Стандарты лечения большинства кожных заболеваний, включая генодерматозы, воспалительные заболевания и бактериальные инфекции кожи, в основном предполагают лечение симптомов, а не основной причины заболевания. Хотя у дерматологов есть репертуар фармакотерапии, которую они могут назначать пациентам (например, стероиды местного действия, противовоспалительные биологические препараты или антибиотики), эти варианты лечения часто являются краткосрочными решениями долгосрочных хронических проблем и сопровождаются нежелательными побочными эффектами. Например, кортикостероиды при атопическом дерматите могут привести к появлению растяжек, истончению и потемнению кожи, а хроническое применение антибиотиков при вульгарной форме акне может привести к резистентности и плохим результатам. Кроме того, хотя биологические препараты произвели революцию в лечении тяжелых воспалительных заболеваний кожи, основным недостатком является то, что пациенты, как правило, должны принимать лекарства всю жизнь. Следовательно, существует острая необходимость в методах лечения, направленных на основную причину заболевания, а не на симптоматическое лечение.

Последние достижения в области генетики и молекулярной биологии показали, что многие кожные заболевания обусловлены изменениями в ДНК - либо мутациями ДНК в организме хозяина (генодерматозы (Ko et al. 2019) и воспалительные заболевания (Bowcock and Cookson 2004)), либо патогенной ДНК в вирусах (de Buhr and Lebbink 2018) и бактериях (Greene 2018; Pursey et al. 2018; Viertel et al. 2014) (кожные инфекции) - что открывает новый путь для воздействия на эти заболевания. В частности, открытие Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) и соответствующих CRISPR-ассоциированных (Cas) нуклеаз позволило редактировать точные молекулярные мишени (например, последовательности ДНК и РНК) в различных клинически применимых контекстах (Doudna and Charpentier 2014; Fellmann et al. 2017). В то время как несколько клинических испытаний с использованием нуклеаз CRISPR - включая Cas9 и Cas3 - используются для лечения заболеваний крови (Frangoul et al. 2021; Frangoul 2020), рака (Lacey and Fraietta 2020; Lu et al. 2020; Stadtmauer et al. 2020), глазных заболеваний, хронических инфекций (Lenneman et al. 2021) и нарушений укладки белков, клинических испытаний на основе CRISPR для лечения дерматологических заболеваний пока нет.

С этой целью терапия на основе CRISPR имеет огромное значение для трех классов кожных заболеваний: генодерматозов, воспалительных заболеваний и бактериальных инфекций (обзор стратегии представлен на рисунке 1). В частности, многие генодерматозы являются моногенными, то есть связаны с мутацией в одном гене (например, рецессивный дистрофический эпидермолизный буллез (RDEB), врожденный ихтиоз) и представляют собой идеальных кандидатов для CRISPR-терапии. Помимо моногенных заболеваний, другие терапевтические мишени для CRISPR включают воспалительные заболевания, такие как атопический дерматит, при которых хорошо известны определенные мутации, вызывающие заболевание (Wan et al. 2021). Кроме того, другие Cas-нуклеазы, такие как CRISPR-Cas3, недавно стали объектом клинических испытаний для лечения бактериальных инфекций мочевыводящих путей (Lenneman et al. 2021) - это открывает еще один путь для использования CRISPR-нуклеаз для лечения устойчивых к антибиотикам или латентных бактериальных (Pursey et al. 2018; Viertel et al. 2014) (или вирусных (de Buhr and Lebbink 2018)) инфекций кожи.



Figure 1. Overview of CRISPR-based treatment strategies for cutaneous disease. Strategy for targeted treatment of (a) inherited cutaneous disorders by CRISPR-Cas9 or (b) bacterial infections by CRISPR-Cas3. Cas9 loaded with a short guide RNA (sgRNA) recognizes the Protospacer Adjacent Motif sequence (PAM), hybridizes at a specific genomic locus, and generates a double stranded break in DNA. At this point, there are two options for editing: (left) disrupting a gene of interest through non-homologous end joining or (right) correcting a gene of interest through homology-directed repair via integration of a donor DNA template carrying the correct sequence. Whereas Cas9 is a single protein that has both DNA targeting and cutting activity, CRISPR-Cas3 involves a complex of multiple proteins called the Cascade complex and recruits a trans-nuclease-helicase called Cas3 to make the initial cut in DNA. After making a cut, Cas3 can use ATP to processively degrade DNA making it useful for cleavage of long segments of bacterial DNA. Delivery strategies for components are discussed in Figure 2.

В последнее время несколько информативных обзорных статей в дерматологических журналах были посвящены ex vivo ДНК- и ген-редактирующим методам лечения редких генодерматозов (Jayarajan et al. 2021; March et al. 2018; De Rosa et al. 2020). Здесь мы рассматриваем как ex vivo, так и in vivo применение редактирования генов в дерматологии и, кроме того, обращаем внимание на включение всех классов нуклеаз CRISPR - ДНК- и РНК-мишеней - в репертуар клинических инструментов, доступных дерматологу. Наконец, учитывая уникальные структурные барьеры эпидермиса для доставки лекарств, мы обсуждаем успехи в доставке терапии на основе CRISPR в кожу и проблемы, которые необходимо преодолеть для внедрения CRISPR в клинику. В целом, мы подчеркиваем потенциал терапии на основе CRISPR для революции в лечении кожных заболеваний с целью обеспечения доступности для практикующего дерматолога.

Лечение генетических заболеваний, поражающих кожу, включая нарушения кератинизации (например, ихтиозы, болезнь Дарье), волдыри (например, буллезный эпидермолиз) или подтипы воспалительного дерматита (например, экзема и псориаз, вызванные различными мутациями CARD), традиционно состояло из лекарств, которые лечили симптомы, а не основную причину заболевания. Эти варианты лечения обычно включают сильнодействующие топические и системные стероиды, иммуноподавляющие препараты и смягчающие средства, которые обеспечивают кратковременное облегчение и тем самым ограничивают долгосрочное улучшение удовлетворенности пациентов. Кроме того, в случаях, не поддающихся лечению, существует риск разрушения защитного рогового слоя и, следовательно, повышенный риск развития вторичных бактериальных инфекций. Несмотря на острую необходимость, лекарств от генодерматозов не существует, а возможности лечения атопического дерматита (AD) ограничены. Новые методы лечения AD на основе ингибиторов IL-4 (например, Dupixent (Beck et al. 2014)) показывают многообещающую клиническую пользу, но пациенты должны оставаться на лекарствах пожизненно и часто испытывают значительные побочные эффекты. Недавно генетические мутации, связанные с атопическим дерматитом (Wan et al. 2021), и мутации, лежащие в основе нескольких моногенных генодерматозов (Kocher et al. 2017; Shinkuma et al. 2016), стали объектом терапии с помощью CRISPR-Cas9 на мышиных и клеточных моделях (Benati et al. 2018; Hainzl et al. 2017; Shinkuma et al. 2016; Wan et al. 2021; Webber et al. 2016). Хотя большая часть этой работы все еще находится на ранних стадиях, уже есть прецедент применения Cas9-опосредованной терапии при недерматологических заболеваниях (Frangoul et al. 2021) и не-CRISPR генотерапии при дерматологических показаниях (рассмотрено в другом месте (Ain et al. 2021)) для лечения пациентов и улучшения результатов. В этом разделе мы обсуждаем последние достижения в использовании CRISPR-Cas9 для успешного восстановления мутаций ДНК при генетических кожных заболеваниях.

В то время как Cas9 не дошел до клинических испытаний в дерматологии, альтернативные методы генотерапии, восстанавливающие поврежденную ДНК при кожных заболеваниях, в основном сосредоточены на терапии ex vivo, а именно на извлечении и модификации клеток у пациентов перед повторной трансплантацией в организм. Например, в настоящее время проводятся клинические испытания стратегий замены генов при рецессивном дистрофическом эпидермолизе (NCT04186650), синдроме Нетертона (NCT01545323) и врожденном ихтиозе (NCT04047732). Многие из этих клинических испытаний были успешными в лечении этих кожных заболеваний путем взятия биопсии и разрастания кератиноцитов, исправления генной мутации, ответственной за заболевание, и повторной пересадки эквивалентов кожи пациентам (NCT04186650). Аналогичная доставка CRISPR ex vivo будет показана при генодерматозах, при которых наблюдается тяжелое поражение кожи. Хотя CRISPR для лечения генодерматозов изучался на животных и клеточных моделях, практически весь прогресс был сосредоточен на одном тяжелом кожном заболевании с волдырями: буллезном эпидермолизе (EB). В частности, исследователи использовали Cas9 для успешного восстановления функции гена (коллагена VII типа полной длины, COL7A1) у грызунов и на клеточных моделях EB, достаточной для получения фенотипа без рубцов после приживления на теле человека (Benati et al. 2018; Bonafont et al. 2019; Izmiryan et al. 2018; Jackow et al. 2019; Kocher et al. 2020). Тем не менее, еще предстоит выяснить, как терапия ЭБ на основе CRISPR-Cas9 сравнится с существующими генными терапиями. Будущая работа определит безопасность и эффективность Cas9-опосредованной терапии EB и, в конечном итоге, других генодерматозов, таких как синдром Нетертона, врожденный ихтиоз и другие моногенные заболевания кожи.

Помимо моногенных кожных заболеваний, растет интерес к пониманию молекулярной генетики, лежащей в основе воспалительных заболеваний кожи, в частности экземы и псориаза (Bieber 2008; Weidinger and Novak 2016), чтобы найти новые способы воздействия на эти мутации для терапии. Многие подтипы псориаза несут генные мутации в CARD14, что приводит к повышению уровня воспалительных цитокинов (Capon 2017), а экзема несет аналогичные причинные мутации в CARD11 (Ma et al. 2017). В отличие от случаев, несущих генные мутации в CARD, одна из наиболее распространенных ассоциаций генетических мутаций с атопическим дерматитом наблюдается в гене FLG, кодирующем филаггрин (Irvine et al. 2011; O'Regan and Irvine 2008). Наконец, еще одно генетическое сходство между экземой и псориазом заключается в инфламмасоме NLRP3, которая при активации приводит к усилению воспалительного ответа и повышению устойчивости к глюкокортикоидной терапии. Недавно было показано, что совместная доставка Cas9, нацеленного на NLRP3, с дексаметазоном в мышиных моделях облегчает симптомы - уменьшает отек кожи, снижает инфильтрации тучных клеток и общее улучшение воспалительной активности - по сравнению с лечением только Cas9-NLRP3 или только дексаметазоном (Wan et al. 2021).

Кроме того, появление технологии редактирования РНК с помощью CRISPR-Cas13 (Abudayyeh et al. 2017) может открыть новые возможности лечения генетических заболеваний, при которых постоянное редактирование ДНК может быть нецелесообразным или опасным из-за непреднамеренных нецелевых эффектов. В приведенном выше примере подавление гена NLRP3 с помощью Cas9 может быть эффективным, но может также вызвать непреднамеренные эффекты вне мишени, которые будут постоянными на протяжении всей жизни клетки. В отличие от этого, редактирование мРНК до трансляции избавит от необходимости воздействовать непосредственно на геном и вместо этого предотвратит экспрессию про-воспалительного белка. Такой тип прецизионной и целенаправленной терапии был бы полезен в тех случаях, когда системная кортикостероидная терапия несостоятельна из-за неблагоприятных побочных эффектов или резистентности. В целом, целенаправленное лечение с помощью Cas9 генодерматозов и атопического дерматита оказалось невероятно многообещающим у животных и на клеточных моделях болезни и дает надежду на перенос этих результатов на человека.

Нет необходимости говорить, что основное лечение бактериальных инфекций - от угревой сыпи (акне) или кожных инфекций, вызванных бактериями - сводится к назначению антибиотиков. Несмотря на эффективность во многих случаях, устойчивость к антибиотикам является серьезной проблемой, поэтому необходимы альтернативные, инновационные варианты лечения инфекций. В то время как антибиотики обычно направлены на механизмы бактериальной клетки, участвующие в основных процессах роста (например, синтез белка, транскрипция РНК и т.д.), альтернативный подход заключается в специфическом воздействии на геномные последовательности бактерий, чтобы вывести из строя патоген, предотвратить репликацию и вылечить инфекцию. Недавно исследователи перепрофилировали систему CRISPR-Cas (Cas3) для борьбы с бактериальными инфекциями (Lenneman et al. 2021; Selle et al. 2020) путем доставки механизма CRISPR, упакованного в вирусные векторы (бактериофаги), которые заражают исключительно бактериальные клетки, а не клетки человека. Вместо того чтобы использовать CRISPR для изменения или редактирования ДНК хозяина, основной принцип стратегии CRISPR-Cas3 заключается в том, чтобы сделать тысячи разрезов в бактериальной ДНК и оставить человеческую ДНК немодифицированной. В отличие от Cas9, которая делает один разрез в ДНК (Jinek et al. 2012), Cas3 - это процессивная нуклеаза и геликаза, которая использует АТФ для разматывания ДНК и последовательной деградации длинных сегментов ДНК (Hochstrasser et al. 2014; Redding et al. 2015). В результате бактерия не может реплицироваться, поскольку ее генетический код отключен.

Комплексы CRISPR-Cas с sgRNAs, комплементарными по последовательности последовательностям патогенных бактерий, могут быть перепрофилированы для нацеливания и уничтожения конкретных видов бактерий. Например, Cas9 недавно была использована для эксклюзивного поражения одного из двух штаммов E. coli в мышиной модели (Lam et al. 2020), а Cas3 недавно была использована для поражения C. difficile (Selle et al. 2020) in vivo; кроме того, Cas3 в настоящее время проходит клинические испытания для лечения инфекций мочевыводящих путей, вызванных E. coli (например, NCT04191148). Хотя последнее исследование подтвердило безопасность и эффективность этой стратегии антимикробного таргетинга, проблемы доставки еще предстоит решить. В частности, в текущем клиническом испытании Cas3 тестируется введение фагового препарата непосредственно в мочевой пузырь пациента (через катетеризацию) с последующей целью внутривенного или внутримышечного введения - все эти способы требуют вмешательства медицинских работников.

Тем не менее, клиническое испытание Cas3 создает важный прецедент для рассмотрения возможности применения CRISPR-Cas для лечения бактериальных инфекций кожи. В частности, в дерматологии, где антимикробное лечение с помощью CRISPR-Cas было бы полезным, к кожным инфекциям, таким как S. aureus (включая MRSA) или фолликулит P. aeruginosa. Случаи, когда пациент не переносит стандартный антибиотик из-за аллергии или не поддается лечению из-за устойчивости к антибиотикам, являются показателями для использования CRISPR-опосредованной терапии. В то время как антибиотики (даже относительно селективные) могут убивать как "плохие" бактерии, так и нормальную флору, которая существует на коже, преимущество стратегии CRISPR-Cas заключается в том, что нормальная флора может быть сохранена путем программирования механизма CRISPR на бактериальные гены, сохраненные в пределах штамма или даже конкретного вида. Кроме того, акне имеет широкий спектр вариантов лечения, начиная от оральных контрацептивов, топических кремов, антибиотиков и заканчивая изотретиноином. Некоторые пациенты либо не отвечают на лечение, либо опасаются значительных побочных эффектов (например, врожденных дефектов, печеночной недостаточности и т.д.), и поэтому они были бы хорошими кандидатами для включения CRISPR-опосредованного лечения акне, усугубляемого бактериями. Поскольку причина акне является многофакторной, CRISPR не будет монотерапией и будет применяться вместе с уже существующими местными средствами лечения акне, которые часто сочетаются с антимикробной терапией.

В целом, CRISPR целенаправленное воздействие на бактериальные инфекции добавляет еще один слой антимикробных стратегий для лечения инфекций. На практике для лечения может оказаться полезной комбинация подходов - например, нацеливание на репликацию бактерий посредством CRISPR и нацеливание на ДНК в дополнение к мягким топическим кремам и растворам для чистки лица, которые могут работать синергично.

Успех любого лечения зависит от эффективности поглощения и последующей биодоступности препарата. Доставка CRISPR для лечения кожных заболеваний может быть разделена на две большие категории: (i) ex vivo, когда первичные клетки обрабатываются вне организма и повторно вводятся пациентам после коррекции генов, и (ii) in vivo, когда компоненты CRISPR непосредственно доставляются пациентам (рис. 2). Кроме того, вирусные векторы (Kimura et al. 2019) и невирусные системы доставки (например, наночастицы на основе липидов (Buck et al. 2019) и полимеров (Malloggi et al. 2015), электропортация (Labala et al. 2017), ультразвук (Lifshiz Zimon et al. 2018; Pereira et al. 2017) и микроиглы (Dul et al. 2017)) использовались для доставки генной терапии и также перспективны для терапии на основе CRISPR.



Figure 2. CRISPR delivery strategies to the skin. (a) Ex vivo delivery strategy involves deriving patient skin stem cells, treating with CRISPR Cas + sgRNA against the targeted gene, and reintegrating corrected skin stem cells back into patients. (b) Effective in vivo delivery strategies for CRISPR may include hollow, dissolvable microneedles that penetrate the epidermis, hypodermic needles, and phage delivery (for bacterial infection applications).

Кожа представляет уникальные преимущества благодаря доступности эпидермиса, а также уникальные проблемы, связанные с относительно непроницаемым барьером рогового слоя и размером этого органа. Местные кремы, наносимые на поверхность кожи, проникают через кожный барьер благодаря диффузии, что приводит к 1-5% биодоступности (Surber and Davis 2002). Другая стратегия - трансдермальная доставка лекарств, которая все еще должна преодолевать упругий барьер эпидермиса (Alkilani et al. 2015; Jeong et al. 2021; Prausnitz and Langer 2008). Физические методы доставки с помощью подкожных игл являются прямым подходом к повышению биодоступности, но требуют проникновения в слой дермы и являются особенно болезненными, что снижает поддатливость пациентов. Лазерная доставка лекарств создает микроскопические зоны абляции (MAZs) с вертикальными каналами, проникающими через роговой слой и проникающими глубоко в дерму (Haedersdal et al. 2016). Хотя эта стратегия в основном была направлена на доставку лекарств, таких как метотрексат (Lee et al. 2008) и метил аминолевулинат (Haedersdal et al. 2014), еще предстоит продемонстрировать, может ли лазерная доставка лекарств быть использована для доставки средств генотерапии, таких как CRISPR-Cas9.

Недавно была проделана работа по доставке терапевтических препаратов на основе CRISPR в животных моделях, а также пациентам в ходе клинических испытаний. Методы на основе вирусных векторов, такие как адено-ассоциированные вирусные векторы (AAVs), теоретически могут доставлять CRISPR-Cas9, направляющую гид РНК и донорскую матрицу (с исправленной мутацией) в клетки (Yang et al. 2016), но для одновременной доставки компонентов требуется более одного вектора, что снижает эффективность целенаправленного воздействия. Другим методом доставки CRISPR, основанным на вирусах, является фаговая терапия (Lam et al. 2020; Lenneman et al. 2021; Selle et al. 2020) для лечения бактериальных инфекций. Основной принцип заключается в том, что бактериофаги избирательно заражают бактериальные клетки и могут нацеливаться на ДНК конкретного вида бактерий, когда они упакованы с CRISPR-Cas3, как это было успешно сделано в недавнем клиническом испытании для лечения инфекций нижних мочевых путей, вызванных E. coli (NCT04191148).

Невирусные методы доставки CRISPR также набирают обороты. Например, внутрикожные инъекции с последующей электропортацией комплексов CRISPR-Cas9, нацеленных на коллаген VII, способствовали трансфекции стволовых клеток кожи и улучшению адгезии кожи в мышиной модели EB (Wu et al. 2017). Подкожные иглы или внутрикожные инъекции (Jackow et al. 2019) являются физическими методами прямой доставки CRISPR-терапевтических препаратов через эпидермис, но их введение пациентам может быть болезненным и снижать клиническую эффективность. Относительно новые и инновационные методы включают технологию микроигл (Dul et al. 2017; Wan et al. 2021), в которой используются полые и растворимые микроиглы для создания небольших пор в эпидермисе и успешной доставки лекарства в дермальный слой. В частности, комплексы CRISPR-Cas9, нацеленные на про-воспалительный ген NLPR3 в сочетании с дексаметазоном, были доставлены через микроигольчатый пластырь в мышиной модели атопического дерматита [REF]. Кроме того, для облегчения доставки микроиглы были нагружена инкапсулированными в полимер Cas9 и содержащими дексаметазон полимерными наночастицами (Wan et al. 2021). Кроме того, этот подход сопровождается заметно меньшей болью, поскольку микроигла не сталкивается с болевыми рецепторами в слое дермы. В будущем необходимо будет продемонстрировать безопасность и эффективность этой стратегии доставки у пациентов, а также целесообразность распространения этого подхода на введение во все тело. Кроме того, хотя многие из этих исследований были проведены в контексте моделей in vitro и на животных, мы считаем, что дальнейший прогресс в этой области позволит этим терапевтическим препаратам достичь пациентов.

Существует несколько проблем, связанных с применением CRISPR для редактирования генов, которые мы кратко перечислим здесь. Во-первых, существуют опасения по поводу нецелевых эффектов; в то время как некоторые исследования показали незначительные или даже необнаруживаемые уровни внецелевых эффектов (Long et al. 2016), в других исследованиях были четко зафиксированы крупные вставки или делеции, которые могут привести к нежелательным последствиям (Shin et al. 2017b). Во-вторых, необходимо будет отслеживать иммуногенность против белков CRISPR, учитывая наблюдения за предсуществующими сывороточными антителами к Cas9 у некоторых доноров (Charlesworth et al. 2019) или распространенность Cas9-реактивных Т-клеток у некоторых пациентов (Wagner et al. 2019). Разработка ингибиторов CRISPR предлагает решение проблемы иммуногенности путем отключения ферментов редактирования генов после расщепления ДНК (Shin et al. 2017a). Наконец, в большинстве случаев CRISPR-опосредованная генотерапия была направлена на лечение ex vivo - а именно, редактирование стволовых клеток вне организма и последующее введение исправленных клеток обратно пациентам. Хотя эта стратегия была применена для редактирования эпидермальных стволовых клеток человека или индуцированных плюрипотентных стволовых клеток пациентов (Jayarajan et al. 2021) и успешной пересадки исправленных клеток мышам, редактирование in vivo непосредственно на коже было ограничено небольшим количеством исследований. Кроме того, редактирование генов стволовых клеток in vivo будет направлено как на стволовые, так и на дифференцированные клетки, что, вероятно, не является ограничением, поскольку стволовые клетки будут сохраняться, а дифференцированные клетки кожи в конечном итоге погибнут и отторгнутся в ходе естественного процесса созревания клеток кожи. Другая проблема включает в себя лечение обширных участков кожи, где участие всего тела и лечение с помощью CRISPR может оказаться нецелесообразным. В будущем необходимо будет определить, насколько эффективно новые технологии в дерматологии (например, доставка лекарств через микроиглы) улучшат возможности редактирования генов in vivo в тканях человека.

Лечение основной причины некоторых кожных заболеваний с помощью редактирования генов CRISPR-Cas в сочетании с симптоматическим лечением будет иметь решающее значение для улучшения долгосрочных результатов лечения пациентов. С этой целью мы предполагаем, что CRISPR не полностью заменит существующие методы лечения, а скорее позволит дерматологам обеспечить более высокий уровень помощи пациентам. Например, фототерапия меняет жизнь пациентов с тяжелым атопическим дерматитом (Rodenbeck et al. 2016), но они все еще могут быть подвержены риску бактериальных инфекций кожи, и хроническое применение антибиотиков может оказаться неприемлемым, что потребует местного применения CRISPR-терапии для лечения инфекции кожи. Тем не менее, бурно развивающаяся область CRISPR существует всего лишь десятилетие, и в ней еще много открытых вопросов и возможностей для совершенствования. В то время как метод CRISPR добился ощутимого прогресса для локального введения при дерматологических заболеваниях, потребуется дальнейшая работа над стратегиями доставки при заболеваниях, при которых поражается весь организм (включая поражение нескольких органов). Кроме того, эффективность редактирования генов не достигает 100%, в результате чего образуется гетерогенная смесь клеток, содержащих восстановленную ДНК и исходную, мутировавшую ДНК. Потребуется постоянная работа, чтобы выяснить, какой уровень эффективности является "достаточным" для значительного улучшения долгосрочных результатов лечения пациентов. Мы ожидаем, что последние достижения в повышении эффективности редактирования и снижении нежелательных внецелевых эффектов (Donohoue et al. 2021) приблизят нас к внедрению CRISPR-опосредованной терапии в дерматологии.