Тераностика нуклеиновых кислот вызывает значительный интерес при лечении различных заболеваний. Среди них - новые тераностики на основе циркулярных нуклеиновых кислот, включая циркулярную РНК (circRNA) и одноцепочечную циркулярную ДНК (circDNA) (следует отличать от двухцепочечной плазмидной ДНК). В этом обзоре мы сосредоточимся на обсуждении одноцепочечной циркулярной ДНК, но не циркулярных РНК, которые продемонстрировали уникальные иммуномодулирующие свойства ¹ и которые пытались разработать в качестве вакцин против SARS-CoV-2 ². Одноцепочечная circDNA - это класс ssDNA с ковалентно-замкнутой топологией. Природная circDNA была обнаружена в геномах некоторых вирусов человека, животных и растений. Эти природные одноцепочечные circDNA встречаются только в вирусах, которые обычно состоят из генома небольшого размера (10 килобаз или кб) и капсидных белков без липидной оболочки ^3-5. circDNA-вирусы, признанные в настоящее время Международным комитетом по таксономии вирусов (ICTV), включают семь семейств: Anelloviridae, Geminiviridae, Inoviridae, Microviridae, Nanoviridae и Parvoviridae, которые могут заражать позвоночных, растения и даже человека ^3-9. Вирусы circDNA могут быть моночастичными, двучастичными или многочастичными. Организация генома этих вирусов варьируется между родами: некоторые из них имеют ambisense организацию генома, например, цирковирусы, в то время как другие имеют отрицательную организацию генома, например, anelloviruses и gyroviruses. Было показано, что многие вирусы с циркулярной ДНК эволюционно связаны между собой с помощью гена circular replication-associated protein (Rep), который отвечает за инициацию репликации вирусного генома посредством репликации по окружности ¹⁰. Одноцепочечные вирусные векторы circDNA могут быть использованы в качестве вакцин для экспрессии рекомбинантных вакцинных антигенов и моноклональных антител. Многие современные вакцины получены на основе генотипа porcine circovirus type 2a (PCV2a) или его капсидного белка ¹¹, и признаны весьма успешными в снижении бремени заболеваний, обнаруженных до введения вакцины. Существующие вакцины эффективно вызывают гуморальный и клеточно-опосредованный иммунитет против PCV2 ^12-14. Кроме того, длинная циркулярная одноцепочечная вирусная ДНК, полученная из бактериофага M13mp18, может быть использована в качестве основы для формирования различных форм ДНК-оригами, что произвело революцию в области ДНК-нанотехнологий, повысив сложность и размер самособирающихся ДНК-наноструктур с помощью простой реакции "one-pot" ¹⁵.

В дополнение к природной circDNA, синтетическая circDNA недавно стала использоваться для исследований и разработки лекарств ¹⁶. По сравнению с природной circDNA, синтетическая circDNA может быть синтезирована в основном с помощью ДНК-лигаз с индивидуальными длинами и последовательностями для универсального применения в тераностике. Отсутствие концов в circDNA предотвращает деградацию экзонуклеазой, что приводит к повышенной биостабильности по сравнению с линейной ssDNA. Например, используя шаблон circDNA, короткий праймер ДНК или РНК может быть амплифицирован с образованием длинной одноцепочечной ДНК или РНК путем rolling circle replication (RCR или RCT) ¹⁶. Получаемые продукты представляют собой конкатемерные ДНК (для RCR) и РНК (для RCT), содержащие до сотен тандемных повторов, комплементарных матрице circDNA. Простота и программируемость этих технологий амплификации ДНК сделали их привлекательными для биомедицинских исследований и приложений. Более того, поскольку продукты RCR и RCT можно конструировать на основе матриц circDNA, RCR и RCT использовались для создания сложных наноструктур ДНК, таких как наноструктуры ДНК ¹⁷, нанотрубки ¹⁸, нанонити ¹⁹ и метаматериалы на основе ДНК ²⁰. Эти нанотехнологии использовались для биоанализа, доставки лекарств, биоэлектронных схем и биосепарации. Кроме того, все большее развитие получают исследования по применению circDNA-зондов, таких как аптамеры, в тераностике. И наконец, в последнее время circDNA применяется для генетических манипуляций и редактирования с помощью таких систем, как система CRISPR-Cas и ингибиторы микроРНК (miRNA). В этой обзорной статье мы обсудим дизайн, методы синтеза, а также разностороннее применение circDNA в тераностике (рис. 1).



Figure 1 Schematic depiction of single-stranded circDNA theranostics. circDNA has been commonly used as theranostic aptamers, templates for DNA nanostructures, scaffolds for versatile DNA origami, miRNA inhibitors, as well as CRISPR-Cas gene editing donors.

Аптамеры - это короткие ssDNA или ssRNA, которые могут избирательно связываться со специфическими мишенями, включая белки, пептиды, углеводы, малые молекулы, токсины и даже живые клетки ²¹. Аптамеры принимают уникальные трехмерные конфигурации, которые являются основой для селективного связывания с когнитивными мишенями. Аптамеры обычно создаются с помощью эволюционной технологии, называемой систематической эволюцией лигандов путем экспоненциального обогащения (SELEX), с использованием олигонуклеотидной библиотеки с миллионами рандомизированных последовательностей ДНК ²¹. После получения последовательностей ДНК-аптамеров методом SELEX, аптамеры могут быть химически синтезированы в больших масштабах для применения в тераностике. Линейные аптамеры подвержены деградации экзонуклеазой и могут быть ограничены промежуточной чувствительностью биосенсоров на основе аптамеров. Из-за отсутствия концов ДНК, аптамеры circDNA повышают биостабильность по сравнению с соответствующими линейными аптамерами ДНК. Кроме того, для повышения чувствительности биоанализа в биосенсорах на основе аптамеров были использованы шаблоны аптамеров из circDNA и RCR.

Циклизация аптамеров может улучшить их термическую стабильность, устойчивость к нуклеазе и сродство связывания. Кроме того, флуоресцентная визуализация in vivo показала эффективное накопление и удержание аптамеров circDNA в опухолях по сравнению с линейными аптамерами, что обеспечивает простую и эффективную стратегию улучшения фармакокинетики и, следовательно, опухолевой тераностической эффективности ДНК-аптамеров. В одном примере, путем циклизации двух аптамеров Sgc8, распознающих биомаркер рака протеин-тирозинкиназу 7 (PTK7) ²², полученный бивалентный аптамер circDNA (cb-apt) с двумя идентичными клеточно-специфичными аптамерами показал повышенную устойчивость к нуклеазе и более высокую способность связывания in vivo, по сравнению с мономерами. В другом примере биспецифический аптамер circDNA ²³ образован из 1) анти-His метки аптамера, который связывается с biorthogonal six polyhistidine tag (His метка) на функциональных белках (Рисунок)2A) ²³, и 2) биомаркера рака, PTK7-специфического аптамера Sgc8. Полученный бивалентный аптамер circDNA способствовал целевой доставке функциональных белков в PTK7-позитивные клетки-мишени, повышая их общую биоактивность в клеточной среде примерно в 4 раза. Далее бивалентные аптамеры circDNA, конъюгированные с β-циклодекстрином (CD), способствовали целевой внутриклеточной доставке функциональных белков, загруженных в β-CD-конъюгированный аптамер circDNA посредством химии "хозяин-гость" ²⁴. Полученный аптамер circDNA продемонстрировал высокую стабильность в сыворотке крови и повышенную эффективность внутриклеточной доставки по сравнению с мономерным аптамером. Более того, для изучения аптамера circDNA для адресной доставки лекарств был разработан бивалентный аптамер circDNA - конъюгат лекарств (ApDCs) (Рисунок (Рисунок2B)2B), который продемонстрировал высокую биостабильность, специфическое распознавание мишени, отличное поглощение клетками и высвобождение лекарств под действием эстеразы ²⁵, что делает этот аптамер circDNA перспективной платформой для разработки систем адресной доставки лекарств против рака. Помимо использования аптамеров circDNA для распознавания когнитивных молекул, аптамеры circDNA также были изучены для связывания с клеточными мишенями. Например, биспецифические аптамеры circDNA были сконструированы из двух аптамеров, которые связываются с нативными Т-клетками и опухолевыми клетками, соответственно, что привело к созданию аптамера circDNA, который может одновременно связываться с двумя различными типами клеток и приводить эти два типа клеток в непосредственную близость (Рисунок 2C) ²⁶. После накопления Т-клеток в опухоли, опосредованного биспецифическими аптамерами нативных Т-клеток и опухолевых клеток, Т-клетки в месте опухоли впоследствии активировались in situ с помощью активатора Т-клеток CD3/CD28, чтобы вызвать гибель опухоли. Благодаря использованию различных раково-специфических аптамеров, эта стратегия "распознавание - затем активация" имеет потенциал для целенаправленного лечения других типов рака. Наконец, в дополнение к тераностическому применению при раке, аптамер circDNA был изучен для адресной доставки лекарств при лечении нейродегенеративных заболеваний. В частности, круговой бифункциональный аптамер circDNA был синтезирован из 1) аптамера, нацеленного на рецептор трансферрина (TfR), который облегчает TfR-индуцированный трансцитоз через эндотелиальные клетки в гематоэнцефалическом барьере (BBB), и 2) аптамера, специфичного для белка tau, который ингибирует фосфорилирование tau и связанные с тауопатией патологические явления в мозге. Полученный бифункциональный аптамер circDNA усилил проникновение в ВВВ in vivo для терапии тауопатии ²⁷. В совокупности эти исследования показали потенциал аптамеров circDNA для облегчения их тераностического применения.



Figure 2 circDNA aptamers for versatile disease theranostic applications. (A) Synthesis scheme of bispecific circDNA aptamer for bispecific recognition of His tagged protein cargoes and PTK7 on targeted cells. Reprinted from 23, copyright (2020) The Royal Society of Chemistry Publishing Group. (B) Preparation of bivalent circDNA ApDCs with accurate tunability of drug ratios for drug combination cancer therapy (DCCT). Reprinted from 25, copyright (2019) The Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim. (C) Schematic illustration of the bispecific circDNA aptamer and (b) its molecular-mediated "recognition-then-activation" for targeted immunotherapy. Reprinted from 26, copyright (2020) The American Chemical Society Publishing Group.

Rolling circle amplification (RCA), такая как RCR и RCT, представляет собой изотермический процесс амплификации нуклеиновых кислот, который синтезирует длинные одноцепочечные нуклеиновые кислоты в результате непрерывной и однонаправленной репликации шаблонов circDNA ^{16, 28}. Таким образом, RCA может усилить одно событие связывания молекул на три порядка, что делает его идеальным для многочисленных приложений, требующих сверхчувствительного обнаружения. В таких анализах обычно используются иммобилизованные антитела или аптамеры для захвата целевых молекул из растворов образцов. Затем вводятся аптамеры, содержащие праймерную область для отжига к circDNA RCA, для связывания с захваченными молекулами-мишенями. Несвязанные аптамерные зонды смываются перед РКА. Затем продукты РКА детектируются с помощью различных методов генерации сигнала. Например, на основе структурного выделения двух тромбин-связывающих ДНК-аптамеров, каждый из которых распознает тромбин в разных местах, один из аптамеров был преобразован в circDNA ²⁹. В отсутствие тромбина дуплекс был слишком слаб для образования; напротив, когда тромбин присутствовал, оба аптамера связывались с одной и той же молекулой тромбина, что приводило к образованию ДНК-дуплекса и запускало процесс РСА для усиления сигнала и, следовательно, чувствительного обнаружения тромбина.

Аптамеры также могут быть разработаны для прямого запуска RCA. Yang и др. разработали аптамер с переключаемой структурой, который может циркулировать при связывании с мишенью (Рисунок 3A)³⁰. К 3'-концу аптамера для тромбоцитарного фактора роста BB (PDGF-BB) была добавлена последовательность в 13-nt . Эта 13-нт последовательность была комплементарна аптамеру и нарушала связывающую вторичную структуру анти-PDGF-ВВ аптамера, образуя шпильку. Аптамер был дополнительно модифицирован путем добавления 6-нт последовательности к его 5'-концу и изменения линкерной последовательности таким образом, что связывание с мишенью приводило к закрытому лигирующему узлу. Таким образом, при ферментативном лигировании образовывалась circDNA, которая служила шаблоном для RCA. Этот аптамер с изменяющейся структурой был использован для гомогенного обнаружения PGDF-BB, при этом предел обнаружения составил 0,4 нМ. Другая группа описала чувствительный сэндвич-анализ на основе аптамеров для обнаружения белков на микропланшетах с использованием RCA в сочетании с катализом тромбина (Рисунок 3B)³¹. Этот анализ использует преимущества RCA для создания длинной ДНК с повторяющимся тромбин-связывающим аптамером для многократного маркирования тромбином, который затем способствует ферментативной активности тромбина для генерации сигнала. Они применили эту стратегию для обнаружения PDGF-BB в качестве модельного белка-мишени. Благодаря двойному усилению сигнала от катализа РКА и тромбина, этот анализ позволил обнаружить PDGF-BB на уровне 3,1 пМ при использовании флуорогенного пептидного субстрата. В другом исследовании, поскольку ДНК-аптамеры могут абсорбироваться на оксиде графена (GO) и диссоциировать при связывании аптамеров с мишенью, Li и соавторы разработали гомогенный анализ для усиленного обнаружения белков и малых молекул с использованием GO (Рисунок 3C)³². Когда аптамеры, состоящие из праймеров RCA, адсорбировались на поверхности GO, RCA был отключен из-за недоступности праймеров RCA. Связывание молекул-мишеней с аптамерами освобождало аптамеры от GO, тем самым открывая праймеры для отжига шаблона RCA и инициации RCA. Анализ был использован для чувствительного обнаружения тромбина и АТФ в качестве модельных мишеней.



Figure 3 Aptamer-integrated circDNA for sensitive bioanalysis. (A) RCA assay using a structure-switching aptamer that circularizes upon target binding. Reprinted from 30, copyright (2007) The American Chemical Society Publishing Group. (B) Schematic of the aptamer assay for protein detection using RCA coupled with thrombin catalysis. Protein target is captured by an antibody coated on microplate, and then bound with the conjugate of aptamer-primer in which the aptamer binds to a protein target. The template encoding complementary sequence of the thrombin aptamer hybridizes with the primer, and is circularized by ligase to form circDNA as the templates of RCA. The resulting long DNA generated from RCA binds with multiple thrombin molecules, achieving multiple thrombin labeling in sandwich complex. Thrombin catalyzes the cleavage of small peptide substrates into detectable product. Reprinted from 31, copyright (2016) Springer-Verlag Berlin Heidelberg. (C) RCA-mediated assay based on target binding-induced desorption of aptamers from GO. Reprinted from 32, copyright (2014) The American Chemical Society Publishing Group.

Прокариотические системы редактирования генома CRISPR-Cas изменили нашу способность манипулировать, обнаруживать, отображать и аннотировать специфические последовательности ДНК и РНК в живых клетках различных видов ³³. Простота использования и надежность этой технологии произвели революцию в редактировании генома для фундаментальных исследований, а также для тераностики заболеваний, среди прочих ³³. В качестве ключевого элемента редактирования генома донорская ДНК вводит желаемую экзогенную последовательность, работая при этом с другими важнейшими механизмами, такими как CRISPR-Cas или рекомбиназы. Хотя редактирование генома стало революционным благодаря появлению нуклеаз на основе CRISPR, трудности в достижении эффективной, опосредованной нуклеазами, гомологом-направленной репарации (HDR) могут ограничивать их применение. Обычно используемые доноры ДНК, такие как плазмиды, страдают от низкой эффективности HDR во многих типах клеток, а также от интеграции в непредусмотренные геномные сайты ³⁴. Следовательно, существует значительный интерес к разработке методов создания длинных шаблонов ssDNA в качестве доноров для целевых вставок в ДНК в клетках млекопитающих. Эксперименты с донорской ssDNA давали от 10 до 100% частоты рекомбинации для точечных мутаций ³⁵. Несколько последних стратегий получения такой ssDNA включают асимметричную ПЦР, опосредованное ферментом "Strandase" удаление одной нити линейного шаблона dsDNA, использование пар nicking-эндонуклеаз с последующей гель-экстракцией полученной ssDNA и подходы к получению ssDNA на основе обратной транскрипции (RT) ^36-38. Большинство из этих подходов требуют дорогостоящей и трудоемкой очистки для обеспечения полного удаления усеченных продуктов ssDNA. В частности, с помощью RT-подходов сложно генерировать точные доноры ssDNA длиной более 3-4 kb, особенно в больших молярных количествах, из-за отсутствия корректирующей активности и ограниченной технологичности обратных транскриптаз.

В качестве альтернативы Mir и др. использовали одноцепочечную circDNA, полученную из phagemids, в качестве шаблоны для HDR-опосредованной интеграции ДНК-кассеты ³⁹. Эти доноры circDNA служат эффективными матрицами (шаблонами) HDR при использовании в CRISPR-Cas9 и CRISPR-Cas12a, с частотой интеграции, превосходящей линейные шаблоны доноры ssDNA (Рисунок 4A). Затем они расширили анализ матриц ДНК для оценки эффективности нокаутов флуоресцентных меток на эндогенных сайтах в клетках HEK293T и K562. Результаты показали, что доноры (матицы) circDNA приводили к эффективной и надежной вставке репортерных меток. Доноры circDNA также превосходили линейные доноры ssDNA в репарации на основе шаблона в целевом сайте. Эти данные демонстрируют, что доноры circDNA обеспечивают эффективный, экономически выгодный метод достижения knock-ins редактированием генов с помощью CRISPR-Cas в клеточных линиях млекопитающих. В другом примере Qi и др. использовали RCR- и Cas9-опосредованный синтез ssDNA in vivo (Рисунок 4B)⁴⁰. Одногенный RCR из грам-отрицательных бактерий был сконструирован для получения одноцепочечной ssDNA из грам-положительной родительской плазмиды в разработанной последовательности в Escherichia coli. Кроме того, желаемый линейный фрагмент ssDNA может быть вырезан с помощью CRISPR-Cas9 и объединен с рекомбиназой лямбда Red в качестве донора для точного геномного преобразования. Эти исследования продемонстрировали пригодность circDNA для редактирования генома.



Figure 4 circDNA as donors in genome editing. (A) Comparisons of the activity of different DNA donors in HCR using the Traffic Light Reporter Multi-Cas Variant 1 (TLR-MCV1) cassette in human cells. circular ssDNA (cssDNA) and T-lssDNA (lssDNA: linear ssDNA) donor template-mediated HDR efficiency is dose dependent. The graph shows the percentage of GFP-positive cells as a function of increasing cssDNA and T-lssDNA donor DNA in the presence of SpyCas9 and AspCas12a proteins in TLR-MCV1 K562 cells (left) and HEK293T cells (right). Reprinted from 39. (B) RCA-Cas-mediated genome editing in vivo. The mechanism of the production of linear ssDNA. SpCas9-mediated DNA cleavage of the targeted circDNA, in the absence of a protospacer adjacent motif (PAM) sequence. Right image: photographs of the plates showing the effect of linear ssDNA synthesis for gene editing using pRC22. Passage 1, the first round of culture for introducing the allele substitution (11 bp substitution in the lacZ gene); Passage 10, the tenth round of culture for introducing the allele substitution (11bp substitution in the LacZ gene). Reprinted from 40, copyright (2020) The MDPI Publishing Group.

ДНК-нанотехнологии широко исследовались для различных тераностических применений ⁴¹, таких как внутриклеточная доставка тераностиков нуклеиновых кислот ⁴². Однако голая ДНК не может проникнуть через клеточную мембрану и подвержена деградации нуклеазами в сыворотке или цитоплазме ⁴². Нанобиотехнологии открыли беспрецедентные возможности для доставки универсальных тераностических агентов, включая нуклеиновые кислоты. Наноструктуры ДНК недавно стали использоваться в качестве носителей для доставки лекарств ⁴¹. В этом разделе мы обсудим применение circDNA в качестве шаблонов для синтеза ДНК-биоматериалов, таких как ДНК-оригами, ДНК-наноцветы и ДНК-гидрогель (рисунок (Рисунок5).



Figure 5 circDNA as templates to synthesize multiscale (nano-, micro-, and macro-) DNA biomaterials. (A) Doxorubicin-loaded DNA origami for drug delivery. The long single-strand M13mp18 genomic circDNA scaffold (blue) was folded into the triangle and tube structures through the hybridization of rationally designed DNA staple strands. Doxorubicin was loaded into DNA origami via dsDNA intercalation. Reprinted from 43, copyright (2012) The American Chemical Society Publishing Group. (B) Schematic diagram of the stepwise approach for DNA hydrogel synthesis. The multi-step RCA processes were carried out as follows: (i) In the R process, a circDNA template was first produced, then a complementary primer for RCA (Primer 1) was added to produce elongated ssDNA products (termed ssDNA 1: tandem repeats of the sequences complementary to the original circular ssDNA template), and (ii) In the M process, after RCA, two additional primers (Primer 2 and Primer 3) were added for subsequent chain amplification. Reprinted from 20, copyright (2012) The Nature Publishing Group.

ДНК-оригами произвело революцию в области структурной ДНК-нанотехнологии, повысив сложность и размер самособирающихся ДНК-наноструктур с помощью простой реакции "one-pot "⁴⁴. В ДНК-оригами длинный каркас циркулярной ДНК складывается в различные формы сотнями синтетических сшивок ДНК, которые связываются с различными участками вдоль каркаса циркулярной ДНК, в результате чего получаются наноструктуры ДНК-оригами с четко определенными размерами и морфологией ¹⁵. Например, различные оригами могут быть программно самособраны из каркаса circDNA генома бактериофага M13mp18, состоящего из 7249 нуклеотидов, а также сотен коротких сшивающих ДНК ⁴⁵. Хотя было синтезировано множество различных наноструктур ДНК-оригами, растущая потребность в большем количестве структур ДНК-оригами была ограничена фиксированной последовательностью и размером квркаса. Чтобы расширить биомедицинское применение ДНК-оригами, были изучены методы ПЦР и геномного пошива для дизайна строительных лесов 46. Кроме того, ДНК-оригами используется для получения различных 2D и 3D наноструктур, а также для наноразметки наночастиц, белков и других функциональных молекулярных компонентов в четко определенные формы ⁴⁵. Химически модифицированные скрепы ДНК могут быть вставлены в заранее определенное положение в ДНК-оригами, придавая тем самым дополнительные функциональные свойства ДНК-оригами. ДНК-оригами обеспечивает большую гибкость в функциональности и, вероятно, большую биостабильность ^{43, 47}. Например, используя иммуностимулирующую ДНК CpG в качестве модельного препарата, нанонити ДНК могут быть загружены CpG посредством гибридизации ДНК для внутриклеточной доставки CpG. В результате ДНК-нанонити, модифицированные несколькими CpG-мотивами, проявили более высокий иммуностимулирующий эффект, о чем свидетельствует эффективная выработка воспалительных цитокинов опухолевого некротического фактора альфа ^{41, 47-49}. Аналогичным образом, пространственно адресуемые наноструктуры ДНК-оригами были изучены в качестве системы переноса лекарств (Рисунок 5A) ⁴³. При использовании ДНК-оригами в качестве средств доставки лекарств, клеточная интернализация доксорубицина была увеличена, что способствовало значительному усилению клеточно-киллерной активности устойчивых к доксорубицину клеток MCF-7. Эти результаты указывают на потенциал ДНК-оригами как эффективного средства доставки лекарств.

ДНК и пирофосфат, высвобожденные в результате полимеразных реакций, таких как РКА, могут образовывать компактные органическо-неорганические композитные ДНК-наноцветы (NFs) ⁵⁰. В отличие от ключевой роли сопряжения оснований ДНК в формировании ДНК-наноструктур, сборка NFs не зависит от гибридизации ДНК. Кроме того, в отличие от других наноструктур ДНК, NFs имеют уникальную внутреннюю и внешнюю морфологию (Рисунок 6) ⁵¹. NFs могут быть собраны с помощью строительных блоков ДНК методом RCA (т.е. RCR и RCT) с использованием шаблонов circDNA, необязательных праймеров ДНК ⁵². Благодаря плотной упаковке ДНК, NFs устойчивы к деградации нуклеазой, диссоциации, термической или химической денатурации. Недавно NFs-блуминг (помутнение) было использовано для разработки простой и чувствительной электрохимической системы биорегистрации. В этой системе NFs blooming в наноканальцах был настроен таким образом, чтобы возникать при связывании целевой миРНК мишени, после чего происходит связывание шаблона circDNA и специфического праймера с захваченной миРНК, что вызывает RCA и расцвет (blooming) NFs в наноканальцах. Образование NFs увеличивает стерические препятствия в канальцах, что уменьшает анодный ток ферроцианида калия (K₃[Fe(CN)₆]), тем самым усиливая сигналы электрохимического детектирования ⁵¹. В дополнение к отличной биостабильности, NFs демонстрируют отличную фотостабильность, как показано на примере конъюгированных с аптамерами многоцветных NFs с флуоресцентным резонансным переносом энергии (FRET)⁵³. Более того, были разработаны иммуно-наноцветы для устойчивости к нуклеазе и эффективной доставки CpG ⁵⁴. Было установлено, что NFs CpG являются мощными иммуностимуляторами, стимулирующими различные клетки к секреции способствующих воспалению цитокинов. Более того, pH-реактивные многофункциональные ДНК NFs, содержащие таргетные аптамеры мишени, флуорофоры и молекулы Dox, были использованы для предотвращения утечки лекарств и улучшения их удержания в клетках с MDR, таким образом, обходя MDR (Рисунок 6) ^{52, 55}. Кроме того, с помощью наносистемы NFs были созданы синергетические нановакцины для иммунотерапии рака. Наносистема NFs состояла из переплетающихся ДНК-РНК нанокапсул (iDR-NCs), конъюгированных с ДНК CpG, Stat3-нацеленным на с РНК короткими шпильками (shRNA), а также опухолеспецифических пептидных неоантигенов. shRNA в iDR-NCs синергетически активировали антиген-презентирующие клетки (APCs), праймировали (primed) неоантиген-специфические CD8+ Т-клетки, индуцировали Т-клеточную память и заметно подавляли прогрессию неоантиген-специфических колоректальных опухолей ⁵⁶.



Figure 6 circDNA-mediated synthesis of DNA NFs for synergistic tumor immunotherapy. (A) Concurrent RCR and RCT in the same solution generated tandem CpG and Stat3 shRNA, which were self-assembled into intertwining DNA-RNA MFs. (B) The above MFs were shrunk by PPT-g-PEG to form iDR-NCs, which was further loaded with tumor-specific neoantigen via hydrophobic interactions between peptide antigens and hydrophobic PPT moieties. (C) iDR-NC/neoantigen elicited potent and durable neoantigen-specific T cell responses. Representative flow cytometry of neoantigen ASMTNMELM-specific CD8+ T cells among live (DAPI-) CD8+ cells in PBMCs, as stained using a PE-conjugated ASMTNMELM-H-2Db dextramer. Reprinted from 56, copyright (2015) The Nature Publishing Group.

Большие размеры ДНК-продуктов RCA делают их подходящим строительным блоком для создания нано-, микро- и даже макромасштабных биоматериалов. Luo и соавторы сообщили о метастабильном гидрогеле ДНК из трехмерных запутанных продуктов ДНК RCA ²⁰. Примечательно, что эти новые метаматериалы обладают уникальными механическими свойствами, поскольку они ведут себя либо жидко-подобно, либо твердо-подобно в зависимости от физической среды. В частности, гель остается в твердой форме в воде и свободно течет в "жидкой" форме, когда его извлекают из воды. Жидкая форма гидрогеля может принимать различные формы контейнера, и, что интересно, он быстро восстанавливает свою первоначальную форму при возвращении в воду, независимо от того, сколько различных форм он принял в жидком состоянии. В частности, гидрогель ДНК образуется благодаря запутыванию ДНК, возникающему в результате работы пары РСА с multi-primed chain amplification (MCA). Иерархическая структура гидрогеля ДНК, которая объясняет вышеупомянутые механические свойства, может быть настроена путем изменения времени реакции RCA и MCA. Эти уникальные метасвойства ДНК-гидрогеля могут найти применение в высвобождении лекарств, в клеточной терапии, электрических переключателях и гибких цепях (Рисунок 5B)²⁰.

МиРНК представляют собой эволюционно консервативный класс малых регуляторных некодирующих РНК, связывающихся с комплементарными целевыми мРНК и приводящих к ингибированию трансляции или деградации мРНК, и играют важную роль в регуляции многих аспектов физиологических и патологических процессов в клетках млекопитающих ⁵⁷. В опухолях преобладает эпигенетическая дисрегуляция и соматические мутации, приводящие к глушению множества генов-супрессоров опухолей. Нарушения регуляции миРНК были связаны со степенью злокачественности опухоли, и каждая миРНК может иметь несколько генов-мишеней ^{58, 59}. Поэтому регулирование экспрессии даже одной миРНК для одновременного ослабления совместного замалчивания нескольких генов-супрессоров опухоли может стать эффективным методом лечения опухолей. Хотя большинство ингибиторов миРНК основаны на антисмысловых молекулах для связывания и секвестрации миРНК от их природных мишеней, добиться эффективного и стабильного ингибирования миРНК довольно сложно ⁵⁷. Недавно было обнаружено, что циркулярные РНК (circRNA), обогащенные сайтами связывания миРНК, действуют как естественные миРНК-губки ^{60, 61}, с помощью которых они могут регулировать экспрессию генов 62, 63. CircRNA MTO1 функционирует как губка miR-9 для подавления прогрессирования гепатоцеллюлярной карциномы ⁶⁴, а глушение эндогенной circRNA, circHIPK3, ингибирует рост опухолевых клеток человека, поглощая множество miRNA ⁶⁵. Поскольку circRNA противостоят деградации экзонуклеазой по сравнению с аналогами линейных РНК, circRNA могут поглощать миРНК более эффективно, чем ингибиторы линейных миРНК. Эти наблюдения позволили предположить наличие потенциала сконструированных циркулярных нуклеиновых кислот, богатых сайтами связывания миРНК, для ингибирования функции миРНК и предотвращения роста опухоли. Исходя из этого, имитируя характеристики циркулярной РНК, Yang и др. разработали искусственную одноцепочечную молекулу циркулярной ДНК, содержащую непрерывные, множественные сайты комплементации miR-9, более стабильные и устойчивые к деградации (Рисунок7)⁶⁶. Их результаты показали, что одноцепочечная circDNA эффективно высвобождает многочисленные, совместно замалчиваемые гены-супрессоры опухолей (KLF17, CDH1 и LASS2), повышая их экспрессию путем поглощения онкогенной miR-9 и, следовательно, подавляя прогрессию опухоли и метастазирование легких. В целом, одноцепочечная циркулярная ДНК имеет четыре сайта связывания миРНК, причем каждый сайт связывания включает выступающий сайт. Несовершенство губки из миРНК объясняется препятствием быстрому обороту губки путем эндонуклеолитического расщепления, что продлевает секвестрирующее действие миРНК. Результаты показали, что одноцепочечная circDNA была более эффективной и стабильной, чем другие линейные или закольцованные миРНК-губки. Эти результаты показали, что одноцепочечная circDNA в качестве ингибитора миРНК может эффективно снижать активность миРНК, способствующих развитию опухоли, путем трансфекции наночастиц in vitro и in vivo.

Figure 7 Nanoparticle-loaded single-stranded circDNA served as a miR-9 sponge that increased tumor suppressor gene expression and inhibited tumor proliferation and metastasis. (A) Motifs from miRNAs targeting KLF17, CDH1, and LASS2 found by a database search. (B) Several miR-9 sponges (linear RNA-9, circR-9, CSSD-9-s, and CSSD-9) were designed. (C) qRT-PCR detection of miR-9 expression in HeLa cells after transfection of nanoparticles with different miR-9 sponges for different time points. miR-9 expression was normalized by reference gene U6 small nuclear RNA expression. (D) Western blot analysis of KLF17, CDH1, and LASS2 proteins in HeLa cells transfected with nanoparticles with different miR-9 sponges. Reprinted from 66, copyright (2018) The Science Publishing Group.

Тераностики нуклеиновых кислот обладают уникальными характеристиками по сравнению с обычными мелкомолекулярными тераностиками и другими биологическими препаратами, такими как белки и пептиды. За последние несколько десятилетий было разработано множество новых стратегий тераностики нуклеиновsx кислот, создано множество химических соединений нуклеиновых кислот, а также разработаны составы и системы эффективной доставки различных нуклеиново-кислотных тераностических агентов. CircDNA привлекательны для содействия развитию ДНК-тераностики для таких разнообразных применений, как адресная доставка лекарств с помощью аптамеров circDNA, анализ биомаркеров с помощью аптамеров circDNA, редактирование генов с помощью доноров circDNA, а также разработка биоматериалов для биоанализа и доставки терапевтических средств и вакцин на основе нуклеиновых кислот. Следует отметить, что развитию этих circDNA-тераностиков может способствовать множество хорошо зарекомендовавших себя химикатов нуклеиновых кислот и уже существующих систем доставки нуклеиновых кислот, которые повышают их биостабильность, улучшают их фармакокинетику и фармакодинамику in vivo, а также способствуют повышению их тераностической эффективности. Все большее число нуклеиново-кислотных тераностиков было одобрено FDA или аналогичными органами по всему миру. По сравнению с обычными тераностиками, разработка тераностиков на основе circDNA имеет уникальные проблемы и возможности. До сих пор относительно высокая стоимость крупномасштабного производства ДНК остается проблемой, что может препятствовать их широкому применению, особенно в условиях низкого дохода. Кроме того, эффективность адресной доставки нуклеиновых кислот во многие органы, за исключением печени и селезенки, остается неоптимальной. Между тем, прошлый опыт применения одобренных FDA тераностиков нуклеиновых кислот будет способствовать разработке тераностиков circDNA. В целом, циркДНК обладает большим потенциалом для универсального применения в тераностике различных заболеваний.