AAV, вирус с дефицитом репликации из семейства Parvoviridae рода Dependoparvovirus, состоит из икосаэдрического белкового капсида диаметром ~26 нм, содержащего геном из одноцепочечной ДНК (ssDNA) размером ~4,7 кб (sense/antisense strand). AAV может реплицироваться при совместной инфекции с вирусом-помощником (AV/вирус герпеса/вирус вакцины) или в определенных враждебных условиях, таких как сильный стресс для клетки или хозяина из-за обработки УФЛ или цитотоксической химической обработки, независимо от вируса-помощника, но ограниченно.¹⁶ AAV ssDNA содержит три гена: Cap (отвечает за синтез капсида, кодируя 60 молекул коллинеарных капсидных белков [VP1, VP2 и VP3 (3:3:54)], идентичных в своей С-концевой части), Rep (контролирует вирусную репликацию, кодируя Rep78, Rep68, Rep52 и Rep40) и AAP (поддерживает сборку вириона, запрограммированную через кодирующую последовательность Cap, используя другую рамку считывания). ¹⁷ Два Т-образных инвертированных терминальных повтора (ITRs) фланкируют геном и выполняют функции начала репликации вируса и сигнала для упаковки.¹⁸ Рекомбинантные AAV (rAAV) - это генетически модифицированные AAV, имеющие сходную с AAV дикого типа последовательность капсида, но не имеющие генов AAV Rep и Cap, поэтому единственными последовательностями вирусной ДНК, сохранившимися в геноме вектора, являются два ITR. Без Rep rAAV не может эффективно интегрироваться в геном хозяина, что делает его непатогенным, не-репликативным вектором.

Трансдукция AAV включает каскад одновременно происходящих событий, включая прикрепление, интернализацию, эндосомально-цитозольную обработку, транспортировку в ядро, распаковку вируса и интеграцию в клетки хозяина (Рисунок 1). Вектор AAV прикрепляется к клеточной мембране хозяина через специфические поверхностные рецепторы. В случае AAV2, он в первую очередь прикрепляется к рецептору гепарансульфатного протеогликана (HSP); однако было также идентифицировано несколько ко-рецепторов, включая рецептор фактора роста гепатоцитов (HGFR), рецептор фактора роста фибробластов I (FGFR1) и αvβ5 интегрины. Многие связывающие рецепторы были идентифицированы в экспериментах по избыточной экспрессии/ингибированию различных серотипов AAV, включая HSP (для AAV2, -3 и -6), N-связанные сиаловые кислоты (для AAV1, -5 и -6), O-связанную 2,3-сиаловую кислоту (для AAV4), N-концевую галактозу (для AAV9) и 37/67 кДа рецептор ламинина (для AAV3, -8 и -9). ¹⁹ Различные серотипы распознают дискретные клеточные рецепторы, демонстрируя различные профили тропизма тканей/клеточных типов. Успешное распознавание поверхностного рецептора приводит к интернализации AAV посредством эндоцитоза, опосредованного рецептором, через ямки, покрытые клатрином.²⁰ AAV, вероятно, проходит через ранние эндосомы Rab5+, поздние эндосомы Rab7+ и рециркулирующие эндосомы Rab 11+, прежде чем, наконец, достигает аппарата Гольджи, где происходит подкисление эндосом.²¹ После цитозольной транспортировки и выхода из эндосом, AAV попадает в ядро, и ssDNA преобразуется в двухцепочечную (ds)DNA либо путем синтеза второй цепочки с помощью механизмов хозяина, либо путем отжига по Уотсон-Крик сопряжению оснований, когда "+" и "-" цепочки геномов в отдельных вирионах достигают ядра.²² Синтезированная вирусная dsDNA подвергается циркуляризации и конкатемеризации путем внутри-/межмолекулярной рекомбинации ITRs, что приводит к стабильности эписомной вирусной ДНК, приводящей к экспрессии интересующего гена в клетках после митоза.



Figure 1. Schematic representation of intracellular AAV transduction via a receptor-mediated pathway See also Schultz and Chamberlain.¹⁹

rAAV последовательно исследовались при различных генетических заболеваниях, таких как гемофилия, пигментный ретинит, муковисцидоз, Сан-Филиппо А и мышечные дистрофии.²³ AAV, хотя и являются эндемичными для человека, не были связаны с каким-либо опасным для жизни заболеванием в различных проведенных доклинических исследованиях. Они были широко изучены в доклинических исследованиях внутреннего уха in vivo (Таблица 1) при различных генетических дефектах.^32-34 На сегодняшний день охарактеризованы двенадцать природных серотипов AAV (1-12), имеющих различный тропизм и потенциал трансдукции в сосудистой системе, сетчатке, мозге, мышцах, печени и легких. Сообщалось, что AAV1, -2 и -8 трансдуцируют outer HCs (OHCs), тогда как AAV1, -2, -3, -5, -7, -8 и -9 были обнаружены во внутренних HCs (IHCs) внутреннего уха²⁵. Было продемонстрировано, что AAV3 при введении через мембрану RW (RWM) избирательно и с высокой эффективностью инфицирует IHC в средней и базальной областях улитки.³⁵ Сообщалось, что supporting cells (SCs) Кортиева органа внутреннего уха также трансдуцируются AAV. О трансдукции столбовидных (pillar ) клеток сообщалось путем AAV1, -2 и -8; клетки Клавдия (Claudius) трансдуцируются с помощью AAV1, -2, -5, -7 и -8; а клетки Дейтерса были положительно инфицированы с помощью AAV1 и -2. AAV1-4, -7 и -8 показали свою эффективность в трансдукции области спирального лимба, т.е., limbus, ганглиозных клеток и связок.²⁵ Для повышения эффективности трансдукции и тропизма были проведены обширные исследования по псевдотипированию, капсидной инженерии или синтезу экзосом из естественных AAV. Стратегия псевдотипирования/гибридных AAV использует геном ITR одного из AAV (наиболее часто упоминается AAV2) и капсидный геном другого для адаптации тропизма/эффективности. Шесть псевдотипированных серотипов AAV2/1, -2/5, -2/7, -2/8 и -2/9 на основе AAV2 с использованием гибридов цитомегаловируса (CMV) были изучены в улитке морской свинки на предмет их тропизма и эффективности с помощью СО через перилимфатическую инъекцию, при этом наиболее эффективным среди всех оказался AAV2/2. Другое исследование показало безопасность и эффективность in utero передачи кохлеарных генов AAV2/1, трансдуцируя клетки предшественники, которые трансдифференцируются в IHC, OHC и SC.³⁶ AAV2/5, содержащий кассету CMVEGFP, продемонстрировал специфический тропизм к SC кортиева органа как в эксплантатах кохлеарного аппарата мыши ex vivo, так и в исследованиях in vivo у взрослой морской свинки путем перфузии scala media.³⁷ Капсидная инженерия облегчила восстановление предковых последовательностей, и на сегодняшний день синтезировано девять функциональных предковых AAV. AAV2/Anc80L65, новый дизайнерский AAV, созданный из предковой последовательности AAV1, -2, -8 и -9, является надежным синтетическим носителем, о котором сообщалось как подходящим для кохлеарной генотерапии in vivo.²⁹ AAV2/Anc80L65 с трансгенной кассетой EGFP, управляемой CMV, показал высокую эффективность и безопасность при трансдукции IHC и OHC через RWM-инъекцию у мышей C57BL/6. Согласно литературным данным, промоторы в определенной степени определяют специфический тропизм AAV; например, гибридный промотор CMV-бета-глобина поддерживает трансдукцию HC, в то время как промотор куриного β-актина (CBA) обеспечивает трансдукцию SC21. Недавние исследования AAV2.7m8 показали более высокую эффективность трансдукции в сенсорных клетках (IHCs и OHCs), внутренних pillar клетках и внутренних phalangeal клетках по сравнению с Anc80L65.³¹ Далее, более сложные подходы к адаптации тропизма и эффективности включают присоединение небольших биологически активных молекул, таких как пептиды, лиганды, биспецифические антитела или биотин (взаимодействует как с вирусными белками, так и с поверхностью хозяина) к вирусному капсиду для достижения нацеливания на хозяина. Например, было продемонстрировано, что AAV, т.е. сконструированный с промотором CAG и пептидом "DGTLAVPFK", пересекает мембраноподобную структуру, что приводит к высокой эффективности трансдукции в HCs и SCs у мышей C57BL/6 при инъекции RWM³⁴. Кроме того, нано-размерные везикулы, выделяемые клетками, необходимые для регулярной межклеточной коммуникации в AAV, известные как экзосомы, продемонстрировали отличную эффективность трансдукции в исследованиях ex vivo и in vivo после RWM или CO инъекции в липому HMGIC fusion partner-like 5 (Lhfpl5)/тетраспан мембранного белка HC стереоцилий (Tmhs)-/- мутантных мышей, демонстрируя частичное восстановление слуха и дисфункции равновесия³⁸. Тем не менее, необходимо детальное изучение возможных побочных эффектов при длительном использовании экзосом, поскольку они состоят из различных биомолекул, включая белок, РНК и другие нуклеиновые кислоты. Искусственные экзосомы могут выступать в качестве альтернативы упаковке AAV, чтобы избежать проблем с безопасностью в клиниках.

Table 1.

Tropism profile of commonly used AAVs for inner-ear transduction

Одним из важнейших недостатков AAV является то, что малая емкость груза (4,8 кб) и размеры груза более 4,8 кб приводят к нестабильности вектора.^39,40 Однако генетические мутации в крупных генах затрагивают значительное число пациентов в различных возрастных группах, которые могут быть вылечены с помощью генотерапии, включая кДНК, кодирующие кадхерин-23 (CDH23; 10 kb), отоферлин (6 kb), миозин 15A (MYO15A; 10. 6 кб), отогелин-подобный (7 кб), миозин 7A (MYO7A; 6,5 кб), протокадхерин-15 (PCDH15; до 5,9 кб) и отогелин (8,8 кб).⁴¹ Для разработки двойных AAV-векторов использовались различные стратегии, включая перекрытие, транс-сплайсинг и гибридные двойные AAV-векторы.^{41- 43} Перекрывающий двойной AAV предполагает намеренное перекрытие двух определенных последовательностей демаркированных фрагментов целевого трансгена в двух AAV, а соединение двух трансгенов в один трансген происходит на основе последовательности перекрытия.^44,45 Двойное перекрытие AAV имеет емкость 8-8,5 кб, так как длина перекрывающегося сегмента ограничена размером кДНК мишени, но это требует обширных исследований для оптимизации дизайна перекрывающихся областей для новых методов лечения, чтобы избежать нежелательных продуктов трансгена.⁴⁶ Другой подход, "транс-сплайсинг трансгена", использует сплайс-последовательности для разделения последовательности целевого трансгена на две половины, которые переносятся двумя AAV, а затем вновь собираются внутри хозяина для создания исходной последовательности трансгена. Конкатемеризованная ITR-структура трансгена будет удалена с помощью собственных клеточных механизмов посредством транскрипции.^47-49 Двухвекторная стратегия транс-сплайсинга AAV привела к превосходной экспрессии трансгена после трансдукции по сравнению с перекрывающимися двухвекторными AAV, но требует дополнительного чужеродного генетического материала, эффективной обработки транскрипта, зависимости от неэффективного процесса конкатемеризации и несет риск потенциально нежелательных продуктов трансгена.^42,50. Гибридная двухвекторная стратегия предлагает решение проблем, связанных с методами, рассмотренными выше, путем объединения перекрывающихся областей с донорами/акцепторами сплайсинга в двухвекторном трансгене.50,51 Этот подход использует высоко-рекомбиногенные гены (например, фаговую ДНК) в дополнение к их сплайсовой последовательности, поддерживающей правильную ориентацию двух половинок двух векторов AAV. В отличие от стратегии перекрытия, для каждой генотерапии не требуется индивидуальный дизайн последовательности ДНК после того, как оптимизирована универсально подходящая последовательность. Однако вектор все еще вводит чужеродную ДНК в клетку, что может вызвать иммуногенный ответ.^42,44,50,52 Недавно гибридный двойной AAV был использован для доставки гена Otof (кДНК ~6 kb) в мутантных мышах Otof-/-, что привело к изменению фенотипа глухоты.^26,53.

Внутреннее ухо представляет собой закрытый отдел, отделенный от системной циркуляции барьером blood cochlea barrier/blood-labyrinthine barrier (BLB), а среднее ухо - RWM. Эти две характерные особенности внутреннего уха затрудняют транспортировку лекарств или биологических материалов к Кортиеву органу и вестибулярному лабиринту. Барьер BLB имеет сходные свойства с барьером "кровь-мозг" и состоит из сосудистых эндотелиальных клеток с плотными соединениями. BLB разделяет кровь/перилимфу, кровь/эндолимфу и эндолимфу/intra-strial жидкость, ограничивая поток к внутреннему уху или от него. Как только терапевтическое средство пересекает BLB путем диффузии или инъекции, в улитке могут возникнуть повышенные концентрации из-за уменьшения распределения, что увеличивает вероятность токсичности. BLB ограничивает движение высокомолекулярных молекул, хотя некоторые препараты могут пересекать ее, если они достаточно липофильны. Препараты или молекулы могут транспортироваться через BLB с помощью специфического/неспецифического эндоцитоза, ионных обменников, транспортеров или ионных каналов. Например, аминогликозиды, ототоксичный класс антибиотиков, легко пересекают стриальную и перилимфатическую BLB с помощью неизвестного механизма, согласно гипотезе, посредством внутриклеточного транспорта с насыщенной кинетикой поглощения. Проницаемость BLB также может изменяться под воздействием внешних факторов, включая осморегуляторы (глицерин, диуретики), воспаление и акустическую травму.⁵⁴

RWM представляет собой полупроницаемую, трехмембранную структуру, средний слой которой состоит из соединительной ткани, расположенной между двумя эпителиальными слоями, соединяющими внутреннее и среднее ухо.⁵⁵ Проницаемость RWM варьирует как между видами, так и внутри видов в зависимости от толщины, размера и заряда RWM, а также от характера терапевтического воздействия. Например, толщина RWM у людей составляет ~70 µм, у грызунов шиншилл - 10^-14 µм, у крыс - 12 ?м, у морских свинок - 10?30 ?м55. Исследования показали, что микросфера размером 1µм может пересечь RWM шиншиллы, но 3µм не в состоянии пересечь ее; молекулы с низким молекулярным весом могут пересечь, но молекулы с высоким молекулярным весом не могут легко пересечь RWM, и катионный ферритин, как сообщается, пересекает неповрежденную RWM, но анионные молекулы не проходят.^55-60 Кроме того, скорость перемещения катионного ферритина через RWM была выше у грызунов, чем у кошек и приматов, что объясняется различиями в толщине RWM.57 Помимо BLB и RWM, защитный мембранный лабиринт, окружающий улитку, обеспечивает структурные ограничения для доступа к внутреннему уху.

SCs, такие как эпителий, образующийся в отоцисте, выстилающий scala media вокруг органа Корти, служат частой мишенью для генотерапии генетической глухоты (например, gap junction protein, beta 2 [GJB2], ген, приводящий к HL из-за мутации коннексина 26 [Cx26]), и находят все большее применение в регенеративной терапии.^61-63 Регенеративные методы лечения основаны на принципе, что потеря HC из вестибулярного или слухового сенсорного эпителия у не млекопитающих позвоночных восстанавливается одновременно с трансдифференцировкой SC.^64-66 Хотя HCs слуховой системы млекопитающих не восстанавливаются, есть сообщения об ограниченной способности к регенерации в вестибулярной ткани млекопитающих путем фенотипического преобразования из SCs особенно на ранних стадиях развития^67,68. Многие исследования в настоящее время изучают индукцию трансдифференцировки путем введения наборов генов для принудительной экспрессии, например, трансдифференцировка кохлеарных SCs взрослой мыши путем избыточной экспрессии транскрипционного фактора Atoh-1 in vitro с использованием временной активности MYC и NOTCH.^69-71 Механотрансдукция звука в кохлеарных HC зависит от электрохимической разницы между кохлеарной жидкостью, т.е. перилимфой и эндолимфой. Stria vascularis (SV), высоко-васкуляризированная эпителиальная ткань, отвечает за образование и поддержание эндолимфы в scala media. Мутации в маргинальных клетках могут вызвать дисфункцию gap-соединений, влияющих на endocochlear potential (EP) и апоптоз HC, что приводит к нарушению слуха, как и в KCNQ1/KCNE1, паннексине и др.^72,73.

IHCs являются истинными сенсорными клетками, которые передают импульсы по слуховому нерву, в то время как OHCs способствуют как качественному (путем повышения избирательности), так и количественному усилению (путем повышения чувствительности) сигнала. При рождении человеческая улитка имеет 3 500 IHCs в одном ряду и 12 000 OHCs в трех рядах. Мутация или дегенерация этих сенсорных клеток приводит к нарушению слуха. IHC и OHC являются наиболее изученными мишенями при генетических или приобретенных в результате воздействия окружающей среды заболеваниях, таких как синдром Ушера (USH)III, мутация TMC1 (трансмембранный каналоподобный 1), мутация VGLUT3 (везикулярный транспортер глутамата-3), шумом индуцированная HL (NIHL) и ототоксичность, вызванная лекарствами (цисплатин, аминогликозиды и другие). ^74-79 Эти слуховые сигналы передаются в мозг через spiral ganglion neuron (SGN), причем SGN I типа (90% от общей популяции SGN ) соединяются с IHC, а SGN II типа (5%-10%) - с OHC. Мозговые нейротрофические факторы (BDNF) и нейротрофин-3 (NT-3) экспрессируются в HCs и SCs в развивающемся органе Корти и необходимы для нормального функционирования SGNs.^80,81 Дегенерация SGNs вызвана дезориентированными ribbons (пучками) синапсов, поврежденными клетками SGN или мутациями в сенсорных клетках, что приводит к не-синдромальному ухудшению слуха.⁸²

Раннее вмешательство - лучшая стратегия лечения любого нарушения слуха, и она остается критически важной для генотерапии внутреннего уха, поскольку повышает вероятность спасения как клеток, так и функций органа. Например, лечение мутации VGLUT3 с помощью инъекции AAV1 в постнатальные дни 1-2 (P1-P2) привело к лучшей трансдукции HC и восстановлению слуха по сравнению с более поздней временной точкой, т.е. P10.⁷⁵ Аналогичные наблюдения были обнаружены при введении AAV5-GJb2 в P42 у нокаутных мышей GJb2 или AAV2/Anc80L65-USH1c в P10-P12 у нокаутных мышей Ush1c. После возникновения HL любое лечение в более поздние сроки не могло спасти дегенерацию в моделях грызунов, что объясняется закрытым терапевтическим окном для лечения.^83,84 В качестве дополнительной проблемы, касающейся времени вмешательства, многие генетические нарушения могут быть наследственными, т.е. врожденными или развиваться в определенный период развития в зависимости от типа мутации. Спасение слуха в случаях раннего/врожденного начала (например, при мутациях SIXI, CHD7 и EYA1) крайне важно, поскольку это негативно сказывается на развитии других функций, связанных со слухом, таких как языковая, социальная и когнитивная функции.^85-87 Недавно было сообщено о генетическом прорыве в мышиной модели OTOF-/-, в которой HL была предотвращена или устранена путем доставки интересующего гена до и после начала HL, что привело к внедрению новой парадигмы для вмешательства в лечение, специфичное для мутаций.^26,53 Однако, все еще важно учитывать заметные различия в процессе развития улитки мышей и человека. У мышей улитка продолжает развиваться после рождения, созревая между P16 и P18, в то время как человеческая улитка созревает до рождения. Это различие во времени обеспечивает большее терапевтическое окно для исследований по спасению у мышей, в то время как у людей для лечения врожденных/развивающихся генных мутаций может потребоваться внутриутробная генотерапия.

Различные хирургические стратегии могут быть рассмотрены для безопасной доставки терапевтических агентов в улитку, не оказывая при этом негативного влияния на ее структуру и функциональность (рис. 2). Стратегии, применяемые для перилимфатической или эндолимфатической доставки терапевтических средств, включают прямую инъекцию через RWM (перилимфатическая доставка),^88-90 СО в барабанную перепонку (перилимфатическая доставка),^91,92 СО в scala media (эндолимфатическая доставка),^93,94 и каналостомию полукружного канала (эндолимфатическая доставка).^95,96 Перилимфатический подход сравнительно более безопасен и был использован в клинической практике при имплантации в улитку у людей.⁹⁷ Эндолимфатическая доставка сравнительно более сложна, оставляет внутреннее ухо уязвимым для повреждения его врожденной структуры/функции, что делает ее клинически неосуществимой. Однако в настоящее время ведутся исследования по созданию более безопасных способов доставки в эндолимфатическое пространство на мышиных моделях.^94,98 Конечной целью для успешной клинической практики является разработка неинвазивного метода доставки трансгена в интересующие клетки внутреннего уха.

">

Figure 2. Schematic demonstrating inner-ear gross anatomy, transport barriers, AAV delivery routes, and anatomical location of commonly addressed preclinical inner-ear mutation leading to hearing loss See also Ahmed et al.⁸²

Системная инъекция не является хорошо изученным методом доставки кохлеарного препарата из-за высокой вероятности внецелевой доставки, нежелательных побочных эффектов, токсичности или ограничения транспортировки в BLB. У грызунов, включая мышей и крыс, BLB развивается и созревает даже после рождения до P14,^99,100 , что обеспечивает более широкое терапевтическое окно для изучения нарушений слуха в процессе развития. Shibata и коллеги¹⁰¹ вводили rAAV2/9 внутривенно системным путем мышам P1 дикого типа и сообщили об успешной трансдукции генов IHC, вестибулярных HC и SGN. Эффективность трансдукции зависела от дозы, серотипа вируса и возраста введения. Трансдукция наблюдалась binaurally в HC по всей длине улитки (т.е. от верхушки до основания с 96% в апикальной части), и способность слышать не страдала у обработанных мышей до 30 дней исследования. Дальнейшие исследования по изучению различных серотипов и их профилей тропизма потребуются для улучшения нацеливания для повышения специфичности и уменьшения внецелевых эффектов. Другие препятствия, влияющие на эффективность, включают иммунный ответ хозяина, нейтрализующие антитела и удаление вирусных частиц в крови, что требует дополнительного рассмотрения перед разработкой новых векторов для системной доставки.^102,103

При внутрикохлеарной доставке вирусные векторы переносятся через RWM или oval window (OW) в scala tympani (перилимфа) или scala media (эндолимфа), соответственно. OW соединяется с внутренним ухом через среднее ухо посредством стремечка, и для доступа к нему у людей требуется трансканальная или трансмастоидальная микрохирургическая процедура. У грызунов меньший размер, форма буллы и ее относительное анатомическое положение относительно улитки облегчают визуализацию RWM по сравнению с OW. RWM - это трехслойная мембранная структура, соединяющая среднее ухо с внутренним, анатомически расположенная ниже и кзади от OW. Поскольку RWM более легко доступна для различных терапевтических подходов, чем OW, ее чаще исследуют для доставки генов в животных моделях. До сих пор было показано, что перилимфатическая доставка AAV посредством инъекции в РВМ частично спасает слух у модельных мышей TMC1, TMC2 и USH1C.^74,84 Однако этот подход имеет значительные негативные последствия, такие как утечка перилимфатической жидкости, перенос вируса в мозжечок и перекрестный перенос в противоположное внутреннее ухо через кохлеарный проток, гематогенное или системное распространение через костный мозг височной кости.^{103, 214} Эти негативные последствия могут привести к дальнейшему необратимому повреждению слуха и опасным для жизни осложнениям. Риск утечки перилимфы может быть снижен путем закупоривания фасции в местах перфорации RWM, но результат непредсказуем.^104,105 Другим нежелательным эффектом, наблюдаемым при внутрикохлеарном введении, является ограниченное распространение вируса, обусловленное низкой скоростью потока кохлеарной жидкости у взрослых мышей. После инъекции RWM была обнаружена высокая локальная концентрация вирусных векторов с градиентом эффективности от основания к вершине из-за медленного распределения и, как следствие, плохой трансдукции, что привело к высокой терапевтической концентрации в базальной области, но субтерапевтической в апикальной области.¹⁰⁴

Каналостомия - доставка вируса/биомолекул в полукружной канал - была применена у грызунов для доставки AAV в улитку, и аналогичный процесс возможен у людей с помощью трансмастоидальной хирургии. К настоящему времени в кортиев орган с помощью каналостомии были доставлены AAV нескольких серотипов, что привело к успешной трансдукции IHCs и OHCs без негативного влияния на функцию улитки.^95,96 Следует отметить, что комбинированное лечение с помощью инъекции RWM и semicircular canal fenestration (CF) привело к более высокой эффективности трансдукции благодаря равномерному распределению AAV, обеспечиваемому CF, уменьшающему внутрикохлеарный градиент AAV и способствующему продольному потоку AAV по всей улитке.¹⁰⁵ Превосходство каналостомии над доставкой RWM/OW должно быть детально изучено перед переводом в клиники для людей, так как это сравнительно более инвазивный метод с потенциальными осложнениями, подобными тем, которые возникают после восстановления superior canal dehiscence syndrome (SCDS), включая значительное (хотя и временное) послеоперационное головокружение и риск полной HL из-за утечки или потери эндолимфатической жидкости.¹⁰⁶

Этот подход был широко изучен для доставки лекарств и зависит от абсорбции или проницаемости вводимого материала из среднего уха во внутреннее ухо через неповрежденную РВМ. Были попытки использовать гелевую пену для устойчивой доставки интракохлеарной диффузии на интактной RWM для кохлеарной доставки генов, но она не смогла доставить значительные трансгены для трансдукции HC, предполагая, что RWM не проницаема для rAAV.¹⁰⁷ В другом исследовании трансдукция rAAV в улитку через RWM изучалась с помощью коллагеназы I или II, что повысило эффективность по сравнению с необработанными; однако результаты были хуже, чем при прямой инъекции через RWM, и могли повредить структуру RWM.⁸⁸ Катионные липосомы и некоторые вирусные векторы, такие как АВ, могут осуществлять трансдукцию через RWM, подобно диффузии небольших лекарственных молекул, однако эффективность трансдукции низкая.¹⁰⁷ В другом исследовании были разработаны dsRNA-связывающие домены TAT (TAT-DRBDs) для улучшения доставки коротких интерферирующих РНК (siRNA) через неповрежденный RWM во внутреннем ухе шиншиллы, продемонстрировав успешную трансфекцию IHC, OHC, macula sacculi, macula utriculi и crista ampullaris^108. Транстимпанальная стратегия в настоящее время имеет такие преимущества, как неинвазивность, широкое знакомство врачей с этой техникой и более короткое время лечения, требующее только местной анестезии. В то же время, ее применение сдерживается ограниченной проницаемостью, вариабельностью толщины RWM (как межвидовой, так и внутривидовой), а также незначительным движением жидкости внутри улитки.

Различные патологии и молекулярные механизмы могут вызывать нарушения слуха, что делает жизненно важным разработку специфической или комбинаторной стратегии лечения отдельных нарушений. Стратегия лечения генотерапии SNHL во внутреннем ухе включает замену, подавление или редактирование целевого гена, который выбирается после рассмотрения различных факторов (табл. 2). Замена гена - это наиболее распространенная стратегия лечения, используемая в генотерапии внутреннего уха на сегодняшний день, при которой во внутреннее ухо доставляется копия интересующего гена дикого типа. Стратегия замены генов рекомендуется при мутациях, приводящих к потере функции или изменению сплайсинга, что приводит к рецессивно наследуемым заболеваниям или, в случае гаплонедостаточности, к доминантно наследуемым заболеваниям. Стратегия замены генов была успешно применена in vivo в животной модели HL с мутантами TMC1, Vglut3, Whirlin, GJB2 и Clarin-1 (CLRN1).^61,74-76,115 Для успешного лечения заменой генов необходимо наличие соответствующего лечебного окна, стабильная экспрессия гена или повторное введение в другой период для поддержания функции. Однако мутации, приводящие к синтезу неправильно сформированных или нефункциональных белков с доминантно-отрицательным эффектом, не могут быть эффективно вылечены только с помощью этой стратегии.



Table 2. Mutation, therapeutic strategy, and outcomes of genetic mutation studied pre-clinically in inner ear

Для доминантных мутаций, приводящих к HL, может быть использовано подавление генов или редактирование генов. Глушение генов "выключает" экспрессию мутантного гена с помощью антисмысловых олигонуклеотидов (ASOs), микроРНК (miRNA) или siRNA. Подавление генов может осуществляться на транскрипционном или пост-транскрипционном уровнях. На транскрипционном уровне глушение генов достигается с помощью CRISPR-Cas9 или сконструированных нуклеаз с цинковыми пальчиками (ZFNs). Пост-транскрипционное глушение генов осуществляется с помощью ASO, siRNA или miRNA. ASO представляют собой сконструированные нити ДНК или РНК, которые связываются со специфическими мРНК, ингибируя трансляцию/способствуя деградации ферментами, такими как РНКаза Н. Другим подходом к подавлению генов является РНК-интерференция (RNAi) с использованием комплементарных ds-siRNA или miRNA для генов-мишеней, где активируется путь RNAi, что приводит к расщеплению мРНК и нокдауну гена. Подходы к подавлению генов были успешно использованы in vivo у модельных животных с HL-мутантами USH1C, TMC1 и GJB2.^{109,113,122,123} Глушение генов приводит к временной экспрессии трансгенов и требует повторного введения трансгенов через заранее определенный период времени; однако доставка siRNA/ASO с помощью векторов AAV считается одноразовой процедурой. Редактирование генов является более точным, чем глушение генов, и требует использования таких агентов, как ZFN, CRISPR-Cas9 и транскрипционная активатор-подобная эффекторная нуклеаза (TALEN), которые позволяют избежать внецелевого воздействия, что приводит к полному нокауту гена по сравнению со стратегией RNAi. Средства редактирования генов основаны на разработанных нуклеазах, которые нацелены на интересующие гены, направляя ssDNA или dsDNA для воздействия на врожденные механизмы репарации ДНК через негомологичное соединение концов (NHEJ) или гомологично направленную репарацию (HDR). Стратегия CRISPR-Cas9 является наиболее мощным и часто используемым инструментом редактирования генов с простыми методами конструирования и гибкостью для адаптации к различным приложениям. Процесс восстановления ДНК происходит по пути NHEJ, который подвержен ошибкам, и это может вызвать вставку или удаление нуклеотидов, что приводит к сдвигу рамки и усеченным белкам. Стратегия CRISPR была применена in vivo в модели мутанта TMC1.^124,125 Недавно были предприняты усилия по разработке нуклеазы CRISPR с различной специфичностью протоспейсерного смежного мотива (PAM), включая уменьшение активности вне мишени, что способствует более точной технике.

Наиболее распространенными причинами генетических заболеваний HL являются рецессивные точечные мутации, которые необходимо корректировать, а не нарушать (поскольку мутацию несут оба аллеля, а не один, как в случае доминантной мутации), чтобы принести пользу пациентам. В этом контексте редактирование оснований имеет потенциал для прямого исправления точечных мутаций и терапевтического восстановления функции гена при рецессивной мутации, вызывающей HL. Недавно Yeh и др.¹¹¹ разработали стратегию редактирования оснований для лечения рецессивной мутации Tmc1, вызывающей глухоту. Им удалось вернуть 51% мутантного TMC1 к последовательности дикого типа, что привело к восстановлению низкочастотного слуха. Эти данные подтверждают дальнейшее развитие технологии редактирования оснований для исправления точечных мутаций, вызывающих наследственные заболевания человека.

Кроме того, оно может служить альтернативой замене генов, когда существует вероятность неожиданных неблагоприятных последствий из-за избыточной экспрессии трансгена in vivo или требуется повторное введение трансгена через заранее определенный период времени. Хотя редактирование генов представляется одноразовым методом лечения с многообещающим длительным терапевтическим эффектом, имеются сообщения о потенциальном внецелевом мутагенезе, геномных мутациях, крупных делециях и перестройках, повреждении на месте, биаллельной модификации и генетическом мозаицизме в обработанном организме.¹²⁶ Редактирование генов требует тщательного изучения терапевтического промежутка времени для вмешательства у мышей или людей и долгосрочной оценки безопасности агентов редактирования, доставляемых с помощью вирусных векторов.

SNHL - распространенное заболевание среди людей, частота которого в США составляет 186 случаев на 100 000 рождений.¹²⁷ Более 50% случаев врожденной SNHL обусловлены генетической этиологией, и подавляющее большинство из них вызваны не-синдромальными причинами. Генетическая СSNHL, в зависимости от типа мутации, может иметь различные темпы прогрессирования. Ген глухоты, вовлеченный в HL, часто играет важную, незаменимую роль в структуре, развитии или функции внутреннего уха. Предварительные исследования доставки генов при генетической HL были успешно проведены на многих мутантных моделях грызунов, имитирующих человеческие заболевания HL (табл. 2).

Ген SLC17A8, кодирующий VGLUT3, отвечает за DFNA25 (12q21-q24) у человека, который характеризуется аутосомно-доминантной, высокочастотной и несиндромально-прогрессирующей HL¹²⁸. Синаптическая передача в окончаниях слухового нерва от IHC требует глутамата для переноса возбуждающих аминокислот в секреторные синаптические везикулы с помощью VGLUT1-3 (экспрессируется в IHC) перед их экзоцитотическим высвобождением.^128-131 Сообщалось об успешном восстановлении/спасении от HL путем вирусной замены генов у мышей с нокаутом VGLUT3. Это исследование стало первой демонстрацией успешной генотерапии дефектов внутреннего уха у млекопитающих.⁷⁵ Инъекция AAV1, доставляющего VGLUT3-GFP в Р10, показала наличие 40% экспрессии, тогда как аналогичная доза между Р1 и Р3 привела к 100% трансдукции VGLUT3 в IHC. У большинства мышей с инъекцией RWM улучшился слух при тестировании слухового ответа ствола мозга (ABR), тогда как морфология синапсов улучшилась частично. Данное исследование продемонстрировало потенциал генотерапии для восстановления слуховой функции и новой парадигмы мотивированных исследований для других генетических заболеваний HL.

USH, аутосомно-рецессивный сенсорный дефект, характеризующийся препубертатной прогрессирующей слепотой, SNHL и вестибулярной арефлексией, составляет 3%-6% врожденной глухоты, поражающей 16 000-20 000 человек в США.^132-134 USH имеет три клинических подтипа USH I-III, причем USH I является наиболее распространенной и тяжелой формой, характеризующейся глубокой глухотой при рождении и отсутствием вестибулярной функции. В настоящее время пациенты с USH I лечатся кохлеарными имплантами. Гены, ассоциированные с USH I: MYO7A (USH IВ, 11q13.5), USH IС (гармонин; 11p15.1-p14), CDH23 (USH ID, 10q21-q22), PCDH15 (USH IF, 10q11.2-q21), SANS (sans; УШ 1G, 17q24-q25)18 и CIB2 (кальций и интегрин-связывающий белок 2; USH IJ, 15q25. 1).^135-141 Белки USH1 важны для структуры и морфогенеза пучков механосенсорных волосков, анатомически локализованы в вершине HCs и связываются с гармонином, лежащим в ядре интерактома USH1. Ген гармонина содержит 28 экзонов, кодирующих десять альтернативных форм сплайсинга, разделенных по составу белковых доменов на три подгруппы: гармонин a, b и c.^135,136 Сплайс-форма гармонина "a" анатомически локализована в синапсах HC, где она связывается с кальциевыми каналами через убиквитин-зависимый путь и поддерживает синаптическую передачу.^141,142 Гармонин "b" присутствует в кончиках стереоцилий, образуя третичный комплекс с миозином VIIa и Sans, играя важную роль в сенсорной трансдукции как слуховых, так и вестибулярных HCs.^143-145 Для спасения USH1C в мышиной модели было использовано подавление гена с помощью ASO, разработанного против 216A РНК, чтобы блокировать криптический сплайсинг 216A. ASO, введенные внутрибрюшинно взрослым мышам с мутацией, корректировали сплайсинг с увеличением зависимой от дозы экспрессии гармонина. Интересно, что у мутировавших мышей, которых лечили в возрасте P3, P5, P10 или P13, не наблюдалось кругового движения (улучшение вестибулярной функции), но когда их лечили в возрасте P16, круговое поведение было таким же, как и у нелеченых. Кроме того, лечение также восстановило слух, что было проанализировано путем количественного измерения порогов ABR. Однократная доза ASO между P3 и P5 спасла слух на низких частотах, т.е. 8 и 16 кГц, но не смогла улучшить пороги на более высоких частотах (32 кГц). При инъекции в возрасте P10 у мышей был значительно выше порог по сравнению с P3, P4 и P5, что указывает на терапевтическое окно для лечения. Терапевтический эффект, оказываемый ASO, мог сохраняться в течение 3 месяцев.¹⁰⁹ Однако механизм систематической доставки ASO для пересечения BLB и трансфекции клеток до сих пор неизвестен. В более позднем исследовании использовался подход замены генов путем доставки гармонина a или b во внутреннее ухо мутантных мышей с использованием AAV2/ANC80 в качестве переносчика через RWM на ранней постнатальной стадии. Интересно, что введение только гармонина b было достаточно для частичного восстановления слуховой и вестибулярной функций по сравнению с совместным введением гармонина a и b. Восстановление слуха было значительным на низких частотах, но отсутствовало на высоких частотах.⁸⁴ Однако для восстановления функции базальной области вмешательство гармонина c может играть существенную роль. В качестве альтернативы, базальная область может находиться за пределами терапевтического окна, учитывая, что развитие начинается в базальной области с P1. Если верно последнее, то эмбриональная инъекция может быть более эффективной для спасения слуха на высоких частотах.^36,146

USH3A вызывается мутацией в гене CLRN1 и характеризуется постлингвальной прогрессирующей HL и потерей зрения, сопровождающейся различной вестибулярной дисфункцией.^147,148 Прогрессирующая HL при USH3 у человека обычно начинается в возрасте до 10 лет и усугубляется между 30 и 40 годами.^149,150 CLRN1 - тетраспановый белок, участвующий в морфогенезе волосяного пучка и плотной кластеризации пресинаптических CaV1.3 каналов, необходимых в ленточном синапсе HC.^151,152 Отсутствие или дегенерация CLRN1 может привести к аномальной кластеризации кальциевых каналов, снижению эффективности экзоцитоза и последующим пост-синаптическим дефектам. Интересно, что введение AAV2/8 Clrn1 между P1 и P3 мышам с нокаутом TgAC1 практически не повлияло на HL. Однако, когда Clrn1 был модифицирован последовательностью UTR, мутантные мыши показали улучшение структуры HC и значительно лучший слух по сравнению с необработанными мышами. В отличие от этого, нокаутные мыши не показали никаких улучшений при введении AAV2- или AAV8-Clrn1-UTR между P1 и P3, поскольку дегенерация HC в этой мутантной модели начинается очень рано.²¹³ Эти результаты подтверждают необходимость вмешательства генотерапии до начала генетической дегенерации, приводящей к необратимому повреждению структуры Кортиева органа.⁷⁶ В недавнем исследовании сообщалось о сохранении морфологии HC с помощью одной инъекции AAV2/8 Clrn1 между P1 и P3 у мышей Clrn1ex4fl/fl Myo15-Cre+/-, тогда как у мышей Clrn1ex4-/- KO улучшения практически отсутствовали, что указывает на потенциал генотерапии как альтернативного метода лечения пациентов с USH3A^76,110.

Ген LHFPL5 (6p21.3), также известный как ген TMHS, отвечает за аутосомно-рецессивную несиндромальную HL (ARNSHL) у людей (DFNB67) и hurry-scurry глухоту у мышей.^153-155 TMHS локализуется вблизи кончиков стереоцилий, где он играет жизненно важную роль в поддержании сборки кончиков, механосенсорной трансдукции (МТ) и регуляции каналов МТ путем взаимодействия с компонентом кончиков PCDH15, как показано в исследованиях соосаждения.^156,157 Исследование показало доставку генов Lhfpl5 in vivo у мышей Lhfpl5-/- с помощью экзосом AAV1. Экзосомы AAV1 обладают большей эффективностью трансдукции, чем обычный вектор AAV1. Сообщалось, что он эффективно трансдуцирует как IHC, так и OHC. Экзосомы AAV1 были трансдуцированы мышам Lhfpl5-/- путем инъекции RWM на ст. P0 или P1; у обработанных мутантных мышей наблюдалось улучшение слуха и аномальных движений, связанных с равновесием. Однако полностью спасти HL не удалось, что может быть связано с ограниченным терапевтическим окном для лечения Lhfpl5. Экспрессия Lhfpl5 начинается уже на 16,5 день эмбрионального развития (E16,5), а дегенерация у нокаутных мышей становится заметной к ст. P8.³⁸ Несмотря на частичное восстановление слуха, стратегия AAV, связанная с экзосомами, является важным шагом вперед в стратегии генотерапии внутреннего уха.

Рецессивные мутации в TMC1 человека составляют от 4% до 8% случаев генетической глухоты, приводящей к врожденной HL DFNB7/11, тогда как доминантные мутации часто приводят к прогрессирующей HL DFNA36.^158,159 TMC1 и TMC2 являются важными компонентами МТ-каналов (катионных каналов с высокой проницаемостью для Са2+), анатомически расположенных на кончике более коротких стереоцилий HCs, которые отвечают за преобразование звука в электрические сигналы.^160-163 TMC2 экспрессируется на ранних стадиях постнатального развития улитки и замещается TMC1 в конце первой постнатальной недели.^163,164 У людей начало HL, опосредованной мутацией DFNA36, происходит в возрасте 5-28 лет, а глубокая HL развивается в возрасте 60 лет, что обеспечивает большее временное окно для успешного терапевтического вмешательства. Лечение может позволить восстановить средне- и высокочастотный слух.^163-165 Мыши Beethoven (Bth) с мутацией p.M412K являются хорошей моделью для DFNA36, в то время как мыши с нокаутом TMC являются хорошей моделью для DFNB7/11.^163,166,167 В исследовании Askew et al.²⁴, исследователи пытались спасти HL у TMC1-KO и Bth мутантных мышей с помощью генной заместительной терапии путем доставки TMC1 или TMC2 дикого типа с помощью вектора AAV2/1 с CBA промотором через инъекцию RWM. Введение AAV2/1-TMC1 в P0 и P2 мышам TMC1-KO восстановило механотрансдукцию в IHC-, но не OHC-обработанных мышах и не показало улучшения в искажениях отоакустической эмиссии (DPOAE; OHC), но ABR показало частичное восстановление порога слышимости. Введение AAV2/1-TMC2 мышам Bth также сохранило HL в той же степени, что и ABR у обработанных мышей, но не восстановило реакцию испуга, что говорит о том, что TMC1 и TMC2 могут частично заменять друг друга.¹⁶⁷

В другом исследовании по глушению генов с помощью одной инъекции в RWM (P0 и P2) rAAV2/9, несущей искусственную миРНК, подавлялась экспрессия доминантного аллеля, несущего одну миссенс-мутацию у мышей Bth. У мышей Bth, прошедших лечение, наблюдалось улучшение выживаемости HC и задержка начала прогрессирования HL до 35 недель, в то время как не-леченные мыши Bth обычно глохли к 17-21 неделе.⁸⁹ Защитное действие миРНК на HC продолжалось в течение 35 недель, что значительно дольше, чем терапия по замене гена Vglut3 с помощью AAV2/1, при которой функция ухудшается к 6 неделям. Эти результаты также были значительно дольше, чем при терапии замещения гена метионинсульфоксид-редуктазы B3 (MsrB3) с помощью rAAV2/1, которая длилась 3 недели.^75,89,114 Все вышеуказанные исследования проводились на неонатальной или внутриутробной стадии.

Yoshimura et al.¹¹³ продемонстрировали замедление прогрессирования HL, защиту HC и предотвращение дегенерации стереоцилий путем глушения генов с помощью миРНК в векторе AAV2/9, используя инъекции RWM с CF у половозрелых мышей Bth. У мышей Bth, которых лечили в возрасте P15-P16, порог ABR снизился на 50 дБ за 20 недель, P56-P60 - на 30 дБ, а P84-P90 - без снижения. Лечение в P15-P16 и P56-P60 показало защиту пучков стереоцилий и уровень дегенерации IHC, что подтверждает улучшение результатов ABR. Однако лечение в возрасте P84-P90 не показало улучшения слуховой функции, что говорит о том, что возраст животных, получавших лечение, напрямую влияет на результаты терапии. Слуховой порог у обработанных миРНК мышей был выше, чем у мышей дикого типа, что указывает на неполное восстановление функции, которое может потребовать модификации миРНК или продолжающейся необратимой потери HL. Это исследование позволило предположить терапевтическое окно находится между 8 и 12 неделями после рождения.¹¹³ Другое исследование, проведенное Nist-Lund и др.⁷⁴ , показало значительное восстановление слуховой и вестибулярной функции с помощью AAV2/An80L65-TMC1/TMC2 с промотором CMV в мышиной модели DFNB7/11. Леченные мутантные мыши показали восстановление сенсорной трансдукции в IHC и OHC, с улучшением порогов ABR и DPOAEs, и были способны управлять слуховым поведением (т.е. реакцией пугания) у леченных мышей. В исследовании сообщалось о зависимости скорости трансдукции от возраста мышей, которая меняется от 93% в возрасте P1 до 3% в возрасте P14, предполагая, что эффективность снижается по мере развития мышей. Для оценки вестибулярной функции TMC2 находится в вестибулярном органе, куда его вводили на неонатальной и зрелой стадиях. Значительное восстановление вестибулярной функции наблюдалось у мутантных и двойных мутантных мышей TMC1/TMC2 после инъекции TMC1 или -TMC2, как на ранней, так и на зрелой стадии развития. Двойные мутанты TMC1 и TMC2 глухие с вестибулярной дисфункцией и ограниченной эффективностью размножения, демонстрируя потомство с более низкой выживаемостью и замедленным ростом. После лечения примерно 80% помета дожили до P21, а их вес почти сравнялся с аналогичными по возрасту детенышами дикого типа. Генотерапия TMC улучшила слух и равновесие и привела к повышению успешности размножения, выживаемости и скорости роста, что указывает на возможность ее применения в клинической практике для лечения рецессивного DFNB7/11 HL.⁷⁴

В недавнем исследовании György et al.¹¹² проверили 14 комбинаций Cas9/направляющая РНК (gRNA) для специфического и эффективного разрушения нуклеотидной замены, которая вызывает доминантно-прогрессирующий HL, DFNA36. Они также определили PAM-вариант Staphylococcus aureus Cas9 (SaCas9-KKH), который избирательно и эффективно разрушает мутантный аллель, но не аллель Tmc1/TMC1 дикого типа, у мышей Bth и клеточной линии человека DFNA36. AAV-опосредованная доставка SaCas9-KKH предотвращала глухоту у мышей Bth до 1 года после инъекции. После лечения у мышей наблюдалось устойчивое сохранение порогов на низких частотах (8 и 16 кГц), но меньшее восстановление на высоких частотах (32 кГц). Анализ текущих записей ClinVar показал, что 21% доминантных мутаций человека могут быть пригодны к подобному подходу со значительным улучшением по сравнению с предыдущими стратегиями, при которых сохранение слуха было незначительным и не сохранялось даже на низких частотах.¹¹² В другом недавнем исследовании Yeh et al.¹¹¹ попытались использовать стратегию однократного редактирования оснований для постоянной коррекции патогенного аллеля в рецессивной мутации Tmc1, которая вызывает глухоту. С помощью этой стратегии им удалось вернуть 51% мутантного TMC1 к последовательности дикого типа, что привело к восстановлению низкочастотного слуха.¹¹¹ Для предотвращения прогрессирующей HL два недавних исследования зафиксировали связь между выживаемостью HC и стабильными порогами слуха, предполагая, что для стабильного слуха необходимо более 75% выживаемости HC.^74,168 В данном исследовании также было замечено, что 46% выживаемости HC через 4 недели соответствует продолжающейся прогрессирующей HL. Хотя данное исследование дает новое представление о подходах к редактированию генов как стратегии лечения рецессивных мутаций, оно также ставит проблемы, которые еще предстоит изучить, включая исследование терапевтического временного окна для вмешательства у мышей или людей и долгосрочную оценку безопасности агентов редактирования, доставляемых с помощью вирусных векторов. Будущие исследования могут включать усовершенствование вирусных капсидов для повышения эффективности трансдукции, промоторов для снижения возраст-зависимой трансдукции, миРНК, Cas9, PAM-секвенирования, улучшение экспрессии редактора оснований, интрон-опосредованного сплайсинга и эффективности редактирования оснований для повышения степени подавления/редактирования мутаций без внецелевых реакций, а также улучшение методов введения для обеспечения гомогенного распределения.

Дефицит Msrb3 человеческого гена DFNB74 вызывает ARNSHL, ведущую к врожденной глухоте.¹⁶⁹ Msrb3 экспрессируется в HCs; его дефицит вызывает искажение морфологии пучков стереоцилий и, наконец, апоптоз HCs, вызывая HL.¹⁷⁰ В одном исследовании анализировалось лечение мутантных мышей с Msrb3 путем доставки гена Msrb3 мышам с нокаутом Msrb3 (Msrb3-/-) с помощью rAAV2/1.¹¹⁴ Поскольку у мышей с нокаутом Msrb3 глухота врожденная, ген Msrb3 вводили in utero в отоцист на cт. E12.5, и у обработанных мышей наблюдалось восстановление HL на P28. Морфология пучков стереоцилий в обработанных ушах была аналогична контрольным ушам, а эффективность трансдукции была очень высокой на P28: более 90% для IHC и более 83% для OHC. Мутантные мыши Msrb3 не реагировали на стимул щелчка или тональную вспышку, в то время как обработанные мыши показали нормальный порог, аналогичный дикому типу, на всех частотах. Улучшенный HL начал деградировать на более высоких частотах через 4 недели после лечения. Экспрессия Msrb3 наблюдалась в основном в HCs, тогда как для поддержания слуха у взрослых мышей может потребоваться более широкая экспрессия. Следовательно, для продления жизни можно использовать либо другой вариант AAV, либо повторное введение того же AAV. Это исследование стало первым сообщением о внутриутробной доставке AAV для генотерапии врожденной HL.²⁴

Мутации в GJB2, или Cx26, могут привести к двусторонней нейросенсорной ARNSHL (DFNB1) и аутосомно-доминантной HL (DFNA3) у людей.^171,172. Ген GJB2 кодирует tetraspan трансмембранный белок Cx26, компонент эпителиального канала gap junction, облегчающего транспортировку сигнальных молекул между соседними клетками.^173,174 Предполагается, что Cx26 способствует рециркуляции калия (K+) в эндолимфатической жидкости для поддержания потенциала эндолимфы. Потенциал эндолимфы у мышей появляется примерно на ст. P5 и достигает своего обычного уровня к P18.^175,176 Было показано, что отсутствие Cx26 приводит к дегенерации HC через неадекватную рециркуляцию K+, что приводит к апоптозу сенсорных, несенсорных и SGN, вызывая прогрессирующую HL. Было изучено несколько стратегий восстановления Cx26 и спасения HL с частичным успехом. Yu и др.¹²⁰ использовали генную замену через AAV2/1 доставку GJB2 через scala media у условно нокаутных мышей с Cx26. Доставка GJB2 уменьшила дегенерацию HC и SGNs, однако это не привело к устранению HL. Неспособность восстановить слух может быть связана с плохой трансдукцией или сужением терапевтического окна, поскольку экспрессия Cx26 начинается с E14.5, а лечение в настоящем исследовании началось на P0-P1, т.е. за пределами окна развития, что может негативно повлиять на восстановление функций.¹²⁰ Электрохимическая среда эндолимфы чувствительна к физиологическим изменениям, что было продемонстрировано в предыдущем исследовании, где использовался объем инъекции более 8 нл в scala media, что привело к набуханию OHC и уменьшению IHC из-за снижения потенциала эндолимфы. Введение буфера, богатого Na+, в эндолимфу, богатую K+, могло прервать механотрансдукцию в HC, что может быть причиной того, что HL не улучшилась в этом исследовании.^177,178 В более позднем исследовании Iizuka et al.⁸³ изучалась доставка GJB2 мышам с нокаутом по специфическому для отического пузырька Cx26, используя AAV1 путем введения в перилимфу через RWM. Эта стратегия показала снижение дегенерации кохлеарных структур и улучшение порогов ABR у обработанных мышей. Исследование также показало, что у мутантных мышей не открылся тоннель Корти, который обычно открывается к ст. P10 у мышей дикого типа, что указывает на дефект развития.⁸³ Генотерапия для СГН также была исследована у мышей с условным нокаутом Cx26 с использованием AV для доставки BDNF через scala media или scala tympani. Доставка BDNF через scala media или scala tympani может уменьшить дегенерацию SGNs в области основания улитки со спасенными нейронами, демонстрирующими морфологию, схожую с нейронами дикого типа.¹⁷⁹ Эти исследования выступают за использование комбинаторного подхода, т.е. генов и нейротрофических факторов, доставляемых с помощью усовершенствованной вирусной генотерапии, для устранения HL в моделях мутанта Cx26.

Ген WHRN кодирует вирлин, предполагаемый белок PDZ-каркаса. В зависимости от типа аллеля и мутации, он может вызывать у человека либо ARNSHL DFNB31, либо USH 2 типа (пигментный ретинит и умеренная SNHL без вестибулярной дисфункции)^180,181. Whrn состоит из 13 экзонов с двумя основными вариантами сплайсинга: длинная изоформа (WHRN-L), которая кодируется экзонами 1-13 и состоит из двух PDZ доменов на N-конце, затем пролин-богатого домена и третьего PDZ на С-конце, и короткая форма (WHRN-S), которая кодируется экзонами 6-13, в которой отсутствуют PDZ1 и PDZ2 на N-конце.^180,182,183. Белок Whirlin обнаруживается в ankle joint стереоцилий вместе с другими белками Usher type II USH2A, GPR98 и PDZD7 постнатально, тогда как на зрелой стадии он присутствует в кончиках стереоцилии HC. Миозин-XVa взаимодействует с вирлином, и это необходимо для его транспортировки к кончику стереоцилии. Спасти HL от мутации WHRN путем доставки гена дикого типа мутантным мышам не удалось. У мышей WHRN-/-, обработанных длинной изоформой AAV2/8-WHRN, введенной через RWM, восстановилась нормальная морфология стереоцилий, но улучшения слуховой функции у обработанных мышей не наблюдалось. Отсутствие восстановления НС может быть связано с низкой степенью инфекционности (15% IHC и ни один OHC не был трансдуцирован), типом изоформы вирлина, или когда AAV был введен на P0, необратимое повреждение НС уже произошло.¹¹⁵ В последующем исследовании AAV2/8-WHRN длинная изоформа была доставлена через задний полукружный канал. У обработанных мышей наблюдалось улучшение вестибулярной и слуховой функции с нормальной морфологией стереоцилий, сравнимой с мышами дикого типа. IHC улитки показал 71,7%-81,2% трансдукции, в то время как трансдукция OHC была незначительной. Частичное восстановление может быть связано с типом изоформы или более низкой скоростью трансдукции в OHC.¹¹⁶ Сообщалось, что длинная изоформа восстанавливает длину стереоцилий у мышей WHRN-/-.¹⁸⁴ Однако короткая изоформа WHRN может играть важную роль в слуховом функционировании, что необходимо изучить в будущем.

KCNQ1 является субъединицей канала K+, связанного с напряжением, и его мутация приводит к синдрому Jervell and Lange-Nielsen (JNL) у людей, который характеризуется врожденной двусторонней глубокой глухотой и сердечной дисфункцией. В улитке KCNQ1 и KCNE1 играют ключевую роль в транспорте K+ в эндолимфу и поддержании EP.^185-187 KCNQ1 в основном экспрессируется в SV в апикальной мембране маргинальных клеток.¹⁸⁷ Chang et al.⁷² исследовали замену генов у мутантных мышей JNL с использованием AAV2/1 и промотора CBA через инъекцию в scala media в возрасте P0-P1. Доставка эндолимфы привела к экспрессии KCNQ1 в маргинальных клетках SV, где он преимущественно экспрессировался у мышей дикого типа. Это показало восстановление морфологии HC, восстановление спиральных ганглиозных клеток и предотвращение коллапса мембраны Рейсснера. У обработанных мышей также наблюдался нормальный EP, а ABR показал значительное сохранение слуха, которое сохранялось до 18 недель лечения. Пороги слуха начали увеличиваться с 18 до 30 недель, что говорит о том, что однократное лечение SV не было постоянным. Будущие исследования могут потребовать многократных инъекций в течение определенного времени или изучения усовершенствованных векторов AAV для повышения эффективности и продолжительности трансдукции.⁷²

Мутация в гене OTOF (кДНК ~6 kb), кодирующем белок отоферлин, приводит к аутосомно-рецессивной HL, DFNB9, у людей и составляет 2%-8% от общего числа случаев врожденной HL.¹⁸⁸ Отоферлин - это большой белок с 6 C2 доменами, незаменимый для экзоцитоза в IHC, пополнения синаптических везикул, связывания кальциевых каналов и SNAREs (SNAP рецептор, т.е..., растворимый NSF -N-этилмалеимид-чувствительный фактор] белок прикрепления).^189,190 AAV успешно использовался во многих гензаместительных терапиях для лечения заболеваний внутреннего уха, связанных с мутацией генов, но ограниченная емкость упаковки ДНК AAV в 4,7 кб делает невозможным перенос больших генов, таких как otoferlin (кДНК ~6 кб) целиком. Tertrais et al.¹²¹ исследовали эффект доставки мини-отоферлина с помощью AAV2/8 мышам с нокаутом OTOF путем инъекции в RWM. Были исследованы различные комбинации домена C2 (мини-отоферлина), которые показали, что Otof-C2-ACEF, среди прочих, может частично восстановить экзоцитоз легко высвобождаемого пула (RRP) у мышей с OTOF KO. Однако ни одна из композиций не восстановила устойчивые компоненты высвобождения везикул, и спасения от HL не наблюдалось.¹²¹ Al-Moyed и др.⁵³ сделали первую попытку доставки больших трансгенов с помощью двойного AAV, используя гибридный и транс-сплайсинг подходы, кодирующие кДНК-фрагменты гена OTOF у мышей с дефицитом отоферлина (Otof-/-). Они наблюдали эффективность трансфекции на уровне ~75% для AAV2/6 GFP, введенного с помощью RWM мышам Otof-/- в возрасте P6-P7. Исследование выявило двойную трансдукцию AAV2/6 на уровне 19% и 30% при лечении гибридными или транс-сплайсинговыми двойными векторами, соответственно. В обработанных ушах Otof-/- наблюдалась экспрессия полноразмерной мРНК и белка, что было подтверждено с помощью вестерн-блота и ПЦР. Количество синапсов после лечения улучшилось, однако оно отличалось от контрольных мышей, что говорит о том, что период инъекции может быть слишком поздним для восстановления количества синапсов. Кроме того, ABR обработанных мышей Otof-/- показал частичное восстановление слуховой функции, поскольку это зависит от события рекомбинации, а не от процесса трансдукции. В предыдущих исследованиях генотерапии сообщалось, что для нормальной слуховой функции необходима трансдукция IHC не менее 70%, но в данном исследовании наблюдалась максимальная трансдукция только 30%.¹⁹¹

В недавнем исследовании Akil и др.²⁶ сообщили об интересном наблюдении обратного развития фенотипа глухоты у мышей Otof-/-с использованием двойного подхода AAV. В этом исследовании вектор AAV2 был модифицирован в AAV2 quadY-F с промотором CMV на основе предыдущей работы, которая продемонстрировала повышенную эффективность трансдукции в сетчатке.¹⁹² Вирус, введенный на ст. P2 через RWM, показал 78% ± 6% трансдукции в IHC после 2 недель лечения, что раскрывает его потенциал в качестве агента для доставки генов во внутреннее ухо. Отоферлин был разделен на две расщепленные последовательности кДНК, содержащие recombinogenic bridging последовательность, и упакован в два вектора AAV. Двойной AAV вводили однократно через RWM мышей Otof-/- на P10 (до появления слуха), P17 (после появления слуха, но синапсы IHC еще не созрели) и P30 (улитка созрела). У мышей, получивших инъекцию после P10, наблюдалось ослабление HL, а порог ABR существенно не отличался от контроля. Инъекция на ст. P17 и P30 привела к более высокой скорости трансдукции - 82% ± 9% и 85% ± 7%, соответственно, по сравнению с мышами, инъецированными на ст. P10. Пороги ABR у мышей, инъецированных в P17 и P30, были такими же, как у контрольных мышей после 3 недель лечения, и восстановление сохранялось до 20 недель после инъекции. Количество пучков (ribbons ) на каждую IHC в трансдуцированных клетках, введенных в P17 или P30, было выше, чем в не-трансдуцированных клетках, это указывает на то, что генная терапия увеличивала производство пучков волокон, а не ограничивала их дегенерацию. Такая локальная доставка генов не только спасала от HL, когда их вводили до появления слуха, но и устойчиво восстанавливала HL, когда их вводили после появления или созревания слуха, что говорит о большом терапевтическом окне для лечения DFNB9.²⁶

Ген PJVK (2q31.1-q31.3) кодирует белок pejvakin у позвоночных, и он вовлечен в вызванную окислительным стрессом пролиферацию пероксисом (важных органелл в окислительно-восстановительном гомеостазе слуховой системы), в основном из-за дефектов нейронов. Мутации в этом гене вызывают DFNB59, рецессивную слуховую нейропатию, которая вызывает не-прогрессирующую NIHL у людей.^117,193 Когда кДНК мышиного pejvakin была перенесена в нокаутных мышей PJVK с помощью AAV8 путем инъекции RWM в возрасте P3, обработанные мыши в возрасте P21 имели нормальные задержки ABR (межволновые задержки I-IV), а ими электрически вызванный ответ ствола мозга (EEBR) с амплитудой волны-E IV был безразличен к контролируемой электрической стимуляции. Пост-инъекция AAV8 трансдуцировала первичные кохлеарные ганглиозные нейроны (нейроны кохлеарного ганглия), но не HC, что подтверждает нейрональное происхождение дефекта.¹¹⁷

USH1G кодирует субмембранный строительный белок SANS, который анатомически локализован на кончике стереоцилий, важнейшем компоненте механотрансдукции и сенсорной антенны IHC.^140,194 Emptoz et al.¹¹⁸ доставили кДНК SANS с помощью AAV8 через инъекцию RWM с использованием CAG промотора на ст. P2.5. Доставка трансгена нокаутированным мышам восстановила белок sans в кончиковом звене IHC, OHC и вестибулярных HC, что позволило устранить механотрансдукцию и вестибулярную дисфункцию и улучшить порог слуха. У обработанных мышей наблюдалось частичное устранение HL, который начало ослабевать примерно через 12 недель после инъекции. Частичное восстановление может быть связано с более низкой трансдукцией кохлеарных HC по сравнению с вестибулярными HCs в данном исследовании.¹¹⁸

Ген SLC26A4 кодирует белок пендрин, анионообменник Cl и HCO3, который способствует гомеостазу внутриушной жидкости.^195,196. Его мутация является второй по распространенности причиной генетической HL после мутаций GJB2, и она связана как с расширением вестибулярного акведука (EVA), вызывающим не-синдромную HL (DFNB4), так и с SNHL, связанной с зобом щитовидной железы (синдром Пендреда). ^197,198 Пендрин экспрессируется в SV (spindle cells), улитке (клетки наружной борозды и спирального выступа) и вестибулярном лабиринте (переходные клетки).^199,200 Kim et al.¹¹⁹ доставили AAV2/1-CMV-Slc26a4 в отоцист KO Slc26a4Δ/Δ, knock-in Slc26a4tm1Dontuh/tm1Dontuh мутантных мышей в возрасте E12.5. После лечения преходящая экспрессия кДНК пендрина предотвратила расширение мембранозного лабиринта и устранила HL. Однако устранение было нестабильным, поскольку нарушения слуха возвращались примерно в возрасте 3-11 недель. Кроме того, лечение не помогло спасти развитие отоконий и восстановить вестибулярную функцию. Вирусная трансдукция наблюдалась в эндолимфатическом мешке, но она не смогла трансдуцировать кохлеарные и вестибулярные органы, что может быть причиной данного нарушения. Для восстановления слуховой и вестибулярной функции может потребоваться длительный период или более высокая экспрессия пендрина в эндолимфатическом мешке, в зависимости от используемого вирусного вектора и биологии мутации во внутреннем ухе.¹¹⁹

Успех, достигнутый при использовании генотерапии на животных моделях, требует тщательного рассмотрения для переноса в клинику в качестве терапевтической стратегии для применения у человека.

Вопросы, связанные с эффективностью и безопасностью того или иного подхода, имеют огромное значение для перехода к клиническому применению. Как показано в различных генетических исследованиях, эффективность зависит от пути введения, типа вектора и объема вводимого средства доставки, которые должны быть проанализированы во внутреннем ухе человека. Наряду с эффективностью, важную роль играют данные о безопасности, касающиеся последствий избыточной экспрессии или глушения интересующего гена, а также фармакологические и токсикологические параметры после доставки гена. Как уже говорилось ранее, существует клиническое окно для лечения аномалий внутреннего уха с помощью генотерапии, и для достижения наилучших результатов наряду с другими факторами крайне важно проанализировать критический период. Помимо профилей экспрессии, необходимо тщательно оценить продолжительность действия, поскольку на животных моделях было замечено, что эффект сохраняется в течение ограниченного периода времени, который зависит от типа вектора, интересующего гена и способа введения.

Генетическое сходство между мышью и человеком привело к различным доклиническим исследованиям генотерапии на мышиной модели. Генетически модифицированные мыши позволяют создать практически любую модель моногенетического заболевания, что дает возможность анализировать функцию или регуляцию генов и механизмы, лежащие в основе клинических заболеваний. Кроме того, поскольку штаммы мышей являются высоко инбредными, они способствуют созданию однородных условий, в которых эксперименты могут быть легко воспроизведены, а статистическая значимость может быть достигнута, о чем свидетельствует большой объем литературы, использующей мышиные модели. Кроме того, они маленькие, относительно экономичны в содержании и дают большой приплод с коротким периодом генерации. Однако у мышиных моделей есть ограничения, поскольку они могут не полностью имитировать клинические признаки и существенные патологические отличительные черты заболеваний человека. Кроме того, продолжительные исследования невозможны из-за их короткой продолжительности жизни.^201-204 Таким образом, крупные животные модели, такие как не-человекообразные приматы, могут дополнить мышиные исследования генетических заболеваний человека, поскольку они имеют более длительную продолжительность жизни, а их генетика и фоновая генетическая гетерогенность более близка к человеческой по сравнению с мышами.^205,206 Кроме того, крупные животные могут также решить проблемы масштабирования, поскольку размер их тканей и органов будет сопоставим, в отличие от мышей, где разница в размерах многократная. Кроме того, благодаря продолжительности жизни и размеру, это позволяет получить больше образцов от человека для оценки безопасности и долгосрочной эффективности соответствующей терапии. Крупные животные модели представляют собой важный промежуточный шаг в доклинической оценке протоколов переноса генов, направленных на человека.

Исследуемая генетическая стратегия должна соответствовать минимальному критерию, чтобы быть принятой Управлением по контролю за продуктами и лекарствами США (FDA; т.е. количество остаточной ДНК не должно составлять менее 10 нг/доза или размер ДНК менее 200 п.н., установленный для биологических препаратов или клеточного субстрата). Клинический переход может быть подкреплен соответствующими исследованиями in vitro в тканях человека (т.е. культивированной ex vivo ткани внутреннего уха), или органоидов из плюрипотентных клеток человека, которые могут быть жизнеспособной платформой для плавного перевода в клинику. В этом контексте два исследования подтвердили возможность нацеливания и трансдукции вестибулярных волосковых клеток человека с помощью AV-вектора с кодированным терапевтическим геном или без него.^29,207 В другом исследовании сообщается об успешном развитии органоидов внутреннего уха из плюрипотентных стволовых клеток человека, содержащих функциональные HCs.²⁰¹ Хотя генетические исследования глухоты на этих моделях в настоящее время невозможны, они могут дать ценное представление о нацеливании вектора, экспрессии гена/белка, локализации и токсикологических данных в тканях человека in vivo.

Переход к AAV-опосредованной генотерапии сделал первые шаги в 2008 году, когда была продемонстрирована эффективность генотерапии для лечения врожденного амавроза Лебера. Были завершены три успешных клинических испытания безопасности субретинальной инъекции специфического для ретинального пигментного эпителия 65-кДа белка (RPE65), экспрессирующего AAV-вектор, для лечения врожденного амавроза Лебера.^208-211 Эти испытания открыли путь к созданию первого одобренного FDA в 2018 году препарата генной терапии LUXTURNA (voretigene neparvovec-rzyl).²¹² На сегодняшний день эта AAV-опосредованная генотерапия остается одним из двух одобренных FDA препаратов генотерапии наряду с Zolgensma (ACXS-101), который был одобрен в 2019 году для лечения спинальной мышечной атрофии (SMA). С момента утверждения препарата было проведено множество клинических испытаний, в ходе которых изучалась AAV-опосредованная генотерапия в глазах. Однако было проведено только два испытания с участием SNHL. Несоответствие между прогрессом глазной и SNHL генотерапии в основном объясняется более ранним доклиническим успехом и большей доступностью глаз для лечения по сравнению с улиткой. Основываясь на опыте, полученном с помощью глазной генотерапии, было принято решение определить и классифицировать этиологии SNHL по четырем стадиям клеточной дегенерации.⁵ Эти стадии определяют уровень повреждения клеток внутреннего уха, что может предложить исследователям стандартизированный подход к классификации этиологий SNHL и доклинических исследований для направления будущей клинической работы. ClinicalTrials.gov: NCT02132130 - это первое на сегодняшний день клиническое исследование с использованием генотерапии AV для лечения тяжелой и глубокой SNHL у пациентов с документированной, не флуктуирующей SNHL с неповрежденным вестибулярным аппаратом в неоперированном ухе. В нем оценивается безопасность, переносимость и эффективность внутрилабиринтной (IL) инфузии CGF166 (AV5, кодирующего человеческий атональный транскрипционный фактор [Hath1]) под руководством компании Novartis Pharmaceuticals. Ожидается, что принудительная экспрессия ATOH1 у пациентов с HL может привести к трансдифференцировке оставшихся SC в функциональные HC, что приведет к спасению HL, как это наблюдается у не млекопитающих позвоночных. Исследование было завершено в декабре 2019 года, и на момент подготовки обзора информация об анализе и результатах все еще ожидается. Еще одно клиническое исследование, ClinicalTrials.gov: NCT03996824, представляет собой проспективное обсервационное исследование, посвященное трансдукции AAV in vitro в клетки внутреннего уха человека, собранные во время неконсервативных операций по поводу вестибулярной шванномы. Методами иммуноокрашивания будет измеряться трансдукция AAV после 10 дней лечения. В настоящее время это исследование набирает пациентов с предполагаемой датой окончания в феврале 2022 года.

Поскольку между первым успешным клиническим испытанием генотерапии глазного дна в 2008 году и одобрением FDA в 2018 году прошло 10 лет, мы не ожидаем, что генотерапия кохлеарного аппарата будет применена на людях в ближайшее время. Хотя генотерапия моногенных заболеваний с использованием AAV стала вполне осуществимой, высокая стоимость и риски, связанные с использованием новых исследуемых препаратов на основе AAV (INDs), препятствуют переходу исследователей к клиническим испытаниям. Например, Glybera, первый одобренный препарат генотерапии в Европейском Союзе, стоит 1 миллион евро (1,2 миллиона долларов США) на одного пациента и до сих пор является самым дорогим препаратом в мире. Luxturna, который был запущен в 2017 году в Соединенных Штатах, стоит 425 000 долларов за одно лечение глаза и имеет такой же высокий ценник.²¹¹ Помимо высоких экономических затрат, это также связано с трудностями, касающимися очистки AAV в больших масштабах, удаления пустого капсида и отсутствия методов контроля качества, чтобы избежать изменений титра вектора от партии к партии.

Экспоненциальный рост числа клинических испытаний на основе AAV-векторов говорит о том, что это только начало новой эры в лечении заболеваний человека с помощью вирусных векторов. Хотя ряд проблем все еще существует, развитие генной регуляции и редактирования генов повысит специфичность и эффективность генной терапии в будущем. Гетерогенность является основной проблемой в генотерапии HL, поскольку на эффективность лечения влияют несколько факторов, таких как терапевтическое окно, мишени, молекулы-мишени и функции белков, которые все еще обсуждаются. Последние достижения в разработке синтетических AAV и сложных методов, таких как модификация капсида AAV с помощью молекул-мишеней (пептидов), могут изменить профиль экспрессии и повысить вероятность клинической эффективности. Также сообщалось о гибридных векторах, таких как виросомы, которые обладают более высокой эффективностью по сравнению с соответствующим родительским вирусом, и в ближайшем будущем может быть интересно изучить виросомы AAV, модифицированные таргетными молекулами, на предмет эффективности трансдукции. Учитывая высокие экономические затраты, связанные с этими исследованиями, наблюдается растущий интерес со стороны государственных финансирующих организаций, промышленности, частных фондов, пациентов и врачей. Такие компании, как AGTC (Applied Genetic Technologies), Akouos, Rescue Hearing, Novartis и Decibel Therapeutics в настоящее время участвуют в доклинических/клинических испытаниях для лечения HL. Кроме того, Casebia Therapeutics участвует в доклинических испытаниях CRISPR-Cas9 для лечения HL. Несмотря на препятствия, на пути генной терапии HL произошли значительные прорывы, что открывает большие перспективы для предоставления пациентам новых и эффективных методов лечения для улучшения качества их жизни.