS, p53, Ras Mutant and T?R-II, etc. In general, the expression of target genes can inhibit the excessive proliferation of smooth muscle cells, reduce the generation of extracellular matrix, and accelerate endothelialization, thus reducing the process of in-stent restenosis and the occurrence of in-stent thrombosis.

В целом, большинство целевых генов передаются для содействия реэндотелизации артерий и снижения пролиферации и метастазирования VSMC, тем самым уменьшая гиперплазию интимы. Более того, когда передача одного гена не может достичь ожидаемого эффекта, комбинированная передача двух или более генов может быть лучшим решением. Как комбинация генотерапии и эндоваскулярной терапии, генные элюирующие стенты могут функционировать как физическая система доставки, помогающая вирусу или липосомам разместиться в определенных сегментах артерий. Будущие исследования GES могут быть сосредоточены на следующих аспектах: (1) Выбор более специфических и эффективных мишеней и поиск векторов доставки генов, соответствующих стентам; (2) Используемое в настоящее время органическое полимерное покрытие все еще вызывает острое/хроническое воспаление эндотелия артерий, поэтому необходимо разработать покрытие с меньшей цитотоксичностью и более высоким уровнем безопасности; (3) Текущие исследования ограничены терапией замены генов, локальное соматическое редактирование генов, опосредованное системой CRISPR/Cas9, и/или технология редактирования оснований могут играть более эффективную роль в предотвращении рестеноза стента и неоатеросклероза.

Доставка разработанной системы редактирования генов в целевую ткань является важнейшим этапом всего процесса редактирования генов. Если взять в качестве примера CRISPR/Cas9, то система может быть передана в трех формах: (1) ДНК, кодирующая Cas9 и сгРНК; (2) мРНК, кодирующая Cas9 и сгРНК; (3) белок Cas9 и сгРНК. Нестабильная и анион-заряженная природа нуклеиновой кислоты представляет собой препятствие для прохождения через клеточную мембрану только одной системы редактирования генов. Поэтому необходимы доставляющие векторы, которые помогают инкапсулировать нуклеиновую кислоту или другие компоненты, облегчая их проникновение через мембрану и избегая разрушения нуклеазами и протеазами.