Посещений:
ГЕНЕТИЧЕСКИЕ НАРУШЕНИЯ СЛУХА



Ген-терапевтические подходы

Advances in genome editing for genetic hearing loss
Ning Ding,Sangsin Lee, Matan Lieber-Kotza et al.
Advanced Drug Delivery Reviews Volume 168, January 2021, Pages 118-133

According to the World Health Organization, hearing loss affects over 466 million people worldwide and is the most common human sensory impairment. It is estimated that genetic factors contribute to the causation of approximately 50% of congenital hearing loss. Yet, curative approaches to reversing or preventing genetic hearing impairment are still limited. The clustered regularly interspaced short palindromic repeats-associated protein 9 (CRISPR-Cas9) systems enable programmable and targeted gene editing in highly versatile manners and offer new gene therapy strategies for genetic hearing loss. Here, we summarize the most common deafness-associated genes, illustrate recent strategies undertaken by using CRISPR-Cas9 systems for targeted gene editing and further compare the CRISPR strategies to non-CRISPR gene therapies. We also examine the merits of different vehicles and delivery forms of genome editing agents. Lastly, we describe the development of animal models that could facilitate the eventual clinical applications of the CRISPR technology to the treatment of genetic hearing diseases.

Потеря слуха (HL) определяется как неспособность слышать на пороге ниже 25 децибел хотя бы на одно ухо. Являясь наиболее распространенным сенсорным расстройством у людей, HL в настоящее время затрагивает более 5% населения планеты. По оценкам, к 2050 году более 900 миллионов человек, или каждый десятый, будут страдать HL (World Health Organization, Deafness and Hearing Loss, 2019). HL может быть врожденной (присутствующей при рождении) или приобретенной (возникающей после рождения), и обе они могут быть вызваны генетическими и/или экологическими факторами. Врожденной тугоухостью страдает примерно 1 из 500 новорожденных, и более половины случаев обусловлены генетическими факторами, чаще всего дефектом одного гена, в остальных случаях причиной являются факторы окружающей среды (National Center on Birth Defects and Developmental Disabilities, Genetics of Hearing Loss, 2019) [1] (рис. 1). На сегодняшний день кохлеарная имплантация (электронное устройство, помещаемое во внутреннее ухо для обеспечения электрической стимуляции непосредственно слухового нерва) является наиболее доступным вариантом лечения тяжелой и глубокой потери слуха, в то время как слуховые аппараты (носимое снаружи электронное устройство для преобразования и усиления звуковых волн) могут помочь пациентам с умеренной потерей слуха [2]. Однако в настоящее время не существует фармакологических методов лечения генетической HL (GHL). В последние годы генотерапия привлекает все больше внимания как перспективный метод лечения дисфункции внутреннего уха [1, [3-5]]. Один из подходов генотерапии, который используется в последние два десятилетия, предполагает доставку функциональной комплементарной ДНК (кДНК) во внутреннее ухо, исправляя генетический дефект слуха [6,7]. Этот подход, известный как замена генов, полезен для лечения многих заболеваний, вызванных дефектным геном с потерей функции (рецессивная мутация). Однако он не способен восстановить функции генов GHL, вызванных доминантными мутациями [8]. В качестве альтернативы, РНК-терапия, включая антисмысловые олигонуклеотиды (ASOs) и РНК-интерференцию (RNAi), которые подавляют мРНК, транскрибируемую с мутантных аллелей, также применялись в исследованиях GHL [9]. Однако ни ASO, ни RNAi не смогли преодолеть барьер преходящих эффектов и поэтому не могут предложить постоянного решения проблемы генетических дефектов. Этот недостаток обуславливает необходимость разработки новых стратегий для однократного, точного и надежного подхода к лечению GHL



Fig. 1. Distribution of deafness-associated variation type. The left pie chart shows that genetic factors account for over half of the identifid deafness. Of those, 80% are associated with single nucleotide mutation, followed by deletion, insertion, and duplication depicted in the right chart. The pie charts were drawn with data adapted from ClinVar (ncbi.nlm.nih.gov/clinvar) [22].

Недавно разработанная платформа для редактирования генов - система CRISPR-Cas9 - была использована для редактирования одного или нескольких генов одновременно у разных видов [10]. Многие усилия были направлены на повышение эффективности и специфичности редактирования генома системами CRISPR-Cas9 [11,12]. Способность программируемых систем CRISPR-Cas9 нарушать или восстанавливать генные мишени открывает большие возможности для лечения генетических заболеваний, включая GHL [13]. Новые инструменты редактирования генома, называемые "редакторами оснований", создаются путем слияния каталитически ослабленного Cas9 (обычно обозначаемого как nickase Cas9, nCas9) с различными деаминазами, это позволяют преобразовывать цитозин (C) в тимин (T) (редактор оснований цитозина, CBE) или аденин (A) в гуанин (G) (редактор оснований аденина, ABE), что приводит к прямому преобразованию или исправлению точечных мутаций в однонуклеотидных вариантах (SNVs) [14,15]. SNV могут быть исправлены редакторами оснований с низким уровнем нежелательных вставок или делеций (indels) при условии, что нуклеотиды мишени расположены в подходящем окне редактирования рядом с последовательностью протоспейсерного смежного мотива (PAM) [14]. Поскольку более 80% вариантов, ассоциированных с глухотой, являются SNV (рис. 1), ожидается, что редакторы оснований станут перспективными инструментами для лечения GHL.
В настоящее время проводятся клинические испытания генотерапии GHL, например, заместительная терапия доставки кДНК гена Atoh1 посредством рекомбинантного аденовируса (AdV) серотипа 5 (ClinicalTrials.gov Identifier: NCT02132130), переход от исследований на животных к лечению людей начал демонстрировать возможность успеха. Одним из основных факторов, определяющих возможное клиническое применение систем CRISPR-Cas9, является эффективная доставка агентов редактирования генома в конкретные клетки. Различные формы агентов CRISPR-Cas9 (ДНК, мРНК и белок) были доставлены в клетки внутреннего уха вирусными и невирусными носителями [[16-20]]. Вирусные векторы, хотя и способны эффективно доставлять генетические материалы, имеют ограниченное применение у людей из-за опасений в их потенциальной опасности. Невирусные подходы, по-видимому, способны устранить некоторые недостатки вирусных векторов с точки зрения безопасности, возможности упаковки и продукции. Однако их сравнительно низкая эффективность доставки ограничивает их применение in vivo [11,21].
2. Deafness-associated genes and variants


Появление технологии высокопроизводительного секвенирования ДНК значительно расширило наши возможности по выявлению генов и вариантов, связанных с HLухотой [23]. Спрос на интерпретацию генов и вариантов подстегнул создание публичных баз данных, таких как ClinVar, Human Gene Mutation Database (HGMD) и Deafness Variation Database (DVD), которые содержат все идентифицированные геномные и клинические данные, связанные с GHL [22,24,25]. Эти базы данных предоставляют обширные ресурсы для фундаментальных исследований и соответствующую информацию о клинических потребностях.
2.1. Классификация


На сегодняшний день идентифицировано 119 генов, ответственных за несиндромальную HL [26]. Среди этих 119 генов 47 и 76 соотв. связаны с аутосомно-доминантной и рецессивной HL (приведенные цифры включают перекрывающиеся гены, поскольку некоторые из них могут вызывать как доминантную, так и рецессивную HL), соответственно, а остальные связаны с Х-сцепленными, модифицирующими, Y-сцепленными генами или слуховой нейропатией [26]. Варианты, ассоциированные с глухотой, также можно классифицировать по типам вариаций: однонуклеотидные (~82%), делеции (~10%), дупликации (~3%) или вставки (~5%) [22] (Рисунок 1). Эти классификации дают соответствующее распределение заболеваний, а также важную информацию для выбора подходящей стратегии генотерапии (рис. 2). В принципе, генетические подходы к лечению доминантной и рецессивной наследственной HL различны. В случае рецессивной HL терапия, известная как замена гена, дополняет первоначальную функцию дефектного гена путем прямой доставки гена дикого типа. Напротив, замалчивание генов для терапии доминантных заболеваний может быть более эффективным в подавлении доминантно-негативных эффектов мутантных аллелей. Редактирование генов может быть лучше, чем замена генов и заглушение генов, поскольку оно позволяет лечить как доминантные, так и рецессивные HL путем прямой коррекции генов или реверсии мутации, вызывающей заболевание. Для оценки клинической значимости каждого варианта на основании экспериментальных, диагностических и расчетных данных выделяют пять категорий (патогенные, вероятно патогенные, неопределенной значимости, вероятно доброкачественные и доброкачественные), демонстрирующих вероятность того, что та или иная мутация является причиной заболевания [27]. Поскольку GHL с патогенными мутациями является конечной мишенью для лечения, правильная идентификация и характеристика тех патогенных мутаций, которые приводят к нарушению слуха, очень важны.



Fig. 2. Phenotype of deafness-associated genes and relative gene therapy strategies. The lists of autosomal dominant and autosomal recessive HL genes are from the Hereditary Hearing Loss Homepage (hereditaryhearingloss.org) [26]. †: GJB2, GJB6, MYO6, MYO7A, TECTA, TMC1, CEACAM16, COL11A2, TBC1D24, PTPRQ, and MYO3A are identified to cause both dominant and recessive HL. ‡: MYO1A is an autosomal dominant HL gene called into question. For dominant HL, people with normal-mutant genotypes (heterozygous) develop the disease. Gene correction or gene silencing is possible to treat the disease. Whereas genetic recessive HL, which is caused by homozygous mutant-mutant genes, might be treated by gene replacement or correction.
2.2. Most common deafness-associated genes


Большинство случаев GHL связано с десятью генами, ассоциированными с HLухотой (GJB2, SLC26A4, MYO15A, OTOF, CDH23, TMC1, WFS1, MYO7A, KCNQ4 и COCH) [28]. GJB2 (gap junction beta 2, MIM: 121011) является наиболее распространенным геном, связанным с HLухотой (~22% всех диагнозов) [29], и несет наиболее значительное количество патогенных или вероятно патогенных вариантов (~70% кодирующих вариантов) [25]. GJB2 кодирует экспрессируемый в улитке и эпидермисе белок gap junction бета-класса коннексин 26, дисфункция которого приводит к нарушению внутриклеточной диффузии калия и передачи слуховых сигналов [30]. Наиболее распространенным вариантом в локусе GJB2 является мутация со сдвигом рамки с.35delG, которая также является наиболее частой причиной GHL во всем мире (Таблица 1). Два других высокочастотных патогенных SNV, особенно в европейских и восточноазиатских популяциях, c.101T>C (с. M34T) и c.109G>A (с. V37I), соответственно, вызывающих прогрессирующую мягкую или умеренную рецессивную нейросенсорную HL [31].



Table 1. The most prevalent mutations at the GJB2 and SLC26A4 loci.

Генотерапия с участием гена GJB2 была применена для восстановления слуха у мышей или морских свинок (у которых ген обозначен как Gjb2). Доминантная мутация c.224G>A (p.R75Q) в гене Gjb2 была подавлена короткой интерферирующей РНК (siRNA). В мышиной модели, трансфицированной плазмидным вектором, экспрессирующим GJB2R75W- усиленный зеленый флуоресцентный белок (GFP), эта siRNA селективно подавляла экспрессию R75W более чем на 70% от контрольных уровней, в то время как экспрессия мышиного Gjb2 дикого типа не была затронута [32]. Yu и др. [33] ввели вирусный вектор, несущий кодирующую последовательность Gjb2, в scala media мышей с нокаутом Gjb2 и продемонстрировали повышенную экспрессию коннексина-26 в поддерживающей клеточной сети. Однако этот подход не привел к значительному улучшению слуха. Кроме того, Iizuka и др. [34] доставили Gjb2 через мембрану круHLого окна в поддерживающие клетки в мышиной модели с делецией Gjb2. Наблюдалось значительное улучшение слуховых реакций и развитие кохлеарной структуры. Takada и др. [35] ввели ген brain-derived neurotrophic factor (BDNF) в улитку мыши с нокаутом Gjb2, чтобы способствовать выживанию нейронов в слуховой улитке. Это исследование поддержало стратегию непрямой генотерапии для Gjb2-дефицитных мышей, связанных с дегенерацией слухового нерва.
Мутации в гене SLC26A4 (solute carrier family 26, member 4) занимают второе место по распространенности в мире среди причин GHL [36,37]. SLC26A4 кодирует белок пендрин, который осуществляет трансмембранный транспорт анионов в слуховой улитке [38]. Наиболее частой мутацией в гене SLC26A4 является мутация сплайсинга, c.919-2A>G во всех популяциях, а миссенс-мутация, c.2168A>G (p.H723R), наиболее часто встречается в Восточной Азии [37] (Таблица 1). Lee et al. [37] обнаружили одиннадцать патогенных мутаций, которые могут вызвать аберрантный сплайсинг в SLC26A4, и полностью или частично восстановили сплайсинг с помощью модифицированного компонента сплайсесом U1 малой ядерной РНК (snRNA) и ASOs. Ryu et al. [39] разработали невирусную систему доставки CRISPR-Cas9 на основе плазмиды для редактирования локуса Slc26a4 в клеточной линии мыши. Затем группа обработала модель мыши, содержащую мутацию сплайсинга c.919-2A>G, используя вирусную доставку CRISPR-Cas9, и добилась точной коррекции мутации до генотипа дикого типа, но ее влияние на функцию слуха не было оценено [17]. Недавно Kim и др. [40] продемонстрировали, что доставка кДНК SLC26A4 адено-ассоциированным вирусом (AAV) в отоцист мыши (эмбриональная структура, развивающаяся во внутреннее ухо) частично восстановила слух и экспрессию пендрина. Однако было показано, что восстановление было нестабильным и колеблющимся, а у обработанных мышей с возрастом наблюдалась прогрессирующая тугоухость. Важно, что это исследование показало, что для поддержания стабильной функции слуха необходима генотерапия, обеспечивающая раннее начало полного, а не частичного восстановления экспрессии пендрина [40].
2.3. Other deafness-associated genes


TMC1 (transmembrane channel-like 1) кодирует трансмембранный белок, который является компонентом для механоэлектрической трансдукции волосковых клеток улитки [42]. Мутации TMC1 могут привести к аутосомно-доминантной или аутосомно-рецессивной несиндромальной HL и они являются одной из наиболее частых причин аутосомно-рецессивной HL в кровнородственных популяциях [43]. Мутация c.1253T>A (p.M418K) в TMC1 была идентифицирована как причина аутосомно-доминантной HL в китайской семье [44]. Эта мутация ортологична мутации Tmc1 c.1235T>A (p.M412K), о которой сообщалось в мышиной модели HL под названием Beethoven (Bth) [45]. Учитывая доступность этой мышиной модели, содержащей миссенс-мутацию генетической гухоты человека, ген TMC1 привлек широкий интерес исследователей к изучению генной терапии GHL в последние годы. Замена генов [46,47], подавление генов [48,49] и редактирование генов [16,19] были использованы для предотвращения или лечения GHL, вызванной различными мутациями Tmc1 у мышей.
MYO15A (миозин XVA) кодирует нетрадиционный миозин 15A (MYO15A), который ко-локализуется с PDZ-содержащим белком Whirlin (кодируется WHRN) во время удлинения стереоцилий. Эти два белка в основном регулируют рост пучка стереоцилий [50]. Трансфекция GFP-Myo15a показала, что MYO15A локализуется на кончиках стереоцилий волосковых клеток внутреннего уха и имеет решающее значение для морфогенеза пучков волосков у млекопитающих путем привлечения Whirlin [51,52]. Мутации в Whrn, связанные с аутосомно-рецессивным синдромом GHL и синдромом Ашера, были вылечены введением кДНК Whrn мышам [53,54].
Мутации в гене OTOF (отоферлин) вызывают прелингвальную и глубокую рецессивную HL [38]. Отоферлин в основном находится во внутренних волосковых клетках и помогает формированию синаптических везикул для передачи акустической информации в слуховой нерв [38]. Нонсенс-мутация c.2485C>T (p. Q829Ter) показывает самую высокую частоту среди выявленных мутаций OTOF и является третьей по распространенности причиной аутосомно-рецессивного HL в испанской популяции [28]. В двух недавних исследованиях была использована двухвекторная система, несущая кДНК Otof у нокаутных мышей Otof, и частично восстановлена слуховая функция [55,56]. ДНК Otof (~6 кб) была разделена на два фрагмента из-за ограниченной способности AAVs к упаковке размером около 5 кб, что подчеркивает, что стратегия split-AAV может быть использована и для других больших генов, таких как MYO15A и CDH23, размер которых составляет 11 кб [55,56].
Наконец, мутации в гене CDH23 (кадхерин 23), который кодирует трансмембранный белок, ответственный за связь между стереоцилями и механотрансдукцией слуховых стимулов, вызывают аутосомно-рецессивную HL [38]. В недавних исследованиях вариант пропуска экзона нуклеотидов гена Cdh23 (c.753G>A) был исследован у мышей для возрастной HL [18,57,58]. Исправленный мышиный вариант c.753A>G был создан с помощью технологии CRISPR-Cas9 и успешно продемонстрировал свое влияние на устранение возрастной HL [18] и синдромальной HL [57]. Реципрокная замена c.753G>A была впоследствии создана в эмбриональных стволовых клетках путем гомологичной рекомбинации и использована для проверки функции c.753G для предотвращения возрастной HL [58].
3. Application of CRISPR-Cas9 Systems for Genetic Hearing Loss


Профилирование генов или вариантов, приводящих к различным степеням или типам GHL, было важным направлением исследований GHL на протяжении десятилетий. Эта работа показала, что мутации, приводящие к GHL, весьма неоднородны. Мутации в одном и том же гене могут вызывать различные фенотипы GHL (например, GJB2 и TMC1), в то время как схожие симптомы могут возникать из-за мутаций в разных генах, которые могут влиять на транскрипцию, экспрессию или функцию ассоциированных со слухом белков [59,60]. Поэтому лечение этих нарушений требует точного и в то же время универсального подхода для внесения соотв. изменений и преодоления гетерогенности GHL. Здесь мы обсуждаем последние методы редактирования генов CRISPR-Cas в отношении их терапевтического потенциала для GHL, а также технические проблемы, связанные с эффективностью редактирования и специфичностью мишени. Мы также исследуем недавний метод редактирования оснований для исправления мутации одного основания, вызывающей GHL, и его преимущества перед традиционными агентами редактирования генома на основе нуклеаз. Наконец, мы сравниваем характеристики замены генов и замалчивания генов с характеристиками редактирования генов CRISPR-Cas9.
3.1. CRISPR-Cas9 genome editing
3.1.1. Non-homologous end joining


Доминантно наследуемая GHL включает гетерозиготную мутацию, которая приводит к появлению отдельного мутантного аллеля и непораженного аллеля дикого типа. Около 20% GHL наследуется доминантно и в основном развивается как постлингвальная глухота [43]. Чтобы эффективно бороться с доминантно-негативной мутацией, подход к редактированию генома требует избирательного целенаправленного воздействия на мутантный аллель по сравнению с аллелем дикого типа. Кроме того, учитывая, что большинство мутаций приобретается в результате изменения одного основания, высокая селективность и чувствительность для нацеливания на мутантные аллели имеют важное значение (рис. 2).
Фермент Cas9, направляемый sgRNA, вызывает двухцепочечное расщепление определенной последовательности ДНК [61]. Возможность переопределения комплементарных последовательностей на РНК для различных участков ДНК-мишени делает систему очень программируемой и точной. Негомологичное соединение концов (NHEJ), которое приводит к случайным indels, является основным путем устранения разрывов в клетках млекопитающих, поскольку оно может эффективно нарушить функциональность гена [62]. Используя эти возможности систем CRISPR-Cas9, Gao и др. [19] впервые продемонстрировали селективное разрушение доминантно-негативного мутантного аллеля в модели мыши Bth. Авторы успешно продемонстрировали улучшение выживаемости волосковых клеток слуховой улитки и слухового ответа путем введения рибонуклеопротеинового (РНП) комплекса Cas9:sgRNA гетерозиготным Bth/+ мышам [19]. Важно отметить, что использование sgRNA, нацеленной на мутантный аллель, показало минимальное образование indels на аллеле дикого типа как in vitro, так и in vivo, что свидетельствует о высокой селективности sgRNA для мутантной последовательности. Более того, использование различных sgRNA привело к различным результатам улучшения слуха, что указывает на необходимость предварительного отбора подходящей и эффективной sgRNA [19].
Последовательность PAM затем использовалась для отличия мутанта от аллеля дикого типа. Исследования показали, что PAM является необходимым условием для разворачивания двухцепочечной ДНК-мишени (dsDNA) и спаривания оснований с sgRNA [63]. Если sgRNA сконструирована таким образом, что мутация становится одной из частей PAM, то может быть осуществлено селективное разрезание мутантного аллеля. Gyorgy et al. [16] использовали ту же модель мыши Bth, в которой мутантная последовательность (5'-GGAAGT-3') находится в контексте PAM-мотива "NNNRRT" (R обозначает A или G), распознаваемого вариантом Cas9 из Staphylococcus aureus (SaCas9), названным SaCas9-KKH. Во всех случаях в мутантном аллеле наблюдалось большое количество indels, тогда как в аллеле дикого типа из гетерозиготных Bth/+ фибробластов и у мышей было обнаружено менее 2% и 0,0075% indels, соотв. [16]. Таким образом, стратегия целенаправленного воздействия на аллель на основе PAM является еще одним перспективным подходом.
3.1.2. Homology-directed repair


Направленная на гомологи репарация (HDR) является менее предпочтительным путем в клетках млекопитающих для восстановления двухцепочечных разрывов и почти отсутствует в пост-митотических клетках, таких как слуховые сенсорные клетки. Однако HDR производит желаемые геномные модификации при доставке донорской матрицы к локусу мишени [64], что открывает большие перспективы для безопасной и высокоточной генотерапии [62,65]. Были предприняты значительные усилия для преодоления низкой эффективности HDR [66,67], однако с ограниченным успехом в слуховых волосковых клетках. Например, Yeh и др. [20] оценили эффективность HDR путем введения мутации c.98C>T (p.S33F) в ген Ctnnb1, кодирующий белок β-катенин сенсорных волосковых клеток внутри слуховой улитки, чтобы способствовать регенерации волосковых клеток. Частота случайных indels превышала частоту желаемых knock-in мутаций в Ctnnb1, при этом процент успешного HDR составил всего около 5%. В другом исследовании Mianne и другие [18] пытались вылечить возрастную прогрессирующую HL с помощью HDR путем микроинъекции мРНК nCas9, двойной sgRNAs и одноцепочечной олигонуклеотидной матрицы в гомозиготные эмбрионы мыши, несущие мутацию c.G753A в Cdh23 [68]. У успешно восстановленных мышей наблюдались нормальные пороги слухового ответа ствола мозга (ABR) на разных частотах, но процент детенышей, содержащих исправленный генотип, составил менее 1% от общего числа инъецированных эмбрионов. Недавно Ryu и др. [17] также продемонстрировали, что сплайсинговая мутация c.919-2A>G гена Slc26a4 может быть исправлена как in vitro, так и ex vivo с помощью HDR-опосредованного пути, но при этом процент успеха составил всего 14% в первичных эмбриональных фибробластах мыши. Таким образом, низкая эффективность остается значительным препятствием для применения HDR-опосредованных подходов. Неясные эндогенные факторы все еще ограничивают его применимость, предполагая, что для лучшего управления этим путем необходимо более глубокое понимание клеточного пути восстановления после расщепления ДНК [69]. Эти исследования позволяют предположить, что эффективная коррекция мутаций, связанных с GHL, с помощью HDR все еще может быть сложной задачей.
3.2. Base editor


Из всех типов вариаций, связанных с глухотой (инсерция, делеция, дупликация и однонуклеотидные замены), SNV занимают самое широкое место среди всех кодирующих вариантов - ~82% (рис. 1). Редактор оснований непосредственно генерирует точные однонуклеотидные мутации в геномной ДНК или клеточной РНК, не требуя двухцепочечных разрывов [14, [70-74]]. Соединение nCas9 с ферментом цитидиндеаминазы образует CBE, который может быть запрограммирован с помощью sgRNA на преобразование C в урацил (U), что в конечном итоге приводит к замене C на T (или G на A) с относительно высокой эффективностью, при этом минимизируя внесение случайных indels в геном [70]. Промежуток активности для эффективного деаминирования обычно наблюдается между позициями с четвертого по восьмой спейсер, считая позиции с 21 по 23 PAM (Рисунок 3a), хотя разные версии CBE могут обладать разными промежутками активности [14]. Хотя наибольшее распределение, необходимое для реверсии патогенной точечной мутации, приходится на замену A>G (или T>C), ABE также был разработан путем соединения никазы с аденин-деаминазой, которая превращает A в инозин, считываемый полимеразой как G в ходе клеточного пути репарации [72]. Вместе с CBE и ABE четыре мутации перехода стали достижимыми (Рисунок 3).



Fig. 3. Strategy for using base editors to treat GHL. (a) Schematic of a base editor. DNA containing the target cytosine (C) or adenine (A), denoted as X, at a specified locus guided by RNA is bound by nCas9. Target C or A located within the activity window of five nt, typically from positions four to eight within the protospacer, counting the protospacer-adjacent motif (PAM) as positions 21 to 23, can be deaminated and changed to uracil or inosine, respectively (not represented), by cytosine base editor (CBE) or adenine base editor (ABE), respectively. nCas9 nicks the complementary strand, and cells favor using the edited strand as a template for DNA repair. The uracil is then read as thymine (T) and the inosine as guanine (G), effecting the conversion of a C to T or an A to G, respectively. (b) Representation of the four different codons Thr34, Ala1209, Ile37, and Ter1975 responsible for causing HL. Nucleotide conversion generating disease is represented in red, and mutation corrected by the base editor is described in blue.

Учитывая низкую эффективность HDR в пост-митотических клетках, редакторы оснований являются отличной альтернативой для эффективного исправления замены одного основания. Эффективность редактирования обычно намного выше, чем у HDR, достигая ~75% или ~50% от общей клеточной ДНК при трансфекции CBE или ABE, соответственно, а нежелательные indels, геномные перестройки и транслокации сводятся к минимуму и составляют менее 1% [70,72]. Тем не менее, изучение GHL in vivo с использованием базовых редакторов в настоящее время ограничено из-за отсутствия моделей животных, несущих репрезентативную мутацию одного основания. На сегодняшний день только в одном исследовании с использованием редактора оснований была введена мутация S33F в β-катенин сенсорных клеток, чтобы блокировать его фосфорилирование и убиквитинирование, тем самым повышая сигнальную активность, которая может способствовать росту и трансдифференцировке поддерживающих клеток в волосковые клетки [20]. Извлеченные образцы тканей, обработанные редактором оснований, показали эффективность редактирования около 13%, в то время как метод HDR привел лишь к около 5% мутаций от общего числа считываний секвенирования. Исследование продемонстрировало, что редактирование оснований может восстановить регенеративную способность волосковых клеток, что позволяет лучше понять клеточное перепрограммирование in vivo для улучшения слуховой функции [20]. Несмотря на этот вывод, до сих пор ни одно исследование не продемонстрировало применение редакторов оснований для восстановления слуховой функции в мышиных моделях путем реверсии точечных мутаций.
В настоящее время открываются новые возможности использования редакторов оснований в лечении GHL Например, мы ожидаем разработки стратегии редактирования оснований, которая сможет преобразовать C в T в мутации c.101T>C (p. M34T) в GJB2, одном из наиболее распространенных вариантов, ассоциированных с глухотой (рис. 3b). Как подробно описано в таблице 2, можно редактировать и другие варианты, связанные с глухотой, с относительно высокой частотой аллелей. Однако редакторы оснований не могут осуществлять делеции, вставки или замены пуринов на пиримидины, в таких как мутации c.35delG, c.167delT и c.235delC, которые являются распространенными патогенными вариантами, связанными с глухотой (Таблица 1).



Table 2. List of base-editable gene variants associated with GHL with an NGG or NG PAM positioned appropriately.

Активность платформ вне мишени при целенаправленном воздействии на геном является основной проблемой при терапевтическом применении [75]. Для редакторов оснований их способность редактировать нежелательные Cs или As в пределах своих границ редактирования, называемая побочным редактированием, потенциально может оказывать пагубные последствия [14]. Для повышения специфичности редакторов оснований исследователи модифицировали домен деаминазы или использовали специфичные для последовательности варианты деаминазы и добились точного изменения одного желаемого нуклеотида с минимизацией побочных эффектов [76-78]. Более того, поскольку деаминазы могут распознавать ДНК или РНК как субстраты для неспецифического деаминирования C>U или A>I, это может привести к геномному или транскриптомному внецелевому редактированию, исследования выявили ключевые остатки в домене деаминазы, которые можно заставить мутировать для существенного снижения нецелевого редактирования и значительного повышения точности редактирования оснований [79-81]. Тем не менее, следует отметить, что хотя основная деятельность редакторов оснований осуществляется деаминазой, nCas9, направляющая деаминазу к мишени, также может привести к появлению внецелевых сайтов. С момента открытия системы CRISPR-Cas9 исследования позволили понять механизмы, лежащие в основе специфичности Cas9, с помощью структурного анализа и несмещенных методов обнаружения вне мишеней в масштабах генома, таких как GUIDE-seq [82-84]. Сегодня уже охарактеризовано несколько вариантов Cas9, демонстрирующих высокую специфичность по отношению к мишени, а один из них даже демонстрирует отсутствие нецелевого редактирования с помощью современного метода детекции [85-87]. Эти улучшения демонстрируют значительно возросшую точность целенаправленного воздействия быстро развивающихся инструментов редактирования генома. Благодаря дальнейшему прогрессу и характеристикам этих инструментов, включая редакторы оснований, опасения по поводу внецелевого воздействия могут быть сняты, что может способствовать продвижению в клинику.
3.3. Comparison of gene replacement and gene silencing with gene editing


Замена генов была наиболее распространенной стратегией генотерапии GHL в течение последнего десятилетия. Она дополняет функциональную копию гена для отмены мутантного гена путем доставки кДНК с последовательностью гена дикого типа [3]. Использование замены генов были исчерпывающе рассмотрены [1,3,4,95], поэтому в данном разделе мы лишь укажем сильные и слабые стороны этого подхода по сравнению с редактированием генов (табл. 3).



Table 3. Comparisons of gene therapy strategies for GHL.

В отличие от CRISPR-Cas9, замена генов не требует наличия PAM-мотива, это ограничивает область действия расщепляющей активности CRISPR-Cas9 в геноме [96]. Тем не менее, возможности использования замены генов все еще ограничены, поскольку ее использование ограничивается рецессивными заболеваниями, требующими повторной инсталляции гена, утратившего функцию. Аутосомно-доминантный GHL с меньшей вероятностью может быть исправлен путем замены гена [97].
Подавление генов - это стратегия "выключения" экспрессии мутантного гена. При доминантной GHL для восстановления слуха может быть достаточно заглушить мутантный аллель, в то время как аллель дикого типа будет функционально экспрессироваться [3] (рис. 2). Как упоминалось ранее, ASOs и RNAi являются двумя полезными стратегиями для подавления генов при лечении GHL (Таблица 3). И ASOs, и RNAi используют короткие синтетические нуклеотиды, которые связывают РНК мишени посредством спаривания оснований Уотсон-Крика, но они отличаются по составу и способам действия. ASO состоят из коротких синтетических одноцепочечных олигодезоксинуклеотидов ДНК (ssDNA) или РНК (ssRNA) и выполняют функцию замалчивания генов, нацеливая РНК на деградацию, предотвращая тем самым трансляцию определенной РНК в белок и изменяя сплайсинг пре-мРНК [98,99]. В RNAi используются двухцепочечные РНК (dsRNAs), чтобы вызвать пост-транскрипционное подавление гена. Направляющая нить dsRNAs может связываться с комплексом РНК-индуцированного замалчивания и активировать его для разрезания целевой мРНК [99].
Первым использованием ASOs в лечении GHL было восстановление вестибулярной функции в мышиной модели синдрома Ашера типа 1С [100]. Lentz и др. [100] впервые создали гомозиготную (216AA) модель мыши с синдромом Ашера путем замены генов. Когда ее лечили одной внутрибрюшинной инъекцией ASO-29, слух на низких частотах был полностью восстановлен до уровня дикого типа; однако восстановление было преходящим и постепенно снизилось через два месяца [100]. В недавнем исследовании два сайта сплайсинга c.1001+5G>C и c.1001+5G>T в гене SLC26A4 в клетках HeLa были подавлены с эффективностью ~22,8% и ~81,8%, соотв., при использовании ASOs, ко-трансфицированных векторами, несущими модифицированную U1 snRNA [37].
Преходящий эффект ASOs также наблюдался при лечении RNAi [32]. В подтверждающем исследовании максимальный эффект от использования RNAi для подавления экспрессии аллельного варианта R75W Gjb2 с целью предотвращения GHL проявилось на 3 день после трансфекции, но вернулось к исходному уровню в течение 168 часов [32]. В другом исследовании мышей, несущих миссенс-мутацию Bth, лечили искусственной микроРНК (миРНК), экспрессированной в векторе AAV. Однократная инъекция миРНК, нацеленной на Tmc1, замедлила прогрессирование HL у мышей Bth/+ на срок до 21 недели [49]. Впоследствии в одном из недавних исследований для достижения того же эффекта использовалась искусственная миРНК, но лишь в незначительной степени, что свидетельствует о том, что на результат лечения повлиял возраст мышей [48].
Подавление генов позволило исследователям добиться нокдауна специфических генов-мишеней относительно быстрым и простым способом. Тем не менее, у него есть важные ограничения, в частности, то, что РНК по своей природе нестабильны и легко разрушаются нуклеазами. Поэтому сложно доставить немодифицированные ASO и RNAi в высоких концентрациях для достижения полного замалчивания генов. В то время как вмешательство в гены с помощью ASOs и RNAi является частичным и преходящим, редактирование генов с помощью CRISPR-Cas9 является постоянным. Поэтому с этой точки зрения CRISPR-Cas9 может иметь преимущество перед ASOs и RNAi. Однако доставка систем CRISPR-Cas9 более сложна из-за их относительно большого размера, в то время как в терапии на основе ASOs и RNAi требуется доставка только небольших РНК.
4. Delivery of CRISPR-Cas9 systems


Для доставки генов in vivo можно использовать различные подходы, базирующиеся на разных типах клеток-мишеней, способах введения и терапевтической эффективности. Лабиринтная структура внутреннего уха затрудняет доступ к клеткам-мишеням и медленному распространению агентов редактирования генома. Как показано на рисунке 4, способы доставки генов в клетки внутреннего уха включают: (а) каналостомию, (б) транскраниальные окна в мембране и (в) кохлеостомия в scala tympani и scala media [1,109]. Для доставки Cas9 во внутренние волосковые клетки с целью эффективного редактирования генома было протестировано множество вирусных и невирусных подходов для доставки агентов редактирования генома во внутренние волосковые клетки мышей. Кроме того, в качестве груза для доставки доступны три формы Cas9, включая ДНК Cas9, мРНК и белок, с различными достоинствами и недостатками.



Fig. 4. Inner ear schematic showing established delivery approaches for CRISPR-Cas9 gene-editing system. Established approaches of gene delivery into inner ear cells include canalostomy (a), trans-round window membrane (b), and cochleostomy to the scala tympani and scala media (c) [109]. Viral vectors can be used for the delivery of Cas9 DNA or RNA with sgRNA into the inner hair cells, while non-viral vectors can be additionally used for Cas9 protein delivery (d). Viral vectors and non-viral vectors enter cells through membrane fusion and endocytosis, respectively (e). Delivery of either DNA or mRNA can lead to the expression of Cas9 protein inside the cell, and Cas9 ultimately functions as protein form in genome editing combined with sgRNA (f).
4.1. Delivery vehicles
4.1.1. Viral delivery ...




Table 4. Viral vectors used in gene delivery for GHL studies.

4.1.2. Non-viral delivery...




Table 5. Non-viral methods used in gene delivery for GHL studies.

4.1.3. Delivery cargoes


По сравнению со стратегиями замены и замаливания генов, которые могут быть реализованы путем доставки ДНК и/или РНК, системы редактирования генов CRISPR-Cas9 позволяют более гибко подбирать грузы доставки (табл. 3). С помощью Cas9 был успешно доставлен груз в виде ДНК, мРНК или белка с sgRNA для достижения терапевтического редактирования генома при GHL у мышей (Таблица 6). Доставка Cas9 в виде ДНК или мРНК должна пройти процесс транскрипции и/или трансляции, чтобы в конечном итоге функционировать как белок (рис. 4).
Как уже говорилось в отношении ASOs и RNAi, доставка РНК является сложной задачей из-за их чрезвычайной восприимчивости к РНК-опосредованной деградации. Этот недостаток также относится к доставке мРНК Cas9 [142]. Для решения этой проблемы в последние годы для доставки мРНК Cas9 были адаптированы некоторые липоплексы и полиплексы, такие как полиэтиленимин, протамин, TransIT и MegaFectin [21,143]. Вместо использования этих защитных носителей Mianne и др. [18] непосредственно микроинъецировали мРНК nCas9 в зиготы мышей, несущих гомозиготные рецессивные мутанты. Чтобы избежать быстрого разрушения в результате ферментативной деградации, мРНК транскрибировалась in vitro с помощью реакций capping и полиаденилирования. Коррекция этого фенотипа HL была высокоспецифичной и не сопровождалась нецелевым редактированием в предсказанных сайтах [18].
В отличие от этого, доставка ДНК Cas9 может обеспечить более высокую эффективность редактирования генома, но вызывает более длительное время задержки для запуска экспрессии, избыточные продукты трансгена, вызывающие больше эффекты вне мишени, и, вероятно, более сильный иммуногенный ответ (Таблица 6) [142]. Подходы ex vivo и in vitro были использованы для демонстрации того, что доставка ДНК Cas9 может эффективно вызывать HDR-опосредованное редактирование генома в локусе Slc26a4 с использованием вирусных и невирусных транспортных средств, соответственно [17].
Комплекс Cas9:sgRNA RNP имеет высокий отрицательный заряд и может быть эффективно инкапсулирован в катионные липидные реагенты. Gao et al. [19] и Yeh et al. [20] доставили комплексы Cas9:sgRNA и base editor:sgRNA RNP, соответственно, в улитку новорожденных мышей и успешно индуцировали восстановление волосковых клеток. Когда комплексы были доставлены в мышиные клетки in vitro, наблюдалось лишь несколько случаев нецелевого редактирования [19,20]. Доставка комплекса RNP может повысить специфичность редактирования за счет переходной экспрессии, но может снизить эффективность редактирования мишени [142]. Этот относительно умеренный эффект RNP также был предложен Gyorgy и др., когда они добились предотвращения GHL до одного года у мышей Bth путем доставки ДНК Cas9, упакованной в AAV, тогда как при доставке RNP в той же модели мышей с GHL наблюдалось только кратковременное улучшение слуха [16,19].
5. Disease model


В настоящее время прямая визуализация анатомии слуха человека нецелесообразна. Для структурного анализа и сохранения нейронной ткани в слуховой системе ее необходимо извлекать из организма, что невозможно сделать на живых человеческих телах. Кроме того, изучение слуховой системы человека с помощью современных методов, включающих электрофизиологические анализы, в том числе регистрацию с помощью patch-clamp и анализа эндокохлеарных потенциалов, не представляется возможным [50]. Поэтому оценка результатов генетических манипуляций на установленных моделях животных имеет решающее значение для продвижения в клинику.
5.1. Mouse models


Мыши являются наиболее часто используемыми организмами в исследованиях генетических заболеваний человека, поскольку они поддаются поведенческому и экологическому контролю, имеют короткий срок жизни и обладают низкой генетической гетерогенностью. Мыши являются жизнеспособной экспериментальной заменой человека, поскольку механизм, лежащий в основе слуховой функции мышей, имеет близкое сходство с человеческим. Биологи использовали их в качестве моделей в исследованиях, касающихся анатомического развития и функциональности человеческого уха, и продолжают использовать их для изучения патологических и физиологических причин слуховых нарушений [50].
Полная последовательность генома мыши обнаруживает около 80% сходства с геномом человека [144]. Аналогия в генетическом фоне между мышью и человеком распространяется на гены, ассоциированные с глухотой, как с точки зрения последовательности, так и функции. Все больший интерес вызывает открытие новых генов, лежащих в основе GHL мыши и человека [145,146]. Для достижения этой цели был основан Международный консорциум по фенотипированию мыши (IMPC) (www.mousephenotype.org) в сотрудничестве с 19 международными исследовательскими институтами для разработки нуль-мутантов для всего генома мыши путем определения функции каждого белок-кодирующего гена. На сегодняшний день IMPC (https://www.mousephenotype.org/data/biological-system/hearing) сгенерировал 3 006 нокаутных линий мышей для исследования GHL и подверг их ABR-тестированию для определения порогов слуха [145]. Для распространенных генов, ассоциированных с глухотой, включая Gjb2, Slc26a4, Tmc1, Myo15a, Otof и Cdh23, в International Mouse Strain Resource (IMSR) (findmice.org/index) было создано 274 мышиных модели (последнее обновление в сентябре 2019 года). Среди них только пять генотипов соответствуют генотипам человека (Таблица 7). В ближайшие годы ожидаются дальнейшие наборы данных о мышиных моделях для обычных и новых генов, ассоциированных с глухотой.

Table 7. List of available mouse models with mutations corresponding to human variants in common deafness-associated genes.

Наиболее значительные различия между мышью и человеком обусловлены не только полиморфизмом в генах, кодирующих белки, но и тканевым расхождением экспрессии генов. Следовательно, при одной и той же генной мутации у людей и мышей могут возникать различные фенотипы [147]. Например, при сравнении паттернов экспрессии генов ушной улитки у мышей C57BL/6J и мартышек, различия, выявленные в фенотипах 20 основных генов, ассоциированных с глухотой, были обусловлены вариациями в экспрессии генов между двумя видами [148]. Аналогичные различия наблюдались между экспрессией гена Slc26a4 у человека/мармозетки и мыши [149]. Помимо различий в уровне экспрессии генов, следует отметить некоторые морфологические различия между ушами человека и мыши, учитывая их важные физиологические последствия. Сравнительная анатомия между мышами и людьми показывает, что меньший размер улитки у мышей приводит к меньшей длине базилярной мембраны. Эта жесткая структура разделяет улитку на два внутренних канала и чётко вибрирует в ответ на звук. Длина базилярной мембраны отрицательно коррелирует со слышимым диапазоном частот [150,151]. Следовательно, меньшая длина базилярной мембраны у мышей (~7 мм) по сравнению с человеческой (~35 мм) приводит к тому, что диапазон слышимых частот у мышей (1-100 кГц) выше, чем у человека (0,02-20 кГц) [152,153]. Такая вариабельность слуховой функции, возникающая из-за различий в анатомических размерах, затрудняет определение соответствующих областей улитки у мышей и человека. Эти очевидные различия могут создавать сбивающие с толку переменные при переводе исследований, полученных на мышах, на человека, это указывает на то, что неизвестные эффекты, помимо самого генотипа, влияют на патогенность GHL, и изучение крупных моделей животных, которые могут обладать более схожим с человеком фенотипическим паттерном, может быть оправданным.
5.2. Other animal models


Согласно рекомендациям Управления по контролю за продуктами и лекарствами США (FDA), для клинического применения усовершенствованной генотерапии внутреннего уха следует рассмотреть альтернативные подходящие модели млекопитающих [3]. Хотя большинство врожденных HL вызваны рецессивными мутациями, те, которые прогрессивно повреждают слуховую функцию и могут быть диагностированы на поздней стадии зрелости, вызваны доминантными мутациями [159]. Таким образом, генотерапия доминантных HL с использованием моделей зрелых животных может дать представление о стратегиях позднего вмешательства, а также оценить возможности лечения врожденных HL. Морская свинка - еще одна потенциально полезная животная модель млекопитающих для изучения HL поскольку анатомическое сходство между ушами человека и морской свинки больше, чем между ушами человека и мыши [3,160]. Kawamoto и др. [161] продемонстрировали первый успех избыточной экспрессии Math1 в несенсорных кохлеарных клетках путем доставки гена Math1 с помощью AdVs в модели взрослой морской свинки. Izumikawa и др. [7] вызывали глухоту у здоровых морских свинок с помощью ототоксических препаратов, а затем доставили ген Atoh1 в несенсорные клетки с помощью AdVs, чтобы вызвать регенерацию волосковых клеток. В зрелом внутреннем ухе было достигнуто значительное улучшение слуховой функции [7]. Также было доказано, что векторы AAV могут безопасно применяться для переноса генов в улитку морской свинки [162,163]. Budenz и др. [164] использовали векторы AAV для введения нейротрофина-3 и BDNF во внутреннее ухо глухих морских свинок. Помимо вирусных векторов, в модели морской свинки с GHL использовались и невирусные векторы, такие как липосомы и полиэтиленимин [134,138].
В таблице 8 перечислены другие альтернативные модели животных и классифицированы преимущества и недостатки каждого вида [160]. В будущих исследованиях более крупные модели млекопитающих, такие как макаки-резусы и свиньи, могут стать альтернативными платформами для получения представления о трансляционной эффективности различных исследований GHL Что касается моделей не млекопитающих, то рыбок данио становится все более популярной животной моделью для изучения фундаментальных механизмов слуха [165]. Некоторые гены, такие как cdh23 и ush1c, необходимые для функционирования волосковых клеток у рыбок данио, были связаны с генами у мышей и людей [165]. Таким образом, для развития и функционирования внутреннего уха могут быть использованы те же генетические пути, что и у человека [166]. Однако некоторые данные, полученные у рыбок данио, редко применяются к млекопитающим из-за значительных генетических различий, что затрудняет соотнесение результатов для понимания глухоты у человека [5]. Кроме того, идентификация ряда основных генов, ассоциированных с глухотой, у рыбок данио все еще продолжается. Например, ортолог наиболее часто мутирующего гена глухоты человека GJB2, который кодирует коннексин 26, до сих пор не найдена у рыбок данио с помощью мутагенеза [165].



Таблица 8. Advantages and disadvantages of different animal models that can be used for GHL studies.

6. Conclusion and perspectives


Большое количество исследований с использованием замены генов и подавления генов показало, что генотерапия может быть использована для восстановления слуха в животных моделях наследственной глухоты. Через два столетия после смерти Людвига ван Бетховена технология редактирования генов CRISPR-Cas9 успешно предотвратила прогрессирующую глухоту у мышей Beethoven [19]. До переноса в клинику необходимо решить вопросы увеличения продолжительности экспрессии гена, снижения уровня эффектов вне мишени и повышения эффективности системы доставки. Когда RNAi был использован для уничтожения мутантного аллеля в той же модели мышей Bth [19,49], было обнаружено, что первоначальное улучшение слуха исчезло через 21 неделю. Gao и др. [19] указали, что слух у обработанных мышей со временем ухудшился, что может быть вызвано отсутствием специфичности или неклеточными автономными факторами, при которых необработанные мутантные клетки побуждают близлежащие исправленные клетки проявлять мутантный фенотип [16]. Последующий подход SaCas9-KKH, опосредованный AAV, обеспечил длительное улучшение слуха до годовалого возраста без явной токсичности [16]. Внецелевое воздействие представляет собой серьезную проблему, поскольку любые непреднамеренные модификации являются крайне нежелательными. Недавняя работа по инженерии SpCas9 привела к появлению высокоточных вариантов, таких как гиперточные Cas9 (HypaCas9), которые демонстрируют геномную специфичность с минимальным внецелевым редактированием [87]. В целом, доставка комплекса белка Cas9 и sgRNA имеет меньшие нецелевые эффекты, чем доставка плазмиды Cas9 и мРНК, а использование невирусных подходов приводит к меньшим эффектам вне мишени, чем использование вирусных векторов. Однако постоянной проблемой для систем доставки является комплексная эффективность и безопасность.
Животные модели, такие как мыши Bth, которые несут идентичную замену в ортологичной позиции человека, пользуются большим спросом для доказательных исследований редактирования генов. В отличие от TMC1, редактирование генов было менее изучено в распространенных генах, ассоциированных с глухотой, таких как GJB2 и SLC26A4, из-за отсутствия подходящих моделей заболеваний. Создание моделей GHL у разных видов должно стать проще с использованием технологий CRISPR-Cas9. Редакторы оснований потенциально могут стать полезным инструментом для отмены или установки точечных мутаций, связанных с глухотой.
В заключение следует отметить, что перспективы достижения успехов, достигнутых на животных моделях, при клиническом лечение GHL становятся все более реальными. Мы приближаемся к тому дню, когда пациенты с GHL смогут лечиться и слушать "Оду к радости" под действием генотерапии.