Клеточная терапия, предполагающая использование клеток в качестве живых агентов для борьбы с болезнями, в последние годы переживает взрывной рост как в плане клинического применения, так и в плане расширения фармацевтического рынка. В частности, несколько видов терапии преодолели регуляторные барьеры и получили в коммерческое использование, что привело к растущему общественному признанию и ажиотажу. К ним относится успешное лечение лимфоидных раков с помощью адоптивного переноса клеток генетически перепрограммированных Т-клеток, что привело к одобрению FDA в 2017 году tisagenlecleucel and axicabtagene ciloleucel для лечения острого лимфобластного лейкоза (ALL) и крупноклеточной В-лимфомы (LBCL) соответственно. Среди других недавних успехов - одобрение использования полученных от пациентов лимбальных стволовых клеток для восстановления поврежденного эпителия роговицы¹, а также стволовых клеток взрослого человека для лечения фистул, связанных с болезнью Крона². Эти прорывы были основаны на десятилетиях фундаментальных исследований, и их успехи, а также успехи других авангардных методов лечения привели к стимулированию огромного междисциплинарного интереса со стороны многих ранее не связанных между собой фундаментальных биомедицинских исследований и инженерных областей. Этот рост сопровождался постоянно увеличивающимся числом клинических испытаний и растущей коллекцией коммерчески одобренных методов лечения (Таблица 1).



Таблица 1 Клеточные методы лечения, используемые в США и ЕС

Энтузиазм в отношении клеточных методов лечения во многом обусловлен перспективой перенаправления врожденных клеточных функций для обеспечения безопасности и эффективности, превосходящих другие, более известные методы. Хотя биологические препараты, к которым относятся рекомбинантные белки и другие биомолекулы, полученные из клеток, могут использовать распознающие способности макромолекул для достижения высокой степени специфичности мишени, они характеризуются неблагоприятными pharmacokinetic (PK) and pharmacodynamic (PD) свойствами, которые могут ограничивать их безопасность и эффективность^3,4. Генотерапия открывает перспективы исправления клеточного генотипа путем доставки терапевтического трансгена, обычно с помощью вирусного вектора. Однако генотерапия сталкивается с рядом трансляционных проблем^5,6, которые включают отсутствие контроля над локализацией, распределением и величиной экспрессии трансгенов, а также ограничения, связанные с размером полезной нагрузки многих векторов, и хорошо документированную неспособность поддерживать повторные циклы дозирования из-за адаптивного иммунного ответа^7,8. Кроме того, в ходе последних клинических испытаний генотерапии были отмечены значительные проблемы с безопасностью⁹.

Несмотря на то, что клеточные методы лечения имеют те же барьеры, что и генотерапия, включая опасения по поводу потенциального возникновения опухолей и высокую стоимость производства, которая затрудняет возмещение расходов на препараты, они обладают уникальными внутренними характеристиками, которые позволяют повысить эффективность в борьбе с болезнями. Например, клетки могут естественным образом мигрировать, локализоваться и даже пролиферировать в определенных тканях или компартментах¹⁰. Таким образом, клеточные методы, использующие эти свойства, обладают потенциалом для биораспределения и адресной доставки не только по сравнению с биологическими препаратами, которые подвержены ограничениям, налагаемым их профилями PK/PD, но и по сравнению с генотерапией, для которой специфичность тропизма остается сложной задачей. Кроме того, клетки могут активно воспринимать широкий спектр внешних факторов, таких как малые молекулы, маркерные белки клеточной поверхности и даже физические силы. Таким образом, клеточные методы лечения обладают способностью к очень сложным функциям "чувствовать и отвечать", которые могут динамически отслеживать состояние болезни, обнаруживая связанные молекулярные сигналы и обеспечивая многофакторный исходной ответ, включающий активацию внутреннего ответа или экспрессию терапевтических трансгенов. Наконец, благодаря способности клеток сохраняться в естественных условиях, потреблять питательные вещества и влиять на внешнюю среду посредством выработки секретируемых факторов, клеточные методы терапии могут быть использованы для поддержания долгосрочной эндогенной доставки лекарств. Хотя почти каждый тип клеток в человеческом организме (всего ~200)¹¹ обладает свойствами, которые потенциально могут быть использованы в терапевтических целях, некоторые из наиболее значимых современных клинических успехов были достигнуты благодаря инженерному изменению клеточных функций. Например, описанные выше клинические результаты лечения гематологических злокачественных опухолей были достигнуты с помощью химерных антигенных рецепторов (CAR) - искусственно созданных ДНК-конструкций, введенных в Т-клетки пациента для перенаправления их цитотоксичности на опухолевые клетки, несущие CD19, антиген, ассоциированный с В-лимфоцитами¹².

Несмотря на продолжающийся прогресс в области клеточных методов лечения различных заболеваний, создание новых продуктов остается сложной задачей, поскольку для успешного создания клинически и коммерчески жизнеспособных продуктов стратегии лечения, разработанные для конкретных заболеваний, должны преодолеть ряд серьезных проблем, перечисленных здесь (рис. 1).

Необходимо определить источник клеток (вставка 1), который дает продукт с надежными и стабильными свойствами, а для инженерных целей поддается генетическим манипуляциям.

Продукт на основе клеток должен обладать достаточной жизнеспособностью, чтобы обеспечить адекватную продолжительность терапевтического действия.

Предсказуемые и определенные уровни терапевтической потенции должны быть достигнуты путем перенаправления существующих клеточных свойств или создания новых.

PK/PD свойства клетки должны соответствовать специфическим физиологическим потребностям заболевания.

Безопасность и профиль онкогенности продукта клеточной терапии должны быть обеспечены, чтобы ограничить неблагоприятные реакции с иммунной системой хозяина и предотвратить образование опухоли.

Необходимо разработать масштабируемые производственные процессы, позволяющие эффективно и недорого генерировать количество клеток, достаточное для дозирования пациентам.

Fig. 1: A cellular therapy process flow.

Options and considerations that go into developing each step of a new cell therapy process can lead to challenges at each stage. The cell source is the starting point, whether allogeneic or autologous in nature, but these are often modified into bespoke cell therapies. These must then be manufactured at scale, which is currently a tremendous bottleneck in the industry. Finally, testing, distribution and delivery for clinical application are less challenging than some of the earlier production processes. aAPC, artificial antigen presenting cell; GMP, good manufacturing practice; IP, intellectual property.

В данном обзоре мы обсуждаем, как прогресс в создании новых и более эффективных клеточных терапий, преодолевающих эти вызовы, потребует развития способностей дополнять, усиливать и даже перепрограммировать нативные клеточные функции, используя развивающийся набор подходов биологической инженерии, включающий редактирование генома и эпигенома, синтетическую биологию и использование биоматериалов. В настоящее время эти стратегии используются не только для улучшения способа действия существующих методов лечения, но и для создания совершенно новых методов лечения путем поиска решений грандиозных задач, перечисленных выше.

Мы начнем с краткого обзора современного ландшафта клеточной терапии, выделив наглядные примеры недавних клинических и коммерческих успехов в этой области, включая использование CAR T-клеточной (CAR-T) терапии для лечения рака¹³, а также использование терапии стволовыми клетками для лечения других заболеваний, таких как инфаркт миокарда и диабет¹⁴. Затем мы даем краткое представление о различных источниках клеток, которые в настоящее время разрабатываются для применения в клеточной терапии, подчеркивая их преимущества и ограничения. Основная часть статьи посвящена некоторым наиболее инновационным и захватывающим доклиническим применениям перечисленных выше подходов биологической инженерии.

Вставка 1 Cell source and the immune response Различные источники клеток, которые в настоящее время разрабатываются для терапевтического использования, можно разделить на три группы в зависимости от их происхождения (Таблица 2): аутологичные клетки, когда клетки, составляющие продукт, получены от пациента; аллогенные клетки, которые имеют человеческое происхождение, но получены от человека, отличного от пациента; и ксеногенные клетки, которые имеют нечеловеческое происхождение. Источник клеток - это фундаментальный фактор, который влияет не только на закупку, производство и эффективность терапевтического продукта, но и на безопасность, поскольку он служит ключевым фактором, определяющим иммунный ответ пациента на пересаженные клетки. Сильный ответ может привести как к токсичности, так и к неспособности клеток сохраниться и обеспечить терапевтический эффект для пациентов. Хотя потенциал ксенопроизводных клеток высок231,238 , использование этих источников остается редким из-за проблем с преодолением иммунного отторжения хозяина. Поэтому ниже мы ограничимся обсуждением преимуществ и недостатков аутологичных и аллогенных клеток. Autologous cells Целью аутологичной клеточной терапии является лечение заболеваний путем перенаправления собственных функций клеток пациента. Как описано выше, существует три типа клеток, утвержденных или находящихся в стадии активной клинической разработки в качестве аутологичной терапии: гемопоэтические стволовые клетки (HSCs), полученные из костного мозга, иммунные эффекторные клетки, выделенные из периферической крови, и индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSCs). Общим ограничением для этих методов терапии является зависимость качества продукта от состояния здоровья пациента. Например, во многих линиях адоптивной терапии используются иммунные клетки, которые могут истощиться у донора с хроническим заболеванием. Такая изменчивость источника клеток в сочетании со сложными протоколами экспансии и длительными сроками изготовления, как правило, приводит к высоким производственным затратам и проблемам с возмещением расходов. Однако, несмотря на эти проблемы, аутологичная терапия обладает значительным преимуществом: она позволяет избежать иммунного ответа, повышает эффективность благодаря длительному приживлению и сохраняет потенциал для повторного применения239. Следует отметить, что аутологичная терапия все еще может представлять риск иммунного ответа из-за трансгенов, кодирующих антигены, которые являются ксеногенными или врожденно отсутствуют. Иммуногенность нетолерантных трансгенов была продемонстрирована доклинически и включает как клеточное (CD8+ и CD4+ Т-клетки), так и гуморальное звено адаптивного иммунного ответа240,241. Однако такие пагубные иммунные реакции еще не наблюдались в клинике. Например, в одном из недавних исследований при пересадке модифицированных лентивирусом HSCs, экспрессирующих мутантный ген β-глобина, была получена полная реверсия клинических проявлений β-талассемии без явного иммунного ответа242. Allogeneic cells В отличие от аутологичных источников, аллогенные продукты предлагают потенциально масштабируемое производство из богатых клеточных источников, что может значительно повысить стоимость и упростить производство, хотя часто в ущерб терапевтической потенции. Хотя есть несколько ярких примеров аллогенных источников для клеточной терапии, которые вызывают минимальные иммуногенные реакции - естественные киллерные (NK) клетки не вызывают болезнь "трансплантат против хозяина" (GvHD)243 , а мезенхимные стволовые клетки (МСК) обладают иммуноуклоняющимся статусом при большинстве обстоятельств244 - большинство аллогенных клеточных терапий уязвимы к негативным взаимодействиям с хозяином из-за иммунного несоответствия. Это создает серьезные проблемы для долговечности ответа, требуя режимов иммуносупрессии или новых инженерных подходов. Например, в настоящее время разрабатываются многочисленные методы аллогенной терапии, в которых клетки создаются для непрерывной доставки терапевтических белков, которые отсутствуют или снижены у пациентов из-за врожденных мутаций. В большинстве случаев клетки инкапсулируются в биополимерные матрицы для предотвращения иммунного распознавания и смягчения применения иммуносупрессии245. Однако реакция инородного тела на инкапсулированный материал остается актуальной проблемой186,246,247 (см. раздел "Биоматериалы" ниже для дальнейшего обсуждения). Преимущества этого подхода включают возможность повторного введения дозы и стабильную фармакокинетику благодаря устранению пиков и впадин, связанных с периодической инфузией248. Несколько инкапсулированных аллогенных клеточных терапий находятся в стадии разработки, в том числе для лечения диабета 1 типа (NCT04678557), гемофилии (NCT04541628) и глаукомы (NCT04577300).

Клеточная терапия для людей была впервые представлена в 1950-х годах в виде трансплантации костного мозга пациентам с раковыми заболеваниями, передающимися через кровь¹⁵. Успех этих методов лечения в качестве безопасного и эффективного стандарта лечения послужил долговременным доказательством потенциала клеток для лечения заболеваний и проложил путь к одобрению регулирующими органами в последние десятилетия методов лечения, использующих в качестве источников HSCs и haematopoietic progenitor cells (HPCs), полученные из пуповинной крови¹⁶. Эти продукты широко используются в клинической практике и составляют множество клеточных методов лечения, одобренных FDA на сегодняшний день (Таблица 1). Несмотря на одновременный прогресс в разработке терапий, полученных из других клеточных источников для лечения других заболеваний, внедрение этих терапий столкнулось с серьезными препятствиями на пути к коммерциализации, включая определение клеточных источников, которые можно легко приобрести и произвести. Хотя в большинстве утвержденных терапий используются аутологичные клетки, полученные непосредственно от пациента, многие кандидаты в терапевтические средства, изучаемые в клинических и доклинических условиях, являются аллогенными, то есть полученными от других людей. Хотя клетки, полученные из разных источников, имеют свои преимущества и недостатки (вставка 1; таблица 2), разработка стратегий взаимодействия этих клеток с иммунной системой хозяина остается серьезным препятствием для разработки новых продуктов. Эти и другие проблемы создают постоянные препятствия для обеспечения безопасности и эффективности, в результате чего за последнее десятилетие лишь несколько новых видов клеточной терапии получили одобрение регулирующих органов и вышли на рынок.

Таблица 2 Advantages and disadvantages of various cell sources for cell-based therapeutics

Одним из первых прорывных продуктов, не относящихся к HPCs, стала терапия рака простаты, при которой дендритные клетки, выделенные из организма пациента, подвергаются воздействию рекомбинантного опухолевого антигена ex vivo, а затем вводятся повторно для стимулирования Т-клеточного противоопухолевого ответа¹⁷. Эта терапия, sipuleucel-T, продаваемая компанией Dendreon, была названа первой в мире "персонализированной" терапией рака, когда она получила одобрение FDA в 2010 году, но получила ограниченное применение из-за непостоянной эффективности и неопределенности с возмещением расходов, что является следствием высокой стоимости и технической сложности процесса производства¹⁸. Другие ранние разработки на рынке включали терапию с использованием фибробластов, полученных от пациента и донора, для местного лечения повреждений тканей, а также хондроцитов, полученных от пациента, для восстановления суставного хряща. Самой ранней из таких терапий была двухслойная ткань, состоящая из бычьего коллагенового матрикса I типа, заполненного неонатальными фибробластами, полученными из крайней плоти человека, и эпидермального листа, полученного из неонатальных эпидермальных кератиноцитов, полученных из крайней плоти, представленная на рынке в конце 1990-х годов компанией Organogenesis в США¹⁹ , а в последнее десятилетие появились и другие участники (Таблица 1).

Прогресс в коммерциализации клеточных методов лечения резко ускорился в течение последнего десятилетия после одобрения CAR-T терапии FDA^20-22. С тех пор на рынке появились CAR-T препараты для рефрактерной множественной миеломы, а также дополнительные препараты для ALL и LBCL²³, и существует потенциал для одобрения терапии с использованием донорских естественных клеток-киллеров (NK)²⁴ на основании многообещающих клинических результатов²⁵. В настоящее время завершены многочисленные клинические испытания для лечения солидных и жидкостных опухолей с использованием различных типов эффекторных клеток (яркие примеры приведены в Таблице 3 и хорошо рассмотрены в других публикациях^26-28), причем в некоторых из них сообщалось о прорывном успехе²². Однако, несмотря на продолжающуюся диверсификацию, в большинстве испытаний адоптивной терапии на основе раковых клеток по-прежнему используются Т-клетки, полученные от пациента, которые, несмотря на успех в лечении гематологических злокачественных опухолей, представляют собой постоянный набор проблем для лечения других видов рака²⁹. Эти проблемы включают вопросы безопасности, связанные с синдромом высвобождения цитокинов (CRS), который возникает в результате чрезмерной активации или неконтролируемой экспансии введенных клеток³⁰. Кроме того, существует необходимость в уточнении антигенной направленности опухоли для предотвращения выхода антигена или вне-целевой цитотоксичности, что является основным препятствием для применения CAR-T терапии при солидных опухолях²⁹. Наконец, микроокружение твердой опухоли (TME) не только представляет собой физический барьер, ограничивающий перемещение и инфильтрацию Т-клеток, но и связанные с TME иммуносупрессивные сигналы могут снижать как эффекторные функции, так и экспансию и персистенцию клеток³¹. Как мы обсудим далее в этом обзоре, для преодоления этих проблем, вероятно, потребуется сочетание различных инженерных подходов, включая генетическую и/или эпигенетическую модификацию для улучшения свойств, присущих Т-клеткам, а также разработку синтетических регуляторных схем, позволяющих Т-клеткам взаимодействовать со своим внеклеточным окружением, тем самым обеспечивая условную регуляцию эффекторной функции или ремоделирование TME.



Таблица 3 Избранные продукты на основе клеток в клинических испытаниях для онкологии

Ажиотаж вокруг продуктов CAR-T в последние годы стимулировал инвестиции в разработку клеточной терапии для широкого спектра показаний, и хотя наибольшее внимание по-прежнему привлекает терапия рака, есть несколько новых областей, клинические успехи в которых вызвали ажиотаж (Таблица 4). К ним относятся лечение аутоиммунных заболеваний³², заболеваний центральной нервной системы (ЦНС) и нейродегенеративных заболеваний³³, сердечно-сосудистых заболеваний³⁴ и различных orphan заболеваний³⁵. Некоторые из этих методов лечения были разработаны с использованием мезенхимальных стволовых клеток (МСК; также известных как стромальные клетки), которые давно привлекают внимание как потенциальный источник терапевтических продуктов благодаря своим иммуномодулирующим и противовоспалительным свойствам, способности дифференцироваться в несколько зрелых типов клеток, простоте выделения из различных источников донорских тканей и благоприятному профилю безопасности³⁶. Несмотря на их доклинические перспективы, в большинстве первых попыток создания терапии на основе МСК отсутствовал надлежащий контроль качества продукции из-за вариабельности процедур выделения клеток, условий культивирования и процессов конечного расширения, в результате чего несоответствие продукции привело к многочисленным клиническим неудачам³⁶. Ранее упомянутый препарат для лечения фистул, связанных с болезнью Крона, дарвадстроцел (darvadstrocel), который в настоящее время предлагается в ЕС и Японии² , является одним из немногих коммерциализированных продуктов МСК. Другим известным препаратом является реместемцел-L (remestemcel-L), в котором используются полученные от донора, размноженные в культуре МСК для лечения GvHD³⁷. Этот препарат, первоначально представленный на рынке компанией Osiris Pharmaceuticals, а затем приобретенный компанией Mesoblast, получил одобрение регулирующих органов в Канаде, а затем в Новой Зеландии и Японии³⁸. Хотя одобрение FDA для лечения GvHD еще не получено, эта терапия недавно прошла испытания для лечения COVID-19-ассоциированного CRS (NCT04371393). Сердечно-сосудистые заболевания - еще одна область, в которой за последние 20 лет было завершено несколько клинических исследований на основе МСК³⁹. Некоторые перспективные методы терапии, в которых для лечения инфаркта миокарда использовались системно введенные клетки, первоначально считались действующими путем приживления и дифференцировки для замещения поврежденной сердечной ткани хозяина. Однако дальнейшие исследования показали, что клетки на самом деле не приживаются, а быстро очищаются иммунной системой хозяина^40,41, и что регенерация тканей происходит под действием иммуногенных и тканегенных факторов, выделяемых МСК⁴². К сожалению, противоречивые результаты последующих клинических испытаний привели к тому, что коммерциализация этих методов лечения не состоялась, что подчеркивает, как проблемы, связанные с нехарактеризованным способом действия, непостоянной потенцией и низкой жизнеспособностью в естественных условиях, могут препятствовать трансляции МСК⁴³.



Таблица 4 Selected cell-based products in clinical trials for non-oncology indications

Растущая коллекция методов лечения, которые в настоящее время проходят клинические испытания, использует клеточные продукты, полученные из плюрипотентных стволовых клеток⁴⁴. В качестве примера можно привести клетки пигментного эпителия сетчатки, полученные из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSCs), которые используются для лечения острой макулярной дегенерации и болезни Штаргардта⁴⁵. Заболевания ЦНС - еще одна область активных исследований для такой терапии: несколько групп изучают использование iPSCs для создания дофаминергических нейронов для использования при болезни Паркинсона, а несколько подходов на основе стволовых клеток находятся в стадии доклинической разработки для лечения инсульта, эпилепсии, травмы спинного мозга, болезни Альцгеймера, рассеянного склероза и боли^46-48. Одним из давних направлений терапии на основе iPSC является замена клеток поджелудочной железы для лечения диабета 1 типа⁴⁹. Многие ранние работы с использованием трупных или не-человеческих островков были связаны с ограничениями поставок и демонстрировали низкую долговременную жизнеспособность в организме человека без иммуносупрессии, что ограничивало их широкое применение^49,50. Недавно новое поколение компаний начало использовать of embryonic stem cell (ESC) и клетки островков, полученные из iPSC⁵¹. В последние годы был достигнут значительный прогресс в оптимизации протоколов дифференцировки⁵² , что позволяет строго контролировать прохождение через определенные стадии развития, получая клетки с более высокой зрелостью, чистотой и потенцией. Затем зрелые островки могут быть помещены в какой-либо тип инкапсуляционной технологии или устройства и имплантированы человеку для обеспечения функционального лечения пациентов⁵³. Несмотря на огромный ажиотаж вокруг этих методов лечения, остаются многочисленные технические препятствия, включая разработку протоколов дифференцировки, позволяющих достичь фенотипов зрелых клеток в количестве, достаточном для клинического использования.

Инновации в дисциплинах преобразования - редактирование генома и эпигенома, синтетическая биология и биоматериалы

Последние достижения в области клеточной терапии были обусловлены разработкой CRISPR и CRISPR-ассоциированных (Cas) белков как программируемых инструментов для преобразования генома человека и эпигенома в живых клетках. Системы CRISPR-Cas могут быть нацелены на определенные геномные локусы простым изменением последовательности протоспейсера соответствующей направляющей РНК (gRNA)^54-56, что дает преимущество перед другими инструментами редактирования генома, такими как нуклеаза с цинковыми пальчиками (ZFN) и белки TALEN, которые требуют преобразования белков для нацеливания на новые последовательности⁵⁷. Такая простота использования может непосредственно привести к оптимизации циклов проектирования, создания и тестирования и, таким образом, сократить время выхода на рынок и затраты на производство терапевтических препаратов на основе клеток. Тем не менее, использование белков ZFN и TALEN привело к нескольким важным клиническим достижениям, которые подготовили почву для быстрого внедрения и клинического применения технологий на основе CRISPR-Cas^58-60.

Наиболее охарактеризованная система CRISPR-Cas использует белок Cas9, полученный из Streptococcus pyogenes^54-56 для создания двунитевых разрывов (DSBs) в геноме человека. Однако в будущем клиническое значение будут иметь и некоторые другие платформы CRISPR-Cas, включая новые белки Cas, полученные из различных прокариот, и белки, сконструированные в лаборатории (вставка 2). DSBs на основе CRISPR-Cas разрешаются в клетках человека естественным путем через негомологичное соединение концов (NHEJ), гомологичную направленную репарацию (HDR) (рис. 2a) или другими, родственными способами. Cas9-опосредованная NHEJ использовалась для подавления патогенных локусов, удаления пагубных инсерций и придания устойчивости к вирусам. В контексте терапевтического редактирования генома и клеточной терапии первые знаковые исследования показали, что Cas9-опосредованный NHEJ эритроидного энхансера BCL11A может быть использовано для потенциального лечения серповидно-клеточной болезни или β-талассемии⁶¹. Кроме того, стратегии NHEJ с использованием Cas9 для воздействия на определенные области генома ВИЧ⁶² или вируса папилломы человека (HPV)⁶³ оказались полезными для ограничения распространения этих вирусов.



Fig. 2: Leveraging CRISPR-Cas-mediated genome and epigenome editing for improved cell-based therapeutics.

a | Genome editing can be applied to correct monogenic diseases. Double strand breaks (DSBs) resulting from programmed genome editing outcomes generally resolve via non-homologous end joining (NHEJ) or homology-directed repair (HDR) repair mechanisms in human cells. NHEJ typically results in insertions or deletions (indels) near the targeted genomic site, which can be leveraged for programmable endogenous genetic disruption. By contrast, in the presence of a donor DNA template, HDR can permit precision replacement of genomic DNA, including donor templated to correct DNA associated with pathology or to incorporate clinically important transgenic payloads. b | CRISPR-Cas-based genome editing technologies are highly amenable to multiplexing, which can be used to improve cell-based therapeutics, including chimeric antigen receptor T cell (CAR-T) therapies. Multiplexed CRISPR-Cas9-based genome editing (shown here simultaneously targeting the genes encoding human ?2-microglobulin (?2m), PD1 and endogenous T cell receptor (TCR)) in combination with a lentivirally delivered CAR can be used to generate CAR-T cells with improved function and safety profiles. c | CRISPR-Cas systems with inactivated nuclease activity do not result in DSBs, but can still precisely target genomic DNA. These CRISPR-Cas-based 'epigenome editing' platforms enable robust activation or repression of transcription (CRISPR activation (CRISPRa) or CRISPR interference (CRISPRi), respectively) or tailored control over epigenetic modifications within human cells, which can be used to shape gene regulation and cell functions. d | The convergence of these transformative technologies can be used to engineer favourable properties within cell-based therapeutics, for example, by disrupting loci that elicit immunological recognition in therapeutic-grade induced pluripotent stem cells (iPSCs), overcoming limitations to therapeutic efficacy and natural potency by harmonizing integrated payloads with natural genetic regulatory programmes (that is, expressing a CAR-T receptor from a locus (TRAC) that naturally drives TCR expression) or overexpressing beneficial endogenous molecules, and by remodelling chromatin signatures to more efficiently reprogramme cellular lineage commitment, for instance, improving the derivation of iPSCs from fibroblasts. gRNA, guide RNA; PAM, protospacer adjacent motif; Transcript., transcriptional.

Хотя использование Cas9-опосредованного NHEJ для воздействия на отдельные локусы и/или моногенные заболевания в настоящее время имеет наибольший клинический прогресс, мультиплексные подходы, направленные на одновременное воздействие на несколько локусов, также значительно продвинулись в последние годы^64-66 (рис. 2b). Например, мультиплексное редактирование генома на основе CRISPR-Cas9 с использованием мРНК Cas9 и gRNAs , нацеленных одновременно на гены Т-клеточного рецептора (TCR), β₂-микроглобулина (β₂m) и PD1, было использовано в сочетании с лентивирусной доставкой CAR для создания аллогенных CAR-T клеток, дефицитных по TCR, молекуле HLA класса I и PD1, и открыло путь к универсальным CAR-T клеткам⁶⁵. Важно отметить, что подобные комбинаторные стратегии могут оказаться центральными для решения некоторых важных проблем, стоящих перед клеточной терапией - в частности, путем снижения иммуногенности аутологичных клеточных источников и повышения жизнеспособности сконструированных клеток, что, в свою очередь, может повысить безопасность пациентов и терапевтическую эффективность. В будущем технологии мультиплексного редактирования генома также могут стать ключевыми для моделирования и лечения более сложных заболеваний, при которых патологии проявляются в результате совместного действия нескольких локусов. Технологии мультиплексного редактирования генома, вероятно, также предоставят новые способы преодоления многих препятствий, стоящих на пути клеточной терапии, например, позволяя одновременно нокаутировать несколько локусов, которые в противном случае являются узкими местами в производстве терапевтических белков или делают клетки более чувствительными к апоптозу в неблагоприятных условиях.

Одним из сдерживающих факторов, связанных с использованием NHEJ для редактирования генома с целью создания клеточных терапевтических препаратов, является то, что разрешение DSBs после NHEJ может быть непредсказуемым. В отличие от этого, HDR может привести к точным и предсказуемым изменениям в геномной последовательности. Например, HDR на основе CRISPR-Cas был использован для повышения надежности CAR-T клеточной терапии путем направления CD19-специфического CAR в локус α-цепи Т-клеточного рецептора (TRAC) для более равномерной экспрессии CAR и повышения потенциала⁶⁷. Совсем недавно для введения экзогенных полезных нагрузок в первичные Т-клетки человека с помощью HDR была использована доставка компонентов CRISPR-Cas и дизайнерских донорских шаблонов, опосредованная рибонуклеарным белком (RNP). Этот подход допускает надежные индивидуальные или мультиплексные модификации и был использован как для исправления патогенных мутаций, так и для искусственного преобразования эндогенного локуса TCR с целью распознавания ракового антигена NY-ESO-17. Расширение этих подходов для нокаута пулов различных вариантов в специфические локусы Т-клеток также оказалось мощным способом скрининга для повышения эффективности против солидных опухолей⁶⁸.

DSBs, созданные системами CRISPR-Cas, могут привести к вредным геномным перестройкам и цитотоксичности, создавая проблемы безопасности и жизнеспособности для сконструированных клеток. Например, сообщалось, что опосредованные CRISPR-Cas9 DSBs в мышиных ESCs и гематопоэтических предшественниках, а также в клеточных линиях человека, приводят к большим непреднамеренным делециям, которые могут вызвать опасные патологии, если их не оценивать и не контролировать должным образом⁶⁹. Кроме того, редактирование генома на основе CRISPR-Cas9 в иммортализованных пигментных эпителиальных клетках сетчатки человека, как было отмечено, вызывает p53-опосредованный ответ на повреждение ДНК⁷⁰. Поэтому значительное внимание уделяется разработке инструментов на основе CRISPR-Cas, которые могут осуществлять редактирование генома в отсутствие возникновения DSBs. Например, были разработаны редакторы оснований на основе CRISPR-Cas, которые нацелены на редактирование геномных последовательностей в определенных локусах без создания DSB^71-75. Несмотря на то, что редакторы оснований появились относительно недавно по сравнению с традиционным редактированием генома на основе нуклеаз, они, несомненно, окажутся полезными для клеточной терапии. Например, недавние усилия по использованию мультиплексного редактирования оснований в первичных человеческих Т-клетках привели к созданию новой платформы для производства аллогенных CAR-T-клеток⁷⁶. Другие технологии, такие как праймерное редактирование на основе CRISPR-Cas⁷⁷ и транспозазы на основе CRISPR-Cas^78,79, также позволяют осуществлять сайт-специфическое редактирование генома без DSBs и, вероятно, станут полезными инструментами в арсенале редактирования генома для будущих клеточных терапий (вставка 2).

Поскольку белки CRISPR-Cas получены из бактериальных или архейных источников, еще одним важным моментом является потенциальная иммуногенность или токсичность инструментов редактирования генома и эпигенома, которые используются для клеточной инженерии и производства терапевтических белков. Например, компоненты CRISPR-Cas могут быть иммуногенными у млекопитающих, а некоторые пациенты могут приобрести иммунитет в результате предыдущего контакта с белками Cas^80,81. Кроме того, сама экспрессия Cas9 была связана с активацией пути p53 и обогащением мутациями, которые инактивируют p53 в многочисленных линиях раковых клеток человека^70,82. Хотя методы редактирования ex vivo в сочетании со скринингом и отбором клеток позволяют обойти многие из этих проблем, они могут быть дорогостоящими и не поддаются масштабированию. Хотя эти проблемы иммуногенности и токсичности вызывают явную озабоченность, усилия по целенаправленному применению in vivo быстро развиваются^83,84 и будут иметь решающее значение в будущем.

Помимо прогресса в текущих клинических испытаниях⁸⁵ и в создании новых платформ CAR⁸⁶ , редактирование генома сыграло важную роль в разработке искусственно измененных клеток "готовых" для использования в качестве терапевтических средств. Например, человеческие Т-клетки, которые были отредактированы для удаления CD7 и TRAC, продемонстрировали эффективность против Т-клеточного острого лимфобластного лейкоза (T-ALL) без признаков ксеногенной GvHD⁸⁷. Как обсуждалось выше, мультиплексное применение CRISPR-Cas9 также использовалось для одновременного разрушения эндогенных TCR, HLA и PD1 для получения аллогенных CAR-T клеток с пониженной иммуногенностью⁶⁵. Выполнение редактирования генома до клеточной дифференциации - еще один вариант, который может привести к получению однородных клеточных популяций, что может сделать производство более масштабируемым и доступным. Например, разрушение генов HLA в iPSCs оказалось полезным способом повышения иммунной совместимости, а недавно iPSCs были подвергнуты аллель-специфическому редактированию HLA для создания псевдогомозиготности, что позволило получить iPSCs, которые могли избегать распознавания как Т-клетками, так и NK-клетками⁸⁸. Аналогичные стратегии по нокауту B2M и одновременной избыточной экспрессии CD47 также позволили получить iPSCs со значительно сниженной иммуногенностью⁸⁹. Готовые терапевтические препараты на основе iPSC человека быстро прогрессируют, и в настоящее время проводятся клинические испытания как солидных опухолей, так и гематологических злокачественных новообразований (NCT03841110 и NCT04023071, соответственно). Эти захватывающие успехи в использовании редактирования генома в клинических условиях распространились на множество серьезных заболеваний, включая бактериальные инфекции^90,91 (например, NCT04191148), β-талассемию и серповидно-клеточную болезнь⁹² (например, NCT03655678; EDIT-301), гемофилию B^59,93 (NCT02695160) и мукополисахаридоз II94 (например, NCT03041324), среди прочих⁶⁰.

Хотя обычное редактирование генома на основе CRISPR-Cas приводит к изменению геномных последовательностей, большинство платформ CRISPR-Cas, используемых в клетках человека, можно деактивировать и сделать нуклеазно нулевыми с помощью простых аминокислотных замен. Эти так называемые деактивированные или dCas системы позволили создать легко программируемые синтетические транскрипционные факторы и модификаторы хроматина, что, в свою очередь, привело к появлению новой области редактирования эпигенома^95-97 (рис. 2c). Стратегии редактирования эпигенома оказались полезными для перепрограммирования и направления спецификации клеточных линий, а также для моделирования заболеваний человека. Например, технологии CRISPRa показали перспективность в синтетическом индуцировании экспрессии основных транскрипционных факторов, которые контролируют спецификацию клеточной судьбы. Например, dCas9-VPR был использован для надежного управления экспрессией эндогенного нейрогенина 2 человека и, таким образом, для того, чтобы заставить iPSCs принять свойства нейрональной линии⁹⁸. Интересно, что в отличие от обычной избыточной экспрессии кДНК, стратегии преобразования линий на основе CRISPRa также вызывают изменения в эндогенном хроматине, которые, как было замечено, повышают эффективность клеточного перепрограммирования⁹⁹. Аналогичные подходы были использованы для преобразования миоцитов¹⁰⁰, перепрограммирования судьбы клеток поджелудочной железы¹⁰¹, нацеливания на несколько локусов одновременно in vivo¹⁰² и инженерии плюрипотентности^103-105.

Кроме того, инструменты редактирования эпигенома на основе CRISPR-Cas были использованы для моделирования нескольких заболеваний человека и лечения заболеваний, при которых экспрессия генов и/или эпигеном подвергаются нарушениям регуляции. Всестороннее обсуждение редактирования эпигенома для моделей заболеваний выходит за рамки данного обзора, однако, недавние примеры включают нервно-мышечные¹⁰⁶ и ферментативные нарушения¹⁰⁷, а также болезни почек и диабет¹⁰¹. По мере появления и развития новых технологий точного программирования экспрессии генов и эпигенома человека, они, несомненно, станут неотъемлемой частью следующего поколения клеточных лекарств в сочетании с современными клеточными терапевтическими препаратами и традиционным редактированием генома. Эти технологии, вероятно, будут особенно полезны для адаптации точных уровней генных продуктов и предотвращения эпигенетического подавления терапевтических трансгенов или цитокинов с течением времени в клетках, созданных с помощью инженерии.

Как и в случае с белками Cas, многие из наиболее мощных и широко распространенных транскрипционных эффекторов, используемых для приложений редактирования эпигенома на основе CRISPR-Cas, разработаны с использованием не-человеческих (обычно вирусных) природных или даже синтетических транскрипционных и/или хроматиновых модификаторов. Поэтому существует риск и высокая вероятность того, что эти эффекторные домены также могут обладать присущей им иммуногенностью in vivo, особенно при длительной экспрессии. Будущие усилия, направленные на идентификацию или преобразование транскрипционных и/или эпигенетических эффекторных белков, полученных из клеток человека^105,108,109, будут иметь ключевое значение для устранения этих иммунологических препятствий у пациентов. Кроме того, хотя специфичность целевых инструментов редактирования эпигенома на основе CRISPR-Cas, вероятно, намного выше, чем у малых молекул, которые глобально нарушают эпигеном человека, тщательный анализ стабильности и специфичности редактирования эпигенома будет иметь решающее значение для определения терапевтической эффективности, долговечности и свойств PK/PD клеточных терапевтических средств в ближайшие годы.

В целом, новые захватывающие и глубокие возможности для инженерии благоприятных свойств и поведения человеческих клеток появились благодаря сочетанию редактирования генома и эпигенома (рис. 2). Как описано выше, эти новые технологические достижения уже привели к улучшению способов использования человеческих клеток в качестве терапевтических средств. Учитывая этот прогресс, клеточная терапия почти наверняка продолжит развиваться с помощью инструментов редактирования генома и эпигенома. В контексте грандиозных задач, стоящих перед клеточной терапией, технологии редактирования генома и эпигенома, вероятно, ускорят производство большого количества клеток с ограниченной иммуногенностью, обладающих надежными и стабильными клиническими свойствами и жестко контролируемой жизнеспособностью. Кроме того, используя естественные эпигенетические программы человеческих клеток, редактирование эпигенома на основе CRISPR-Cas, вероятно, облегчит настраиваемый контроль и предсказуемые результаты терапевтических трансгенов или эндогенных биомолекул.

Несмотря на этот преобразующий прогресс, многие проблемы остаются нерешенными. Например, стабильное поддержание присутствия и высокой равномерной экспрессии больших генетических нагрузок в сконструированных клетках часто является сложной задачей. Сочетание сложных генетических схем (см. ниже) и технологий редактирования эпигенома может быть использовано для устранения несоответствий в уровнях экспрессии, что особенно важно для балансировки активности CAR-T110 и может быть использовано для предотвращения эпигенетического истощения клеток. Более того, поскольку трансгенные полезные нагрузки могут быть эпигенетически подавлены с течением времени, существует уникальная возможность использовать инструменты редактирования эпигенома для потенциального обращения вспять и/или предотвращения любого эпигенетического подавления терапевтических трансгенных полезных нагрузок. Наконец, хотя производство iPSCs из дифференцированных клеток и управление их последующей редифференцировкой значительно продвинулось за последнее десятилетие, используемые процессы и протоколы часто неэффективны и/или трудоемки и поэтому не идеальны для масштабного производства. Комбинированный подход к генной инженерии генома человека, эпигенетической инженерии транскриптома человека, а также к адаптации условий культивирования и коктейлей из мелких молекул, вероятно, устранит эти недостатки и поможет открыть новую волну терапевтических препаратов на основе клеток.

Box 2 CRISPR-Cas genome editing toolbox Naturally occurring CRISPR-Cas-based genome editing tools Канонический вариант Cas9 получен из Streptococcus pyogenes (SpCas9; здесь - Cas9). Cas9 распознает и связывается с мотивом NGG protospacer adjacent motif (PAM) и после связывания перерезает последовательность ~3 nt перед PAM, что приводит к тупому двухцепочечному разрыву (DSB)54-56. Другие белки Cas природного происхождения (например, SaCas9 (ссылка.249), NmCas9 (ссылка.250), CjCas9 (ссылка.142), AsCas12a и LbCas12a251,252) имеют меньшие размеры и измененную специфичность PAM, что может быть полезно для вирусной упаковки и расширения диапазона нацеливания, соответственно. Кроме того, некоторые белки Cas могут сайт-специфически нацеливаться на РНК, в частности, варианты Cas13253,254, а недавние усилия также были направлены на использование систем CRISPR первого типа, таких как комплекс Cascade255,256, которые содержат множество различных белковых субъединиц. Хотя каждая из этих платформ имеет огромные клинические перспективы, продолжающаяся работа по определению эффективности, предсуществующего иммунитета и механизмов активности и разрешения нуклеаз позволит повысить эффективность и полезность. Этим усилиям будут способствовать недавно опубликованные рекомендации FDA по включению редактирования генома в продукты генотерапии человека (https://www.fda.gov/media/156894/download). Engineered CRISPR-Cas-based genome editing tools В дополнение к использованию естественных платформ CRISPR-Cas, белок Cas9 был сконструирован для улучшения специфичности, расширения диапазона нацеливания и возможности модификации последовательности без DSBs. Ключевые мутации в белке Cas9 привели к созданию модифицированных вариантов, таких как SpCas9-HF1 (ссылка 257), eSpCas9 (ссылка 258) и HypaCas9 (ссылка 259), которые демонстрируют улучшенную специфичность нацеливания на весь геном при сохранении высокой активности на мишени. Другие инженерные разработки позволили получить варианты белка Cas9 с измененной специфичностью PAM260,261, а в последнее время - версии без PAM262 , которые оказываются нацелены практически на любой эндогенный локус. Кроме того, последние достижения включают белки Cas9, которые изменяют ДНК без индукции DSBs, такие как технологии редактирования оснований71,74,75, транспозазы на основе CRISPR78,79 и платформы редактирования праймеров77. Nuclease-null CRISPR-Cas-based tools to control gene expression and the epigenome Были созданы нуклеазно-нулевые, деактивированные CRISPR-Cas системы (dCas), которые нацелены на геном человека подобно обычным белкам Cas, но не делают разрезов после сайт-специфического распознавания95,97,263,264. Эти платформы на основе dCas были перепрофилированы в качестве основы для доставки транскрипционных модулирующих доменов и эпигенетических эффектов в конкретные локусы для терапевтического эффекта. Широко используемые активаторы транскрипции, набираемые с помощью dCas, включают эффекторы VP64 (ссылка.264), VPR98, p300 (ссылка.108) и синергетический медиатор активации (SAM)265. Платформа SunTag266 также позволила надежно набирать несколько эффекторов в целевой локус, что может быть использовано для мощной индукции экспрессии генов. Совсем недавно были описаны компактные и надежные транскрипционные активаторы, источником которых являются человеческие белки105. Параллельно были разработаны технологии для репрессии экспрессии генов человека с использованием репрессоров, таких как домен KRAB264 или их двухсторонние слияния (например, KRAB-MeCP2)267. Домены, модифицирующие метилирование ДНК, включая DNMT3a-3l268,269 или каталитический домен деметилазы TET1 (ссылки236,237), также были рекрутированы в локусы человека с помощью белков dCas, что приводит к сайт-специфическому метилированию или деметилированию ДНК, соответственно. Полная оценка этих технологий выходит за рамки данного обзора, однако становится ясно, что синергия этих инструментов с традиционным редактированием генома и современными клеточными терапиями станет важным компонентом будущего инженерии клеток.

Использование генной инженерии для введения трансгенных или искусственных генов в терапевтические клетки преследуется уже несколько десятилетий как средство создания более безопасных и эффективных продуктов на основе клеток. Многие из этих подходов, включая введение CARs в Т-клетки, не соответствуют названию "инженерия"; большинство из них используют устаревшие десятилетиями инструменты генетики для введения трансгенов в клетки таким образом, который обеспечивает ограниченный контроль над величиной или временем их экспрессии. Область синтетической биологии возникла в последние два десятилетия с целью сделать результаты генной инженерии более точными, предсказуемыми и воспроизводимыми за счет применения количественных правил проектирования¹¹¹. Хотя самые первые успехи были достигнуты в области микроорганизмов¹¹¹, в последние годы эта область достигла прогресса в инженерии человеческих клеток¹¹². Этот прогресс в значительной степени мотивирован возможностью усиления клеточной терапии за счет точного контроля над экспрессией терапевтических трансгенов или доставкой секретируемых терапевтических факторов, или программирования клеток на восприятие биомолекулярных видов, связанных с определенным тканевым компартментом или состоянием болезни, и реагирования на них изменением поведения клеток (рис. 3а). Хотя в настоящее время большинство усилий направлено на улучшение терапевтической потенции, профиля PK/PD и безопасности, синтетическая биология имеет потенциал для создания инженерных решений, которые решат все грандиозные проблемы, обсуждавшиеся во введении к данному обзору, включая расширение спектра типов клеток, которые могут быть использованы для терапии, а также повышение эффективности и надежности процессов производства клеток (рис. 3б).



Fig. 3: Using synthetic biology approaches to endow therapeutic cells with enhanced functional properties.

a | Making new synthetic regulatory connections. Engineered regulatory circuits can be introduced into therapeutic cells to create artificial input-output relationships. This can connect external user control or disease-associated molecular cues to diverse therapeutic outputs. b | Outstanding challenges for synthetic biology in engineering new cell-based therapy applications. Future developments should include developing human-derived components, developing larger capacity vectors to accommodate larger, more sophisticated circuitry and using synthetic circuits to guide cell differentiation (for example, from induced pluripotent stem cells to immune effector cells).

Применение синтетической биологии в клеточной терапии, о котором сообщалось в последние годы, варьируется по сложности от простых переключающих модулей, созданных из модифицированных белков, до многокомпонентных "схем" - искусственных сетей регуляции генов и белков, запрограммированных на преобразование определенных молекулярных входов для терапевтического введения¹¹³. Конструкции цепей в целом делятся на две функциональные категории (рис. 4). Во-первых, те, которые позволяют экзогенно контролировать дозу или временной профиль ответа экспрессии генов или активности белков, обычно с помощью таких входов, как низкомолекулярные препараты. Эти "управляемые пользователем" схемы могут быть использованы для активации или деактивации экспрессии трансгенов, что позволяет создавать схемы лечения, оптимизирующие время терапевтического действия. Во-вторых, те, которые связывают автономное распознавание молекулярных входов с последующей активностью, тем самым устанавливая замкнутый цикл восприятия и реагирования на экзогенные сигналы, связанные с определенным тканевым компартментом или состоянием болезни. Цепи второй категории часто связаны с рецепторами на поверхности клеток, которые распознают внеклеточные белки или мелкие молекулы. Схемы обеих категорий имеют промежуточные "мотивы" обработки сигналов, которые преобразуют входные сигналы в выходные в соответствии с количественно определенными операциями. Например, контроль обратной связи может быть использован для изменения времени выхода схемы, а операции булевой логики могут быть реализованы для активации схем только при наличии определенных наборов входных сигналов. Оба мотива имеют очевидное применение для улучшения терапевтических результатов: в первом случае они могут быть использованы для модуляции кинетики терапевтического действия, а во втором - для комбинаторного распознавания молекул с целью более точного направления терапевтических выходов на конкретные клетки-мишени или ткани (рис. 3а).



Fig. 4: Using synthetic circuits to enhance therapeutic function.

a | Synthetic regulatory circuits have been developed that improve chimeric antigen receptor T cell (CAR-T) therapy by enabling small-molecule remote control over CAR activity117 and enhancing target cell specificity118 (synNotch). The remote-control circuit features a split CAR that can be used to reconstitute CAR activity through administration of a small-molecule dimerizer, enabling exogenous control over T cell antitumour function. SynNotch is a programmable receptor that can sense cell surface ligands and respond by activating gene expression. This response can be coupled to production of a CAR, which is then able to recognize a second ligand, thereby enabling Boolean AND-gate function. b | Synthetic sense-and-respond programmes have been engineered that can autonomously treat diseased tissue. In one set of example applications125, systems have been developed in which the sensing of inflammatory cytokines is coupled to secretion of those that are anti-inflammatory. TA, transcriptional activator.

Примером такого спектра подходов является недавняя работа с использованием синтетической биологии для решения проблем, связанных со специфичностью и активностью в адоптивной Т-клеточной терапии^114,115. Одно из наиболее успешных применений в этой области - белковый безопасный киллер, сконструированный таким образом, чтобы вызывать апоптоз в прижившихся клетках^116. Химерная конструкция переключателя включает человеческую каспазу 9, слитую с модифицированным человеческим FK-связывающим доменом, что обеспечивает димеризацию и активацию апоптической сигнализации при введении низкомолекулярного препарата AP1903. Хотя первоначально этот переключатель был разработан для уничтожения аллореактивных Т-клеток во время процедур трансплантации стволовых клеток, впоследствии он был использован в клинических испытаниях CAR-T терапии для ограничения пролиферации эффекторов в условиях CRS (NCT03696784). В другом варианте химическая димеризация была использована для того, чтобы вызвать активность CAR через мембранное рекрутирование внутриклеточных активационных доменов¹¹⁷ (рис. 4a). Этот так называемый ON-switch CAR предлагает инструмент для тонкой настройки in vivo потенции CAR-T продукта путем введения димеризатора AP21967 или отмены активации во время возникновения CRS путем удаления препарата.

Одним из важных направлений в синтетической биологии CAR-T в последнее время является разработка стратегий для повышения специфичности опухолевого таргетинга с целью обеспечения терапии солидных опухолей. Одним из известных примеров, первоначально разработанным Lim и коллегами^115,118, является рецептор-опосредованная схема регуляции генов, в которой сконструированный химерный рецептор Notch, добавленный к одноцепочечному антителу, запускается при связывании с лигандами на поверхности соседних клеток, что приводит к протеолитическому высвобождению активатора транскрипции и экспрессии трансгена (рис. 4а). Названная synNotch, эта система была первоначально разработана для экспрессии CAR в присутствии второго лиганда, обеспечивая тем самым распознавание комбинаций антигенов с двумя входами AND-gate¹¹⁹. Дальнейшее развитие synNotch привело к появлению схем, использующих обратную связь для достижения активации, подобной переключателю, активации по принципу "все или ничего" при достижении порогового значения плотности антигена клетки-мишени¹²⁰, а также для создания сложных многовходовых схем булевых ворот, способных отличать специфические опухоли от посторонних тканей¹²¹. Другие решения по улучшению специфичности CAR-T были направлены на инженерию внеклеточных распознающих способностей, включая split, universal and programmable (SUPRA) CARs, которые используют многовалентные внеклеточные белковые каркасы для распознавания комбинаций антигенов¹²². Была описана еще одна система, в которой сконструированный белок претерпевает конформационные изменения в присутствии наборов антигенов для выявления пептида, который может привлекать CAR-T клетки¹²³. Решения для повышения безопасности CAR-T терапии включают расщепление рецепторов, перепроектированных таким образом, что они либо индуцируются¹¹⁷ , либо активируются введением малых молекул, причем обе стратегии позволяют быстро деактивировать функцию CAR в условиях CRS. Описана инновационная стратегия, при которой адено-ассоциированный вирус (AAV) используется для введения в клетки "схемы классификатора", запрограммированной на распознавание специфических для опухоли транскрипционных факторов и сигнатур микроРНК¹¹⁹. Клетки, экспрессирующие (circuit output) выход схемы - уникальный лиганд на клеточной поверхности - могут затем стать мишенью для Т-клеток, содержащих соответствующий CAR¹¹⁹. Наконец, недавно смена доменов рецептора была использована для разработки синтетического рецептора, который избирательно распознает маркеры активированных лимфоцитов. Этот белок, названный аллозащитным рецептором, позволяет адоптивным Т-клеткам противостоять иммунному отторжению хозяином, нацеливаясь на аллореактивные лимфоциты, тем самым обеспечивая более длительный терапевтический эффект в животных моделях¹²⁴.

Другим важным направлением синтетической биологии является разработка обобщающих замкнутых регуляторных схем, предназначенных для мониторинга физиологического или болезненного состояния и терапевтического ответа. Была использована стратегия, при которой трансгенные репортерные кассеты используются для перенаправления родных путей передачи сигнала. Одним из таких примеров является двухступенчатая схема преобразования цитокинов, которая на первом этапе преобразует TNFα-зависимую передачу сигналов NF-&kappa:B в производство IL-22, который затем активирует цитокиновый рецептор и сигнализирует через STAT3, стимулируя транскрипционную продукцию и секрецию противовоспалительных цитокинов IL-10 и IL-4 (ссылка 125) (рис. 4b). После инкапсуляции и приживления у мышей клетки, содержащие эту цепь, смогли ослабить воспаление в мышиной модели псориаза. Аналогичным образом были сконструированы дизайнерские клетки, имитирующие клетки, в которые внедрена цепь, воспринимающая глюкозу путем связывания опосредованного гликолизом входа Ca2+ с индукцией транскрипционной цепи, управляющей экспрессией и секрецией инсулина. При имплантации в мышиную модель диабета сконструированные клетки секретировали инсулин, реагируя на глюкозу, тем самым исправляя дефицит инсулина и в основном устраняя гипергликемию¹²⁶.

Хотя каждый из этих проектов в первую очередь направлен на улучшение специфического для заболевания способа действия, разработки в области синтетической биологии, открывающие путь к повышению клинической и коммерческой жизнеспособности, могут появиться благодаря решению проблем производства и источников клеток, которые, несмотря на то, что представляют собой основное "узкое место", ограничивающее коммерциализацию продуктов, не получили должного внимания. Один из потенциальных подходов может включать схемы, контролирующие избыточную экспрессию транскрипционных регуляторов, которые способствуют развитию благоприятных фенотипов, присущих клеткам, или даже действуют как программы "руководства" дифференцировкой. Такие схемы могут быть использованы для направления иммунных эффекторных клеток на дифференциацию в терапевтически эффективные подмножества, или для содействия дифференциации и экспансии клеток в более жизнеспособные или мощные клеточные продукты. С точки зрения безопасности, можно построить регуляторную схему, использующую цепи, реагирующие на состояние клеток, для определения аберрантных или опухолевых состояний регуляции и активации клеточной гибели. Эта стратегия была успешно использована для создания условных переключателей безопасности у микроорганизмов¹²⁷. В одном из ранних примеров такого подхода была проведена управляемая цепями дифференцировка iPSCs в панкреатические β-подобные клетки с использованием временной экспрессии критических транскрипционных факторов¹²⁸. Такой подход был использован для управления дифференцировкой iPSCs в органоиды печени с помощью индуцируемых схем транскрипционной активации^129,130.

По мере того, как продолжается внедрение вышеописанных стратегий в клинически значимые терапевтические линии, происходит столкновение с двумя основными инженерными проблемами: во-первых, необходима разработка и усовершенствование новых синтетических деталей и схем для распознавания связанных с болезнью физических и биомолекулярных особенностей, создания надежных и настраиваемых схем и их сопряжения с терапевтическими результатами; во-вторых, необходимы стратегии клеточной инженерии, обеспечивающие точную, воспроизводимую доставку схем в популяцию клеток, составляющих терапевтический продукт, для обеспечения стабильного, количественно определенного, воспроизводимого поведения. Что касается первой задачи, то, несмотря на описанный выше прогресс, инженерные схемы регуляции в клетках млекопитающих, как правило, не обладают той степенью контроля и масштабируемости, которая наблюдается в микробных системах. Системы контроля экспрессии генов, доступные для инженерии генных схем у млекопитающих, ограничены в количестве и обладают относительно низкой масштабируемостью. Кроме того, они в основном микробного происхождения (например, TetR, Gal4), что вызывает опасения по поводу их иммуногенности. В будущем использование модульных систем, созданных на основе гуманизированных белков и генов, будет становиться все более приоритетным при применении клеточной терапии. Одним из недавних примеров устранения этого недостатка является создание наборов транскрипционных регуляторов на основе ZF131, функционирующих в клетках человека^132,133. Хотя схемы на основе ZF могут быть масштабированы для поддержки сложного мультигенного регуляторного поведения¹³⁴, эти системы также могут быть использованы для точного, похожего на переключатель, контроля экспрессии¹³⁵.

Еще одним постоянным направлением в этой области будет инженерия поверхностных белков для расширения возможностей клеток по взаимодействию с окружающей средой. Это включает разработку конфигурируемых рецепторов, способных соединять специфические для заболевания входы с эндогенными сигнальными или транскрипционными схемами. Последние разработки в области создания внеклеточных лиганд-чувствительных рецепторов, в дополнение к примерам, описанным выше, включают создание модульных структур для воспроизведения связей между связыванием экзогенных факторов и активацией внутриклеточных сигнальных путей¹³⁶, а также создание CAR, чувствительных к растворимым лигандам цитокинов¹³⁷. Еще одним перспективным подходом является использование экспрессии поверхностных белков для обеспечения ткане- и болезнь-специфического таргетинга. МСК, сконструированные для временной экспрессии одного трансгена, кодирующего PSGL1/SLeXX, поверхностный белок, играющий важную роль в связывании во время воспалительного ответа, продемонстрировали улучшенную локализацию в местах воспаления в мышиных моделях воспаления кожи¹³⁸. В отдельном исследовании на мышах избыточной экспрессия хемокинового рецептора CXCR4 увеличила прикрепление МСК к участкам ишемии сердечной ткани¹³⁹. Эти результаты доклинических исследований позволяют предположить, что изменение профиля экспрессии поверхностных белков клетки - ее "surfaceome" - посредством точной настройки экспрессии нескольких генов является стратегией, которая может предложить мощное средство для улучшения терапевтической потенции и профиля PK/PD. Соединение входящих сигналов от экспрессируемых на поверхности белков с нижележащими сигнальными схемами будет важным расширением инженерии поверхностных белков. Недавний акцент в этой области на инженерии схем на основе белков¹⁴⁰ предоставил детали и основы для проектирования синтетических сигнальных сетей, которые зависят как от фосфорилирования¹⁴¹ , так и от протеолиза¹⁴². Эти конструкции были использованы для создания пост-трансляционных сигнальных путей, способных воспринимать внеклеточную среду и передавать информацию со скоростью, намного превышающей скорость генных цепей (circuits)¹⁴³. Скорость реакции, достигаемая этими цепями, может быть использована для улучшения профилей PK путем включения событий с быстрой временной шкалой, таких как сигнальные сети на основе фосфорилирования¹⁴⁴ или регуляция ионных каналов¹⁴⁵.

Как обсуждалось в предыдущем разделе, раскрытие полного потенциала синтетической биологии потребует преодоления существующих ограничений на размер и соответствующую сложность синтетических схем, которые могут быть эффективно введены в терапевтические клетки. Низкая эффективность трансфекции и низкий потенциал расширения многих первичных типов клеток в сочетании с ограничениями по размеру восстанавливающей матрицы ограничивают интеграцию на основе CRISPR лишь горсткой генов, что затрудняет кодирование сложных функций. В то же время, схемы, вводимые в клетки с помощью ретровирусных и транспозонных векторов, также имеют характерные ограничения по размеру и дополнительно страдают от проблем контроля числа копий, что ограничивает точность и воспроизводимость. Использование рекомбиназно-опосредованной landing pad интеграции - одна из технологий, которая потенциально может повысить точность и воспроизводимость инженерии цепей, позволяя интегрировать большие кассеты трансгенов в определенные геномные локусы в количестве одной копии¹⁴⁶. Однако этот подход затруднен низкой эффективностью интеграции и требует экспансии клеток из небольших субпопуляций, что потенциально снижает потенцию продукта. Усилия по внедрению искусственных хромосом человека¹⁴⁷ или использование крупногеномных вирусов для доставки мультигенных систем представляют собой два других варианта, которые в настоящее время изучаются для преодоления этих барьеров¹⁴⁸ , в то время как использование ранее упомянутых инструментов CRISPR на основе транспозонов может предложить более общее решение для стабильной интеграции сложных схем в будущем. Кроме того, способность поддерживать стабильность трансгена в условиях эпигенетического подавления представляет собой серьезную проблему для синтетической инженерии цепей, но потенциально может быть решена путем использования комбинации оптимизации последовательности и дизайна цепи в сочетании с эпигеномными эффекторами для динамического поддержания "открытого" состояния регуляции хроматина.

Решения для преодоления взаимозависимых проблем инженерии и точной доставки сложных схем в терапевтические клетки позволят синтетической биологии сосредоточиться на разработке программ с многогранной функциональностью, которые могут одновременно кодировать специфический для заболевания способ действия, механизмы безопасности и стабильность схемы, при этом устанавливая и поддерживая соответствующие свойства, присущие клеткам. Кроме того, что немаловажно, эти возможности дадут синтетическим биологам возможность использовать циклы проектирования, создания и тестирования для итеративного сближения синтетических схем, которые являются количественно точными и способны более эффективно удовлетворять потребности конкретных заболеваний и пациентов.

Полупроницаемые биоматериалы и гидрогели использовались для улучшения доставки, для жизнеспособности, удержания и безопасности терапевтических клеток^149-152. Широкий спектр биоматериалов, от разлагаемых гидрогелей до не-разлагаемых пластиков и металлов, был исследован в качестве каркасов для улучшения доставки и жизнеспособности¹⁵², облегчения удержания клеток в определенной полости тела (то есть внутрибрюшинной^149,153, эпикардиальной¹⁵¹ или внутриглазной¹⁵⁴), содействия контролируемому высвобождению^150,152 и обеспечения возможности извлечения для повышения безопасности¹⁵⁵. Эти подходы доказали свою эффективность в улучшении терапевтических результатов клеточной терапии во многих доклинических исследованиях¹⁵⁶ и клинических испытаниях на ранних стадиях^154,155. Однако основной задачей в этой области остается разработка долгосрочных функциональных решений для иммуноизоляции, позволяющих использовать аллогенные клетки.

Несколько типов иммунных клеток играют определенную роль в отторжении аллогенных клеток, что ограничивает разработку готовых продуктов клеточной терапии (рис. 5). CD4+ и CD8+ Т-клетки играют центральную роль в опосредовании отторжения аллогенных клеток через распознавание высоковариантных генных продуктов главного комплекса гистосовместимости (MHC) класса I и MHC класса II¹⁵⁷. Кроме того, клетки врожденного иммунитета, такие как NK-клетки и макрофаги, также могут опосредовать отторжение аллогенных клеток¹⁵⁸. Универсальные iPSC были созданы путем CRISPR-опосредованной делеции генов B2M и CIITA, необходимых для экспрессии генов HLA класса I и HLA класса II. Кроме того, сконструированные iPSCs были дополнительно настроены на экспрессию высоких уровней негативных регуляторов: PDL1, HLA-G и CD47 для блокирования функций Т-клеток, NK-клеток и обеспечения сигнала "не ешь меня" для макрофагов, соответственно. Используя эти стратегии, несколько групп сообщили о создании гипоиммуногенных или "универсальных" iPSCs^89,159, которые сохраняют свой потенциал плюрипотентности и могут дифференцироваться в различные линии, такие как эндотелиальные клетки, кардиомиоциты и даже более сложные органоиды, такие как панкреатические островки^89,160,161. Было установлено, что гипоиммуногенные клетки не вызывают иммунного ответа in vitro и in vivo у доклинических гуманизированных мышей. Хотя эти доклинические данные интригуют, потенциал этих клеток для предотвращения иммунного отторжения у человека еще предстоит определить. Однако в области трансплантации островков в настоящее время планируется или проводится несколько клинических испытаний для определения полезности гипоиммуногенных клеток для клеточной терапии¹⁶².



Fig. 5: Strategies to overcome immune rejection for allogeneic cell therapy.

Schematic representation of current approaches being investigated to overcome immune mechanisms that underlie the rejection of transplanted allogeneic cells. (1) Systemic immunosuppression is the only clinically approved approach, but it results in compromised immunity and risk of malignancy. Several drug regimens and combinations of approaches including treatments with rapamycin and/or glucocorticoids, cyclosporine A and/or cyclophosphamide, cytokine blockade and/or JAK-STAT inhibitors, and B cell depletion with antibodies, are available to enable cell and organ transplantation. (2) Cell encapsulation using biocompatible polymers provides a physical barrier that limits cell-cell contact required for activation and functional lysis by T cells and natural killer (NK) cells. (3) Tolerance induction through direct overexpression of ligands for inhibitory pathways in transplanted cells leads to induction of tolerance. (4) Hypoimmunogenic cells (that is, 'universal' stem cells) generated through CRISPR-mediated deletion of major histocompatibility complex (MHC) molecules and overexpression of CD47 limit T and NK cell-mediated cell killing and limit macrophage-mediated phagocytosis. ADCC, antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity; FC, fragment crystallizable region; IFN, interferon; MAC, membrane attack complex; MHC, major histocompatibility complex; TCR, T cell receptor.

Иммунные механизмы, опосредующие отторжение аллогенных клеток (рис. 5), требуют контакта клетка-клетка. Стратегия, которая активно изучается как в доклинических исследованиях^163-165, так и в клинических испытаниях^166-169, заключается в использовании инкапсуляции клеток донорских аллогенных клеток внутри полу-пористых мембран для обеспечения иммуноизоляции¹⁷⁰. Цель этих усилий - изолировать пересаженные клетки от собственной иммунной системы пациента, обеспечив при этом двунаправленный транспорт растворимых факторов, например, приток питательных веществ, таких как глюкоза и кислород, для поддержания долгосрочного выживания пересаженных клеток, а также экспорт вырабатываемых ими терапевтических белков¹⁷¹. Возможность применения на животных была впервые продемонстрирована с помощью альгинатных гидрогелей для облегчения иммуноизоляции панкреатических островков у крыс⁴⁹. Это исследование показало краткосрочную (несколько недель) функцию пересаженных аллогенных клеток у иммунокомпетентного животного. За прошедшие годы многие усовершенствованные прототипы инкапсулированных клеточных продуктов были оценены в клинике¹⁷² для широкого спектра терапевтических применений на основе клеток, включая офтальмологию¹⁷³, эндокринологию⁵¹, онкологию¹⁷⁴ и неврологию¹⁷⁵. Однако долгосрочное функционирование инкапсулированных клеточных продуктов остается неуловимым из-за иммунной реакции организма на имплантированные биоматериалы, которая приводит к фиброзу и гипоксии внутри устройства¹⁷⁶.

Хотя инкапсуляция продемонстрировала высокую эффективность в предотвращении MHC-опосредованного распознавания аллогенных клеток адаптивным иммунным ответом реципиента и продлении выживания трансплантированных клеток на несколько недель, долгосрочное выживание трансплантированных клеток было ограничено развитием характерной реакции инородного тела (FBR) на инкапсулированные биоматериалы^177,178. FBR включает в себя последовательность процессов, которые начинаются с отложения циркулирующих белков, полученных от хозяина, таких как факторы комплемента и свертывания крови, белки внеклеточного матрикса (ECM) и альбумин¹⁷⁶. Эти белковые отложения способствуют привлечению и прикреплению гранулоцитов и макрофагов. Прилипшие макрофаги могут затем сливаться, образуя гигантские клетки инородного тела, и вырабатывать факторы, которые приводят к привлечению миофибробластов, которые в конечном итоге производят чрезмерное количество профиброгенных и ECM белков, таких как коллаген, что приводит к образованию гранулемы^179,180. При обширном фиброзе диффузия растворимых факторов становится крайне ограниченной, что приводит к гибели пересаженных клеток и неудаче терапии¹⁶³.

Технологии трансплантации, использующие донорские клетки, требуют долгосрочной защиты от FBR и распознавания хозяином. Необходима полупроницаемая гидрогелевая сеть, позволяющая малым молекулам, таким как NO, реактивные формы кислорода (ROS), O₂ и цитокины, циркулировать без усилий, избегая при этом тесного контакта между инкапсулированными клетками и инфильтрирующими иммунными клетками вокруг этих имплантатов. Многочисленные стратегии были использованы для изменения физико-химических свойств биоматериалов, чтобы уменьшить фиброз и способствовать долгосрочному выживанию трансплантата. Было показано, что химия поверхности для настройки свойств поверхности влияет на биологические реакции иммуно-ассоциированных факторов^176,181-184. Для смягчения FBR и предотвращения фиброза применялись различные химические подходы; их обзор приводится в других источниках¹⁷⁸. Однако несколько наиболее передовых технологий, которые ближе к клиническому применению, приведены ниже.

Поверхности гидрогелей были модифицированы иммуномодулирующими малыми молекулами для предотвращения FBR. Была продемонстрирована уникальная стратегия химической модификации гидрогелей на основе альгината с использованием малых молекул для модуляции иммунного распознавания хозяином¹⁸⁴. Внутрибрюшинная имплантация свинцовых материалов мышам показала наименьшее количество FBR , отложение клеток, макрофагов и коллагена для трех аналогов свинца, содержащих в своей химической структуре триазольный каркас, который может играть важную роль в смягчении фиброза. Положительные результаты, наблюдаемые на мышах, были перенесены на не-человекообразных приматов¹⁸⁵. Важно отметить, что ведущие формулы, полученные в результате этого скрининга, привели к разработке SIG-001, двухкамерной сферы с преобразованными человеческими клетками, экспрессирующими человеческий фактор VIII, которая недавно вошла в первое клиническое испытание на человеке при гемофилии А¹⁸⁶. Это пример фенотипического скрининга in vivo, основанного на открытии, для выявления биоматериалов с улучшенным иммунным ответом. Ожидается, что будущие скрининги с использованием аналогичной стратегии могут дать дополнительные ведущие составы или материалы для других желаемых профилей иммунного ответа.

Другим перспективным подходом для облегчения воздействия FBR на биоматериалы является использование биоматериалов с ультранизким обрастанием на основе цвиттерионных соединений. Постулируется, что поглощение белка является ключевым фактором активации иммунитета хозяина и фиброза. Цвиттерионные гидрогели создают супергидрофильный биоинтерфейс, который служит для ограничения поглощения белка^187. Например, гидрогели поли(карбоксибетаинметакрилата) (PCBMA) с ультранизким содержанием белка были подкожно имплантированы мышам с последующим наблюдением за развитием фиброза и воспалительной реакции¹⁸⁸. Исследования показали рост ангиогенных кровеносных сосудов вокруг имплантатов PCBMA, а также присутствие значительного количества макрофагов, что свидетельствует о противовоспалительной экспрессии по сравнению с pHEMA. Эти полимеры также могут применяться в качестве покрытий для снижения иммунных реакций на имплантаты медицинских приборов, провоцирующих иммунные реакции, таких как непрерывные мониторы глюкозы в крови^183,189. Недавно было продемонстрировано, что цвиттерионные сульфобетаиновые модификации альгината смягчают FBR у грызунов, собак и свиней, что позволяет проводить долгосрочную иммуноизоляцию панкреатических островков¹⁹⁰.

Физические свойства, включая размер, форму, морфологию поверхности, шероховатость, топографию и геометрию, биоматериалов играют решающую роль в организации адсорбции белков, прикрепления макрофагов и иммунного ответа хозяина на чужеродные материалы^191-193. Хорошо известно, что топография материала манипулирует прикреплением макрофагов, а фенотип поверхности материала также играет роль в модификации адсорбированного белка путем конформационных изменений^193,194. Топография поверхности биомедицинского имплантата играет решающую роль в поведении и модуляции макрофагов и других иммунных клеток для воздействия на FBR¹⁹⁵. Изменение шероховатости поверхности в нано-масштабе может влиять на более высокую адсорбцию белков, влияя на взаимодействие с иммунными клетками196,197, а различные нано-структурные топографии могут влиять на клеточные взаимодействия181,198. Исследования показали, что отпечатывание решетки на поверхности полимеров вызывает поведенческие изменения макрофагов, независимо от размера решетки или химического состава поверхности. Решетки большего размера, отпечатанные на полимерных поверхностях, влияют на адгезию иммунных клеток к планарным полимерным контрольным поверхностям¹⁹⁶. Оценка сферических имплантатов разного размера у грызунов и приматов показала, что большие имплантаты диаметром 1,5 мм и выше вызывают очень низкий FBR в течение длительного периода in vivo¹⁸¹. Другие отчеты показали, что размер титановых нанотрубок может быть изменен для уменьшения прикрепления макрофагов и снижения FBR¹⁹⁹.

Дизайн химического состава полупроницаемой мембраны и размер пор потенциально могут играть дополнительную роль в повышении иммунозащиты и выживаемости клеток трансплантата²⁰⁰. RGD-функционализированные гидрогели из полиэтиленгликоля (ПЭГ), дополнительно модифицированные пептидами, которые демонстрируют сильное сродство к провоспалительным цитокинам, включая TNFα и MCP1, увеличили выживаемость клеток по сравнению с не-модифицированными гидрогелями ПЭГ²⁰¹. Другие исследователи изучали ограничение транспорта на основе изменения размера пор для исключения эффекторных иммунных молекул, таких как цитокины²⁰². Более поздние исследования показывают, что предельный размер пор 1 мкм или менее достаточен для исключения проникновения Т-иммунных клеток, при этом обеспечивая проницаемость для макрофагов, что позволяет повысить жизнеспособность и долгосрочную защиту трансплантата от иммунной системы¹⁶⁴. Проницаемость для макрофагов также может способствовать удалению остатков клеток и васкуляризации для повышения жизнеспособности¹⁶⁴. Эти многофакторные конструктивные соображения должны быть дополнительно изучены в будущих конструкциях устройств для разработки улучшенных решений по инкапсуляции клеток.

Системы инкапсуляции клеток больших размеров (т.е. макроустройства) обладают потенциальными преимуществами в плане безопасности, поскольку их можно сконструировать так, чтобы их можно было извлечь после имплантации²⁰³. Это преимущество было использовано для продвижения источников клеток с более высокими оценками риска безопасности (то есть клеток, полученных из стволовых клеток или трансформированных клеток), которые потенциально способны к опухолеобразованию или образованию тератомы, в клинические испытания на людях (NCT02239354). Макро-устройства обеспечивают улучшенный контроль над конструктивными особенностями, такими как химический состав полимера, размер пор и пористость мембраны, а также общие размеры устройства. Однако при увеличении размера устройства диффузия питательных веществ и кислорода к инкапсулированным клеткам уменьшается, что приводит к клеточному некрозу²⁰⁴. Кроме того, большая емкость для клеток может препятствовать диффузии лечебных препаратов из устройства. Для таких применений, как трансплантация островковых клеток, в которых чувствительность к глюкозе и кинетика высвобождения инсулина должны жестко регулироваться в соответствии с физиологическими потребностями, макро-размеры устройств создают ограничения²⁰⁵.

Для улучшения жизнеспособности клеток и функционирования систем инкапсуляции макро-устройств необходимо включить конструктивные особенности, способствующие васкуляризации. Первоначальные подходы к решению этой проблемы включали загрузку имплантируемых конструкций ангиогенными факторами, но стало ясно, что одних этих молекул недостаточно для стимуляции значимого ангиогенеза²⁰⁶. Имплантация конструкций, содержащих каналы, засеянные эндотелиальными клетками, оказалась гораздо более эффективной стратегией для стимулирования ангиогенеза^207,208. Целью этих каналов часто является слияние с сосудистой сетью хозяина. Как только это произойдет, клетки внутри конструкции получат лучший доступ к питательным веществам из кровотока. Эти искусственные каналы часто засевают эндотелиальными клетками, чтобы ускорить приживление сосудов в крупных биосовместимых материалах. Последние достижения в фотополимеризации гидрогелей с использованием новых биосовместимых химических реакций позволяют перерасти методы 3D-биопечати^209,210. Важно отметить, что в этих отчетах подчеркивается возможность печати организованных тканевых конструкций для создания кровеносных сосудов и организованных органоидов для применения в восстановлении легких, сердца и печени^211-213. Сосудистые архитектуры, разработанные для 3D-печати, могут быть либо изготовлены на заказ для настройки, либо получены из вычислительных моделей для повышения жизнеспособности и автономности^214,215. Такой тонкий уровень контроля архитектуры необходим, поскольку ткани и органы часто содержат сосудистую сеть разного диаметра²¹⁶. Размер сосудистых каналов имеет решающее значение с физиологической точки зрения - фенотип эндотелиальных клеток в значительной степени зависит от напряжения сдвига, которое при постоянной объемной скорости потока и вязкости жидкости определяются диаметром канала²¹⁷.

Наконец, биоматериалы могут быть использованы в качестве строительных лесов для облегчения интеграции в ткани хозяина после введения^218,219. Натуральные биоматериалы, полученные из животных источников, или синтетические полимеры, включая коллаген, PLGA, PCL и цитрат, были использованы в нескольких одобренных клеточных продуктах, представленных сегодня на рынке. Например, бесклеточный дермальный матрикс, полученный из трупной человеческой кожи, используется в сочетании с жировыми трансплантатами в процедурах реконструкции груди для улучшения локализации и выживания пересаженных жировых клеток²²⁰. Коллаген был использован для облегчения организации композитных типов клеток в тканевых трансплантатах, таких как кожные трансплантаты, в коммерческом продукте Epigraft²²¹. Совсем недавно для восстановления ткани миокарда после инфаркта использовали коллагеновый лист, содержащий клетки эпикарда, полученные из стволовых клеток, в сочетании с кардиомиоцитами, полученными из стволовых клеток²²².

В будущем мы ожидаем, что биоматериалы можно будет использовать для получения расширенных функциональных возможностей, например, в качестве преобразователей сигналов для активации функций клеток. Ранние технико-экономические испытания на животных показывают, что внешние исполнительные механизмы, генерирующие силы, проницаемые для тела, включая ультразвук^223,224, магнитные поля²²⁵ и электронные входящие импульсы²²⁶, могут быть использованы для дистанционного регулирования активности клеток. Эти технологии все еще находятся в зачаточном состоянии, и для их дальнейшего развития необходимы усовершенствования в области генерации и захвата внешних сигналов.

Учитывая последние достижения в области клеточной терапии, очевидно, что инженерные дисциплины, описанные в данном обзоре - редактирование генома и эпигенома, синтетическая биология и опосредованная биоматериалами иммунная модуляция - будут играть все большую роль в создании новых линий продуктов с улучшенной безопасностью, эффективностью и доступностью для пациентов. Последние научные достижения не только продемонстрировали потенциальное влияние технологий, разработанных в каждой из этих областей, но и определили потенциальные пути преодоления грандиозных проблем, которые в настоящее время ограничивают более широкую коммерциализацию клеточной терапии. Мы ожидаем, что эти технологии будут продолжать совершенствовать конвейеры аутологичной клеточной терапии (например, CAR-T терапии), предлагая улучшения в способе действия и производстве. Однако, вероятно, что наибольшее влияние на развитие продуктов окажут инновации, позволяющие повысить потенцию и жизнеспособность аллогенных продуктов, которые легче найти и произвести.

Помимо независимого вклада инженерных подходов, описанных в данном обзоре, мы предвидим синергию между дисциплинами, играющими важную роль в продвижении клеточной терапии. Стратегии редактирования генома и эпигенома будут продолжать использоваться для улучшения свойств, присущих клеткам, а новые варианты белков Cas, которые будут обнаружены и сконструированы, создадут возможности для создания все более масштабных и сложных генетических возмущений. Эти возможности позволят всесторонне, на системном уровне перестраивать родные клеточные пути и изменять фенотип клеток, потенциально создавая продукты, устойчивые к апоптотическим сигналам, демонстрирующие повышенную жизнеспособность и потенциал расширения на всех этапах производства или способные секретировать более высокие терапевтические титры белков. Продвижение этих возможностей откроет способность синтетической биологии к созданию функциональности, позволяющей динамически контролировать эти характеристики с помощью сложных регуляторных схем. Хотя эти возможности могут улучшить аутологичную клеточную терапию, их влияние на терапию, основанную на источниках аллогенных клеток, может быть даже более значительным, учитывая потенциал сложных, многомодульных синтетических программ, которые могут быть использованы для разработки повышенной эффективности в легкодоступных, но в противном случае низкопотенциальных продуктах.

Достижения в области биоматериалов уже способствовали разработке нескольких аллогенных инкапсулированных клеточных продуктов, и в настоящее время существует несколько компаний, находящихся на клинической стадии, которые разрабатывают инкапсулированные клеточные продукты для лечения диабета 1 типа, эндокринологических показаний и орфановых заболеваний. Мы ожидаем, что в будущем инкапсулированные клеточные препараты будут применяться в новых областях, используя инновации в области редактирования генома и/или эпигенома и синтетической биологии, для разработки продуктов с большей продолжительностью жизни и расширенными возможностями "чувствовать и отвечать", которые обеспечивают более точное пространственное и временное регулирование терапевтической активности при заболеваниях, в зависимости от стадии и пациента. Такие программируемые на заказ устройства на основе клеток могут быть использованы в качестве дозорных для мониторинга, модуляции и отчетности о колебаниях физиологии пациента, улучшая управление хроническими заболеваниями, такими как эндокринные или аутоиммунные расстройства.

Одна из наиболее интересных долгосрочных возможностей для синергии инженерных подходов к решению грандиозных задач клеточной терапии заключается в разработке терапевтических линий, включающих готовые продукты, полученные из стволовых клеток, которые могут быть разработаны на заказ для лечения различных заболеваний. Дозы этих "универсальных" продуктов клеточной терапии могут генерироваться по требованию путем извлечения из хранилища, расширения и дифференциации в зрелые эффекторные типы клеток, обеспечивая тем самым постоянно пополняемый источник клеток, специфичных для конкретного заболевания. Хотя для реализации этой идеи необходимо преодолеть серьезные барьеры фундаментальных исследований, потенциальные преимущества такого подхода многочисленны. Поскольку плюрипотентные клетки в целом поддаются повторяющимся и крупномасштабным генетическим манипуляциям, редактирование генома и/или эпигенома и подходы синтетической биологии могут быть полностью использованы для создания сложных и специализированных функций. Помимо того, что такие клетки могут быть настроены на иммунное уклонение или точное соответствие подтипу HLA, они могут содержать синтетические регуляторные программы, которые точно определяют дифференцировку в эффекторные клетки, специфичные для заболевания, или обеспечивают возможность проживания в каркасе биоматериала. Кроме того, эти клетки могут быть запрограммированы с помощью специализированных модулей "чувствовать и отвечать", которые повышают потенцию и безопасность, а также позволяют программировать возможности настройки в полевых условиях для гибкого решения проблем, связанных с различными заболеваниями и пациентами.