Изменения в генетическом коде могут привести к различным наследственным заболеваниям, которые могут поражать различные системы организма, такие как кровь, мозг, глаза, печень, легкие или мышцы. Многие из этих мутаций приводят к тяжелым или даже опасным для жизни клиническим состояниям, не имеющим лечения. Механистически мутации часто приводят к изменениям в кодируемом белке, затрудняя или снижая его функциональность. В настоящее время существуют различные стратегии лечения таких мутаций. Традиционная генотерапия обычно использует рекомбинантные векторы адено-ассоциированного вируса (AAV) (rAAV), являющиеся в настоящее время золотым стандартом для (терапевтического) переноса генов, для экспрессии интактной версии мутировавшего гена и, таким образом, восстановления функциональности мутантного белка^1,2. Однако спектр применения этого подхода к дополнению генов, опосредованного rAAV, довольно ограничен по нескольким причинам. Во-первых, он менее пригоден для лечения больших генов, которые превышают ограниченные возможности упаковки генома одиночными или двойными векторами rAAV. Во-вторых, он не может быть использован для лечения аутосомно-доминантных заболеваний, в частности, вызванных мутациями усиления функции, для которых добавление генов должно сочетаться с эффективным нокдауном мутантного аллеля. В-третьих, он менее применим к генам, кодирующим несколько изоформ сплайсинга, поскольку одновременно можно ввести только одну или очень немногие изоформы. В-четвертых, он не может быть применен к сложным патологическим состояниям, включающим несколько генов (например, при раке или ди- или полигенных заболеваниях).

Привлекательной альтернативой классическим подходам по добавлению генов является CRISPR-Cas-опосредованное (эпи)редактирование генома. За последние несколько лет было разработано несколько модулей CRISPR-Cas, позволяющих редактировать (эпи)геном нового поколения, таких как редакторы оснований цитозина или аденина, активаторы транскрипции (например, Cas9-VPR) или прайм-редакторы^3-8. Редакторы оснований или праймеров направлены на исправление вызывающей заболевание мутации на геномном уровне и поэтому не зависят от размера гена или общего типа мутации. Однако эти подходы, как правило, требуют разработки индивидуальной терапии для каждой мутации (или небольшой группы мутаций, расположенных в непосредственной близости друг от друга) и поэтому вряд ли применимы для лечения большого числа пациентов с определенным заболеванием. Для сравнения, Cas9-VPR-опосредованная активация транскрипции (далее - трансактивация) не зависит от мутации и размера гена и, таким образом, имеет более широкий спектр применения. В этом контексте трансактивация генов, кодирующих белки, которые, как считается, в принципе способны выполнять функции, сходные с функциями пораженного белка, представляет собой перспективный терапевтический вариант. Для этого транскрипционные активаторы на основе CRISPR-Cas9 могут быть нацелены на промоторную область функционально эквивалентного гена с помощью специально разработанных одиночных направляющих гид РНК (sgRNA) (рис. 1). Для терапевтического применения такой ген-специфический инструмент трансактивации может быть эффективно доставлен в нативные ткани с помощью векторов rAAV.



Fig. 1: dCas9-VPR-mediated transcriptional activation of a functionally equivalent gene in mouse photoreceptors. rAAVs expressing dCas9-VPR in combination with appropriate sgRNAs are injected into the target tissue (e.g., the eye). The complex is designed to target a gene that is functionally equivalent to the mutated gene but not natively expressed in the affected cell type. Upon expression, the transactivation complex activates the transcription of the functionally equivalent gene in affected cells, thereby compensating for the missing function of the mutated gene. dCas9, nuclease-deficient Cas9; p65, NF-?B transactivating domain p65; Rta, Epstein-Barr virus transcription factor Rta; TSS, transcription start site; VPR, hybrid tri-partite transcriptional activator VP64-p65-Rta; VP64, tetrameric repeat of Herpes simplex virus protein 16 (VP16) minimal activation domain.

CRISPR-Cas9 является мощной системой редактирования ДНК на основе эндонуклеаз и представляет собой популярный инструмент для целенаправленного редактирования генома. Путем присоединения дефицитной по эндонуклеазе ("мертвой") версии Cas9 (dCas9) к доменам транскрипционных активаторов и/или путем модификации каркаса sgRNA^4,9-13, его можно перепрофилировать для активации экспрессии конкретных генов. В этом контексте комплекс Cas9-sgRNA используется в качестве челнока для направления доменов активатора к определенным областям промотора и стимулирования экспрессии гена мишени. К настоящему времени разработано несколько трансактивационных модулей на основе dCas9 (обычно называемых CRISPRa). Первое поколение было создано путем слияния dCas9 с синтетическими активационными доменами VP64 или p65, что привело к довольно низким уровням экспрессии генов^9,11. Позже эта система была усовершенствована путем объединения трех активаторных доменов VP64, p65 и Rta и добавления их к dCas9 для создания трехстороннего трансактивационного модуля (dCas9-VPR)⁴. Другой эффективной стратегией является включение стволовых петель MS2 в sgRNA-каркас для привлечения различных активаторных доменов¹⁰. Предыдущая оценка различных трансактивационных модулей на основе dCas9 показала, что dCas9-VPR вместе с двумя другими модулями CRISPRa, называемыми dCas9-SunTag¹⁴ и dCas9-SAM¹⁵, обеспечивает самую высокую эффективность трансактивации в различных типах клеток и видах¹⁶. В нашей последней работе мы представили доказательство принципа успешной и безопасной генотерапии наследственной слепоты у мышей с использованием трансактивационного модуля dCas9-VPR¹². Теперь мы описываем подробный протокол использования этого модуля для применения в генной терапии...