Генотерапия - это форма лечения генетических заболеваний путем введения генетических материалов, таких как система экспрессии терапевтического белка или инструмент редактирования для исправления ошибок гена в больных клетках.^1,2 Развитие этой области принесло надежду на лечение ранее неизлечимых заболеваний, таких как генетические нарушения,³ рак,⁴ и аутоиммунные заболевания.⁵ На сегодняшний день в мире проведено не менее 943 клинических испытаний генотерапии.

Доставка имеет важное значение для генотерапии. Клеточная мембрана представляет собой непроницаемый барьер для отрицательно заряженных нуклеиновых кислот. Кроме того, генетические материалы хрупки в человеческом организме, поэтому их необходимо защищать, чтобы они начали действовать. мРНК и вирусные или не-вирусные плазмидные ДНК обычно являются генетическими материалами, используемыми в генотерапии. Например, широко используется вектор адено-ассоциированного вируса (AAV).⁶ Однако вектор AAV вызывает иммунный ответ хозяина, что приводит к быстрой деградации или нейтрализации вектора и серьезно снижает его эффективность для генотерапии.^7,8. Инкапсуляция в наноструктуры, такие как экзосомы, защищает AAV-векторы от иммунной системы хозяина и доставляет их в клетки через плазматическую мембрану.^9,10



Fig. 1 Schematic illustration of exosome-mediated gene delivery strategies. Functionalized exosome encapsulated gene vectors, such as AAV, DNA and mRNA, deliver to target cells and exert functional therapies by translating into proteins, RNA interference, genome editing, etc.

История генотерапии началась в 1960-х годах, когда Joshua Lederberg впервые представил концепцию и заложил основы лечения заболеваний с помощью генов.¹¹ В 1972 году генотерапия была официально предложена и принята в качестве терапевтического метода лечения генетических заболеваний у человека.¹² В 1989 году Национальные институты здравоохранения одобрили первое клиническое исследование генотерапии, в котором использовалась ретровирусная маркировка для обнаружения опухолевого homing (расположения) in vivo.¹³ Это исследование продемонстрировало, что человеческие клетки могут быть генетически модифицированы in vitro и затем безопасно возвращены в организм пациента.¹³ О первом успешном клиническом исследовании генотерапии in vivo было сообщено в 1995 году.¹⁴ Аутологичные лейкоциты пациентов с синдромом тяжелого комбинированного иммунодефицита (SCID) были исправлены путем реинфузии ретровируса. Однако дальнейшее развитие генотерапии столкнулось с неудачами из-за неблагоприятных последствий, вызванных летальным иммунным ответом, вызванным аденовирусом, и злокачественными новообразованиями. Появление вирусных векторов (таких как лентивирус и AAV) и инструментов редактирования генов позволило преодолеть недостатки и расширить сферу применения генной терапии. На сегодняшний день в мире начато 943 клинических испытания генной терапии. Изначально генная терапия использовалась только для лечения генетических заболеваний, но теперь она получила распространение в лечении рака, инфекционных заболеваний, сердечно-сосудистых и аутоиммунных заболеваний.^15-17 С тех пор как в 2003 году Китайское управление по контролю за продуктами и лекарствами (CFDA) одобрило первый в истории генотерапии препарат Gendicine (рекомбинантный аденовирус человека p53) для лечения плоскоклеточной карциномы головы и шеи (HNSCC), девять препаратов были одобрены Европейским агентством по лекарственным средствам (EMA) и Управлением по контролю за продуктами и лекарствами США (FDA) (Таблица 1).^18-29.

Table 1 Gene therapy products and clinical trials

Развитие технологии редактирования генов CRISPR-Cas9, известной как "волшебные ножницы" ДНК, заметно ускорило развитие генотерапии.^30-34 Ученые теперь могут эффективно и точно изменять, удалять или заменять гены растений,^35,36 животных,^37,38 и даже людей.³⁹ Два препарата на основе CRISPR прошли клинические испытания: CTX001 для лечения редких генетических заболеваний, β-талассемии и серповидно-клеточной анемии, и EDIT-101 для лечения врожденного амавроза Лебера ¹⁰, редкого наследственного заболевания глаз, вызывающего слепоту.⁴⁰

Исходя из источника, носители доставки генов можно разделить на вирусные и невирусные системы (рис. 2). Вирусные системы доставки генов используют модифицированные вирусы, которые не способны к репликации, но могут доставлять ДНК для экспрессии, включая аденовирусы, ретровирусы и лентивирусы.⁴¹ Традиционные невирусные носители включают мицеллы,^42,43 липосомы, дендримеры,^44,45 и углеродные нанотрубки.⁴⁶ Недавно вне-клеточные везикулы, выделяемые клетками, особенно экзосомы, стали использоваться в качестве невирусных носителей для доставки генов и демонстрируют такие характеристики, как высокая биосовместимость, низкая скорость удаления и возможность доставки в клетки.^47-50 Гибридные технологии доставки генов, такие как гибрид экзосома-AAV, объединяют вирусные векторы с невирусными носителями и демонстрируют значительно сниженную иммуногенность.^51,52



Fig. 2 A summary of gene delivery carriers. Current gene delivery carriers contain three major categories: non-viral vectors, viral-vectors, and combined hybrid vectors. Commonly used non-viral vectors include synthetic vectors, such as lipid nanoparticles, polymer nanoparticles, and dendrimers, and biological vectors, such as exosomes. A hybrid gene delivery system based on exosome-associated AAV (Exo-AAV). Most synthetic vectors mainly enter endosomes and later lysosomes. Exosomes and Exo-AAVs enter cells via multiple pathways, such as membrane fusion and various types of endocytosis pathways such as phagocytosis, macropinocytosis, and lipid raft-dependent and clathrin-/caveolin-mediated endocytosis.

Адено-ассоциированные вирусы (AAV) - это небольшие вирусы, заражающие человека и некоторых других видов приматов. Одноцепочечная ДНК AAV с размером генома в 4,7 кб, кодирующая три гена - Rep (репликация), Cap (капсид) и aap (сборка), - упакована в виде икосаэдра. Два конца генов представляют собой инвертированные терминальные повторы (ITR). В рекомбинантном AAV (rAAV), используемом в качестве генного вектора, все гены вирусных белков удалены, и сохранены только терминальные последовательности ITR, связанные с вирусной репликацией и упаковкой. Терапевтические трансгены и регуляторные элементы вставляются между ITRs. Удаление гена вирусного белка максимизирует трансгенную способность AAV и снижает иммуногенность и цитотоксичность. Поскольку вектор rAAV не экспрессирует белок REP, его способность интегрироваться в геном хозяина значительно снижается. Кроме того, геном rAAV может образовывать долговременный кольцевой тандем в ядре, что обеспечивает долгосрочную экспрессию трансгенов. В отличие от лентивирусных векторов, аденовирусных векторов, ретровирусных векторов и других широко используемых вирусных векторов, векторы AAV не вызывают опасных инфекций без вируса-помощника. Поэтому AAV стал основным вектором в этих приложениях из-за его низкой иммуногенности, низкой токсичности генов, разнообразия капсидных белков, длительного действия и простоты производства.

Экзосомы - это замкнутые в липидный бислой везикулы диаметром 40-160 нм, которые циркулируют во внеклеточной среде. Они образуются из внутреннего отростка поздней эндосомной мембраны и высвобождаются всеми типами клеток. Таким образом, экзосомы являются естественными носителями для коммуникации между клетками. Эта особенность и привлекла исследователей к разработке систем доставки лекарств на основе экзосом. По сравнению с другими системами доставки генов, экзосомы имеют преимущества по следующим причинам. Во-первых, экзосомы являются универсальными носителями. Различные биологические грузы, такие как малые РНК, мРНК и белки, могут быть инкапсулированы и доставлены экзосомами. Во-вторых, экзосомы обладают естественной способностью преодолевать биологические барьеры, например, гематоэнцефалический барьер. Они также могут мигрировать в ткани или области без кровоснабжения, например, в плотный хрящевой матрикс. Более того, после попадания в ткань-мишень экзосомы могут оставаться там в течение длительного периода времени; низкая скорость выведения может быть объяснена биосовместимостью экзосом. Еще одной важной особенностью является то, что экзосомы поддаются генной инженерии. Искусственное преобразование поверхностных белков экзосом позволяет достичь различных целей, например, на поверхность экзосом могут быть нанесены клеточные или тканевые пептиды для избирательной доставки в определенные ткани и предотвращения нежелательного накопления в других органах, что снижает системную токсичность. Исследования показали, что направленная генотерапия на основе экзосом может повысить как терапевтическую эффективность, так и безопасность. Например, мы разработали систему доставки миРНК, нацеленную на хондроциты, на основе экзосом для восстановления дефектов хряща.⁵³ В этой работе аффинный пептид для хондроцитов (CAP) был экспрессирован на поверхности экзосом, а miR-140 был загружен внутрь экзосом. Внутрисуставное введение композитов CAP-экзосома/миРНК показало селективное и долгосрочное обогащение хряща и значительное повышение терапевтической эффективности при дефектах хряща по сравнению с миРНК, инкапсулированной в экзосомы без модификации поверхности.

Ассоциация с экзосомами может уменьшить токсичность и смягчить быстрое разрушение AAV-векторов. Векторы AAV страдают от таких недостатков, как быстрый клиренс из-за нейтрализации анти-AAV антителами в организме и доставка вне мишени (часто в печень). В 2012 году Maguire и др. продемонстрировали, что часть векторов AAV связана с микровезикулами/экзосомами.⁵⁴ Капсиды AAV были обнаружены на поверхности и внутри микровезикул под электронным микроскопом. С экзосомами ассоциированные AAVs (Exo-AAVs), очищенные из клеточной среды (рис. 3), превосходят по эффективности трансдукции обычные очищенные AAV векторы. Одна из серьезных проблем вектора AAV заключается в том, что он вызывает мощный долгосрочный гуморальный ответ, включая нейтрализующие антитела (NAbs), которые связываются с векторами AAV и подавляют трансдукцию, и не-Nabs, которые маркируют вирус. Поэтому NAbs негативно влияют на эффективность AAV-опосредованной генотерапии, распространение и безопасность AAV-вектора.⁵⁵ В отличие от них, экзо-AAV более устойчивы к нейтрализующим анти-AAV-антителам по сравнению с обычными AAV. Это было доказано экспериментально. Экзосома-ассоциированные векторы AAV были гораздо более устойчивы к NAbs, чем AAV, как in vitro, так и in vivo, а AAV9Exo-SERCA2a превосходил обычные векторы AAV в сохранении сердечных функций как в присутствии, так и в отсутствии Nabs.⁵⁶ Доставка генов Exo-AAV8 также позволила снизить терапевтическую дозу вектора и достичь эффективной трансдукции даже при наличии умеренных титров NAb.⁵⁷ Exo-AAV также показали более высокую эффективность трансдукции в центральной нервной системе, слуховой и вестибулярной системах.^51,54



Fig. 3 Schematic diagram showing the different procedures for the production and purification of Exo-AAVs (upper) and AAVs alone (lower), respectively.54 Exo-AAVs are harvested from cell medium and purified by differential centrifugation, whereas AAVs are purified from cell lysates by iodixanol density gradient and ultra-centrifugation.

Ассоциация AAV с экзосомами также позволяет достичь адресной доставки. В одном примере магнитное нацеливание может быть реализовано путем экспрессии биотин-акцепторного пептида с трансмембранным рецептором (BAP-TM) на их поверхности путем трансдукции клеток 293T лентивирусом, кодирующим BAP-TM. Комплексы вектор-экзосома, названные авторами вексосомами, затем биотинилировались ферментом биотин-лигазой BirA. Затем биотинилированные комплексы вектор-экзосома связываются со стрептавидин-функционализированными магнитными бусинами и могут направляться магнитным полем.⁵⁸ Генетическое слияние пептида гликопротеина вируса бешенства (RVG) с трансмембранным доменом рецептора фактора роста тромбоцитов приводит к созданию Exo-AAVs, которые могут доставлять грузы в мозг более эффективно, чем немеченые EV-AAVs.⁵⁹ Подобные стратегии могут быть использованы для разработки Exo-AAVs для доставки генов в миокард.^56,59,60.

Производство Exo-AAVs также менее затратно. По сравнению со сложным протоколом очистки AAVs, очистка Exo-AAVs может быть просто выполнена путем гранулирования с помощью ультрацентрифугирования (рис. 3).⁶¹ Кроме того, было показано, что избыточная экспрессия CD9 может увеличить производство Exo-AAVs, это увеличивает надежду на дальнейшее снижение стоимости Exo-AAVs для клинических испытаний.⁶² Эти преимущества делают Exo-AAVs перспективной платформой для генотерапии. В таблице 2 мы приводим краткое описание систем Exo-AAV для генотерапии.^{51,52,54,56-61,63-65}.

Table 2 Exosome associated-AAV for gene delivery

Направляемый последовательностью CRISPR, фермент Cas9 может редактировать геномную ДНК с беспрецедентной точностью, эффективностью и гибкостью в клетках. Однако система CRISPR-Cas9, разработанная ex vivo, должна быть доставлена в клетки мишени и организмы для генотерапии. Доставка системы CRISPR-Cas9 может быть обеспечена за счет физического взаимодействия, химической модификации и биологических носителей. Система CRISPR-Cas9 может быть доставлена в клетку через переходную брешь в липидном бислое, вызванную физическими методами, такими как электропорация (electroporation), гидродинамическая инъекция, деформация мембраны и другие. Несмотря на простоту и легкость выполнения, клеточной мембране могут быть нанесены необратимые физиологические повреждения. Химическая модификация CAS9-sgRNA также позволит доставить ее в клетки или биологические носители, такие как бактериофаги, вирусы и внеклеточные везикулы, могут опосредовать доставку CRISPR-Cas систем в клетки (Таблица 3).

Table 3 Comparison of the different delivery vehicles for the CRISPR/Cas9 gene editing system (N/A, not available)

По сравнению с вирусными носителями, экзосомы из определенных клеточных источников могут избирательно доставлять груз в опухолевую ткань.⁶⁶ Kim et al. сообщили, что экзосомы, полученные из раковых клеток, могут переносить систему CRISPR-Cas9 в опухоли.⁶⁷ Система CRISPR-Cas9, нацеленная на поли (ADP-рибозу) полимеразу-1 (PARP-1), была осуществлена с помощью электропорации в экзосомы из линии клеток рака яичников SKOV3 и линии эпителиальных клеток HEK293 и доставлена в раковые клетки SKOV3 и HEK293. По сравнению с экзосомами, полученными из эпителиальных клеток, экзосомы, полученные из раковых клеток, могут избирательно накапливаться в опухолях рака яичников, ксенотрансплантированных мышей SKOV3, усиливать химиочувствительность к цисплатину и обеспечивать синергетическое уничтожение опухолевых клеток.⁶⁷ Это исследование показывает, что клеточный тропизм может направлять экзосомы опухолевого происхождения к раковым клеткам, что предполагает таргетинговый эффект опухоль-специфических белков на поверхности экзосом. Несмотря на эффект нацеливания на опухоль, экзосомы опухолевого происхождения несут внутриклеточные материалы, которые могут способствовать росту и прогрессии опухоли. Это подчеркивает баланс плюсов и минусов при выборе экзосом из различных типов клеток для переноса и доставки грузов.

Природные экзосомы не предназначены для доставки гигантских молекул, таких как плазмиды, поэтому загрузка плазмид в экзосомах низкая. Для повышения эффективности и емкости плазмид экзосомы необходимо модифицировать.⁶⁸ Инженерные экзосомы также наделяют эти наночастицы способностью доставлять груз в определенные клетки или ткани. CD63 и CD9, маркерные белки, экспрессируемые на поверхности экзосом, часто выбираются в качестве целевых белков для искусственного преобразования экзосом. Например, Ye et al. создали экзосомы (M-CRISPR-Cas9 экзосомы), которые могут эффективно загружать компоненты CRISPR-Cas9 через межбелковые взаимодействия. Авторы соединили GFP с CD63, а GFP-nanobody с белком Cas9. Взаимодействие между GFP и GFP nanobody направляет систему CRISPR-Cas9 в экзосомы и увеличивает загрузочную способность.⁶⁹ Увеличение доставки генов было доказано на репортерной клеточной линии, которую сконструировали авторы. В другом примере Li и др. соединили CD9 с РНК-связывающим белком HuR, который, как известно, связывает молекулы РНК с AU-богатыми элементами (ARE), такими как miR-155. Преобразованные экзосомы, содержащие CD9-HuR, обогащали miR-155 в экзосомах и доставляли груз в клетки-реципиенты. Экзосома CD9-HuR также может обогащать CRISPR-dCas9, сконструированные с AU-богатыми элементами. 3' ARE были клонированы вниз по течению от стоп-кодона dCas9, и это значительно повысило эффективность инкапсуляции мРНК dCas9 в экзосомы CD9-HuR.⁷⁰ РНК CRISPR-dCas9 была успешно доставлена и выполнила свою функцию как in vitro, так и in vivo. Недавно Gee и др. разработали переходную систему доставки для терапевтического редактирования генома, используя два механизма самонаведения: Белок Cas9 был присоединен к везикулам путем химически индуцированной димеризации, а sgRNA была введена в везикулы с помощью сигнала упаковки вирусной РНК и двух саморасщепляющихся riboswitches. Затем было достигнуто эффективное редактирование генома в различных трудно трансформируемых типах клеток, включая индуцированные плюрипотентные стволовые клетки человека (iPS), нейроны и миобласты.⁷¹

Наноразмер экзосом (40-160 нм) делает их подходящим транспортом для небольших терапевтических агентов, таких как химические соединения, siRNAs и miRNAs. Для больших молекул, таких как CRISPR-Cas9 экспрессирующие плазмиды с минимальным размером 5-6 kb, способность нативных экзосом все еще относительно низка.⁷² Липосомы, с другой стороны, способны инкапсулировать и доставлять большие плазмиды, но демонстрируют относительно высокую цитотоксичность из-за неестественной природы липидов. Слияние липидных бислоев мембраны экзосомы и липосомы образует гибрид экзосома-липосома, который позволяет инкапсулировать и доставлять большие молекулы ДНК, такие как плазмиды, экспрессирующие CRISPR-Cas9, а также смягчает проблему токсичности липосом (рис. 4).⁷³ Таким образом, гибрид экзосома-липосома расширяет область применения экзосом для доставки лекарств. Например, CRISPR-Cas9-sgRUNX2 был инкапсулирован в гибридные везикулы экзосомы-липосомы и доставлен в мезенхимные стволовые клетки костного мозга человека, которые не могут быть трансфецированы только с помощью липосом.⁷¹ В другом примере Lv и соавторы разработали генно-инженерные экзосомно-термочувствительные липосомные гибридные наночастицы (gETL NPs) для доставки гранулоцит-макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF) и доцетаксела (препарат для химиоиммунотерапии) в крупные опухолевые узлы, вызывающие метастатическую перитонеальную карциному - смертельно опасное заболевание, не поддающееся эффективному лечению. Авторы показали, что сочетание локальной региональной доставки гипертермической внутрибрюшинной химиотерапии (HIPEC) и системной доставки химиоиммунотерапии с помощью gETL NPs может значительно улучшить лечение заболевания⁷⁴.



Fig. 4 Encapsulating large nucleic acids in exosome or exosome-derived vesicles. Strategies to realize efficient encapsulation include (a) interaction mediated loading of the Cas9 protein in exosomes,^69-72 (b) enriching CRISPR-Cas9 plasmid in the exosome-liposome hybrid,⁷¹ and (c) nanoporation to deliver mRNA molecules into exosomes.⁷⁶

Инкапсуляция больших транскриптов мРНК в экзосомы является сложной задачей. Хотя нативные секретируемые экзосомы содержат множество РНК, включая miRNAs, ncRNAs и фрагменты, большинство фрагментов малы.⁷⁵ Большие молекулы мРНК могут быть перенесены в экзосомы из эритроцитов с помощью электропорации, но этот процесс все еще неэффективен.⁵⁰ Учитывая это препятствие, Yang и др. представили подход к созданию крупномасштабных функциональных мРНК-инкапсулирующих экзосом.⁷⁶ В этой работе был разработан клеточный нанопористый биочип с наноканалами диаметром около 500 нм. Авторы трансфицировали клетки плазмидными ДНК и стимулировали трансфицированные клетки фокальным и преходящим электрическим стимулом. Эта процедура нанопоризации способствовала высвобождению из клеток экзосом, несущих транскрибированные мРНК и целевые пептиды, что привело к увеличению количества экзосом в 50 раз и более чем 103-кратному увеличению транскриптов экзосомальных мРНК, достигая, по оценкам, 2-10 неповрежденных, функциональных мРНК на экзосому.

Тканевая или клеточно-специфическая доставка генных векторов с помощью разработанных носителей позволяет создать усовершенствованный вариант генотерапии с пониженной токсичностью или риском. Носители из клеточных источников, экзосомы, могут опосредовать доставку различных молекул или векторов генотерапии. В частности, генетическая или химическая инженерия экзосом позволяет устанавливать на внешней стороне экзосом специфические для клеток распознающие последовательности для целевой доставки грузов, а маркерные белки экзосом могут быть сконструированы для обогащения целевых белков посредством разработанного меж-белкового взаимодействия. Кроме того, искусственное создание экзосом со свойствами связывания нуклеиновых кислот также поможет инкапсулировать плазмиды или векторы и повысить эффективность загрузки. Слияние экзосом с липосомами позволит создать везикулы, способные инкапсулировать большие плазмиды или транскрипты мРНК, сохраняя при этом такие преимущества экзосом, как био-совместимость и способность к целенаправленному воздействию. В качестве важного шага на пути к клиническим испытаниям был также достигнут прогресс в реализации крупномасштабного производства экзосом или экзосом, нагруженных лекарствами. Прорывы в инструментах и процедурах, таких как нанопоризация, также решают проблему загрузки и производства. В совокупности, с развитием и оптимизацией инструментов редактирования генов, непрерывное развитие систем носителей на основе экзосом позволит в будущем использовать целевую генотерапию в качестве доступных методов лечения сложных заболеваний как in vitro, так и in vivo (рис. 5).



Fig. 5 Potential future applications of gene therapy. Nucleic acid-based therapeutics can be packaged in Exo-AAVs, or Exo-AAVs engineered with targeting capability can be used for gene delivery into human bodies for gene editing in vivo. Alternatively, the cells isolated from patients can be edited by Exo-AAVs carrying gene-editing tools in vitro and then returned to the patients for disease treatment.