Инструменты, которые мы разрабатываем, синтезируем и создаем, нарушают или восстанавливают геном человека. Любой из этих результатов может быть достигнут с помощью биомолекулярных ножниц, которые обычно классифицируются как программируемые нуклеазы. Самая популярная пара ножниц состоит из простого куска РНК и ничем не примечательного фермента, расщепляющего двухцепочечную ДНК. Партнер по позиционированию состоит из кластеризованных регулярно перемежающихся коротких палиндромных повторов (CRISPR), участков нуклеиновой кислоты, встроенных в бактериальную хромосому, археологических остатков предыдущих вирусных инфекций. На самом деле ножницы - это белки Cas, ферменты, известные как нуклеазы, которые присутствуют в огромном количестве в клетках. Естественным образом разработанные, синтезированные и созданные бактериальной клеткой во время первоначальной вирусной инфекции, второй раунд инфекции тем же вирусным агентом активирует транскрипцию этих повторов ДНК в CRISPR РНК (crRNA), которая ищет и объединяется с ножницами Cas, образуя инструмент редактирования генов CRISPR/Cas, технологию генетического прорыва по крайней мере последних пяти десятилетий [1,2]. Деятельность CRISPR/Cas распространяется на репрессию генов, эпигенетическую модификацию, активацию генов и редактирование множества вырезок (nicking) (Рисунок 1).



Figure 1. The many faces of CRISPR/Cas gene editing. The activated CRISPR/Cas9 complex can modified cell behavior in a variety of ways. These include deletion of sections of genomic DNA, the insertion or replacement of segments of the genome (viewed as being traditional genomic gene editing), modification of gene expression where in the complex functions as a repressor or activator of transcription and modulation of chromatin structure using effector domains of remodeling enzymes. dCas9 refers to a Cas nine protein that is devoid of double-strand DNA breakage, while Nickase refers to a Cas9 protein where in only one of the two DNA cleavage domains of Cas9 is active. This results in the making of a single strand of the helix

Как описано выше, бактериальные клетки развили систему адаптивного иммунитета, которая защищает их от вторичной инфекции вирусов, подобно реакции антител у человека. CRISPR/Cas является частью прокариотической иммунной системы II типа, в которой короткие фрагменты вирусной ДНК расщепляются и включаются в локус CRISPR, растягивая повторяющиеся последовательности, состоящие из элементов ДНК, известных как протоспейсеры, короткие фрагменты ДНК, полученные из соответствующих частей вторгшегося вирусного генома. После активации комплекс CRISPR/Cas атакует вторичных захватчиков, расщепляя и выводя из строя их ДНК в заранее определенных местах. Такое расщепление и последующая резекция клеточными репарационными системами может блокировать экспрессию белка или обеспечить трансляцию усеченных белков, которые, скорее всего, не будут полностью функциональными.

Является ли это генетическим инструментом, который позволит нам точно исправлять мутации и восстанавливать нормальную функцию клеток, которые повреждены или нефункциональны? Возможно. Несомненно, этот инструмент ускорил эволюцию редактирования генов настолько быстро, что мы только сейчас начинаем понимать его применение и, неизбежно, его силу. Хотя CRISPR/Cas доминирует в новостях, существует еще несколько программируемых нуклеаз, которые используются для решения задачи эффективного редактирования генов у эукариот. Нуклеазы с цинковыми пальцами (ZFNs) и нуклеазы с эффекторами, подобными активаторам транскрипции (TALENs), используются в некоторых областях генной инженерии, но универсальность и простота использования - вот почему система CRISPR/Cas привлекает все внимание [3].

Как и у каждого инструмента, имеющегося в распоряжении генных инженеров, существуют примитивные версии. Хотя никто не может точно сказать, откуда взялась первоначальная концепция изменения геномной ДНК с помощью экзогенно добавленной молекулы, основополагающие эксперименты, проведенные Sherman и его коллегами в 1980-х годах, безусловно, являются одним из ведущих кандидатов [4,5]. Эти ученые проводили свои эксперименты на генетической системе, пекарских дрожжах, или Saccharomyces cerevisiae, поскольку предполагаемая частота изменения генома должна была быть крайне низкой; для выявления событий редактирования генома необходимо было провести скрининг тысяч образцов. Почти во всех этих исследованиях инструментом выбора был одноцепочечный олигонуклеотид ДНК, синтетическая ДНК, которую вводили/трансфицировали в клетки с помощью липосом или электропортации. Эта область была известна как одноагентное редактирование генов и находилась в состоянии некоторого покоя, пока в конце 1990-х годов не началась работа по переносу этого подхода в клетки млекопитающих [6,7]. Многочисленные группы начали разгадывать и выяснять механизм действия и регуляторные схемы того, как работают эти инструменты и как они контролируются в клетках млекопитающих [8-12]. Одним из наиболее важных наблюдений было то, что разрывы двухцепочечной ДНК в хромосоме усиливают способность олигонуклеотидов одноцепочечной ДНК восстанавливать точечные мутации и исправлять короткие делеции [10,13,14]. Это усиление связано с активацией пути ответа на повреждение ДНК, который реагирует на повреждение ДНК в хромосомах. Разрыв ДНК достигался путем введения противораковых препаратов или радиации на культивируемые клетки, что приводило к случайному разрыву по всему геному [15].

Хотя эти эксперименты имели решающее значение для потенцирования редактирования генов человека, было просто непрактично вызывать случайные двух-цепочечные разрывы в образцах пациентов, даже если определенный процент клеток позволял осуществлять сайт-специфическую репарацию целевой мутации. Таким образом, возникла потребность в новой категории генетических инструментов - молекулярных ножницах, которые можно было бы сконструировать так, чтобы они резали в определенном месте мутации или рядом с ней; так началась эволюция программируемых нуклеаз. Именно из этой корзины инструментов появилось CRISPR-направленное редактирование генов [16-20] в сочетании с одноцепочечными ДНК-олигонуклеотидами, дающее надежду на лечение наследственных заболеваний и некоторых форм рака.

Существует множество выдающихся и очень информативных обзоров, написанных экспертами о развитии иммунотерапии и эволюции CAR-ассоциированных стратегий; я не буду пытаться внести свой вклад в эту литературу. Вместо этого я посвящу остальную часть обзора обсуждению того, как системы CRISPR/Cas используются в сочетании с иммунотерапией, предложу, возможно, новое применение с некоторыми очень базовыми молекулярными данными, а затем представлю некоторые перспективы и предостережения, основанные на нашем собственном опыте работы с этим замечательным генетическим инструментом.

Поскольку иммунотерапия позволяет иммунной системе находить и атаковать раковые клетки, всем нам ясно, что она имеет уникальные возможности для того, чтобы оказать значительное влияние на лечение рака, и фактически уже оказывает. Возможно, самая популярная форма иммунотерапии основана на клеточно-адаптивных подходах или переносе Т-клеток, когда Т-клетки пациента извлекаются из крови и на поверхности клеток создаются новые типы мембранно-связанных рецепторов, известных как химерные антигенные рецепторы (CAR). При правильном планировании и разработке рецепторы CAR позволяют Т-клеткам распознавать уникальные антигены/мишени. Разновидности стратегии CAR T, включая терапию с помощью рецепторов для Т-клеток и терапию с помощью естественных киллеров (NK) клеток, проходят клинические испытания. В некоторых случаях в процессе преобразований уже используется CRISPR/Cas, так что редактирование человеческих генов уже оказало влияние на мир иммунотерапии. Системы CRISPR/Cas также использовались для создания моделей для поиска лекарств в клетках, несущих мутации AML-FLT3 [21], и система CRISPR/Cas продемонстрировала устранение неблагоприятных эффектов BCR/ABL в ксено-трансплантационной модели CML [22], и это лишь несколько примеров.

Однако, как и предсказывалось, существуют некоторые проблемы даже для CAR T-клеточной терапии в показаниях к применению к опухолям в жидких средах. У некоторых пациентов CAR T-клетки недостаточно разрастаются и не сохраняются, особенно у пациентов с CML [23,24]. В элегантном исследовании Fraietta и др. [25] предположили, что внутренние дефекты самих Т-клеток, по-видимому, препятствуют значительному уровню терапевтической активации и экспансии in vivo. Второй тип проблем является фундаментальным: слабый успех в экспансии Т-клеток пациентов, которые были собраны из крови и введены в крупномасштабную культуру для подготовки к (повторной) инфузии. Иногда возникает еще более значительная практическая проблема: процесс расширения приобретенных Т-клеток пациента часто занимает так много времени, что терапевтическая польза для пациента систематически снижается; просто требуется слишком много времени, чтобы получить клетки обратно. И, несмотря на оптимизм, которым окружено лечение солидных опухолей, все еще мало данных, подтверждающих мнение о том, что терапия CAR T-клетками будет успешной при солидных опухолях.

Универсальность системы CRISPR/Cas позволяет применять уникальные и инновационные методы. Как упоминалось выше, хотя некоторые пациенты не могут получать генетически модифицированные CAR Т-клетки, возможно ли создать банк универсальных Т-клеток от здоровых доноров, которые были бы широко доступны для онкологических больных? И могут ли эти клетки обеспечить независимость от реакции "трансплантат против хозяина"? Мы знаем, что готовые продукты CAR T-клеток также могут вызывать реакцию болезни "трансплантат против хозяина" и, в конечном итоге, отторжение хозяином. С учетом точности и эффективности работы CRISPR/Cas, встроенной в эти молекулы, возможно, программируемые нуклеазы смогут вырубить гены, способствующие иммунному отторжению. Альфа-бета Т-клеточный рецептор (TCR) может быть полезной мишенью для нокаута, также как и устранение бета-2 микроглобулина, который служит субъединицей белка HLA-I. Ren et al. [26] опубликовали провокационные доклинические исследования, показывающие, что множественное редактирование генов CRISPR/Cas, известное как мультиплексирование, действительно эффективно для нокаута эндогенного TCR в CAR Т-клетках, сохраняя при этом противоопухолевую активность, не вызывая GVHD. Другие мишени для генетического нокаута могут включать лиганды стимулирующих NK-клеток или неклассические молекулы HLA класса I на аллогенных Т-клетках.

Уже давно стало ясно, что снижение функции Т-клеток, по-видимому, частично контролируется несколькими негативными регуляторами контрольно-пропускных пунктов (checkpoint), такими как PD-1. Другие ингибирующие рецепторы представлены в таблице 1; известно, что TIM-3, LAG-3, TIGIT и CTLA-4 выполняют аналогичную функцию после взаимодействия с опухолевым антигеном [27,28]. Возможно, что эти рецепторы работают независимо друг от друга, но совместно подавляют иммунный ответ [29]. Очевидным решением проблемы было бы введение ингибиторов контрольных пунктов в сочетании с CAR T-клеточной терапией, но системная доставка, как было показано, вызывает побочные реакции [24,30].



Table 1. Outline of Target Sites for Cas9-mediated Immune Checkpoint Inhibition in T-cells

Поэтому, используя наши навыки создания инструментов, мы разработали, синтезировали и создали генетический инструмент CRISPR/Cas для оценки гипотезы о том, что нокаут PD-1 в человеческих Т-клетках повысит их активность. Это был простой, широкомасштабный эксперимент, иллюстрирующий применение CRISPR/Cas в текущем контексте данного обзора. Первичные одноядерные клетки крови были выделены из донорской крови, а нативные Т-клетки были далее выделены из PBMCs с помощью FACS. Было обнаружено, что нокаут генов до активации и экспансии Т-клеток был необходим для продолжения экспансии активированных Т-клеток. Если нокаут PD-1 проводился после того, как клетки подвергались первоначальной экспансии, происходила чрезмерная активация, которая приводила к массовой Т-клеточно-опосредованной цитотоксичности во всей популяции. Вся культура, включая фидерный слой, погибала через 6-72 часа. Однако, когда целенаправленное воздействие проводили до активации Т-клеток, Т-клетки могли неограниченно увеличиваться с помощью стандартных методов.

Используя этот второй экспериментальный подход (рис. 2), первичные Т-клетки трансфицировали конструкцией CRISPR/Cas9, нацеленной на PD-1. После трансфекции клетки активировали с помощью слабого фактора активации (активация с помощью CD3 также приводила к полной цитотоксичности популяции) и увеличивали их количество в течение нескольких дней. После целенаправленного воздействия клетки показали 5-кратное снижение поверхностного PD-1. Затем эффективность этих Т-клеток в распознавании опухоли была измерена с помощью показателя скорости инфильтрации опухоли [31]. Вкратце, популяцию Т-клеток пометили трассирующим красителем, затем выложили на коллагеновый гель, содержащий как немеченые фибробласты, так и клетки меланомы, помеченные другим красителем. Затем эти трехмерные культуры можно было наблюдать в реальном времени в течение последующих 72 часов, что позволяло отслеживать перемещения Т-клеток и рассчитывать скорость их опухолевой инфильтрации.



Figure 2. Method for knockout of PD-1 in T cells. PBMCs were isolated from patient blood samples, and T cells were further isolated from the PBMC population by FACS. Isolated na?ve T cells were targeted via liposome-based transfection with a CRISPR construct plasmid and a GFP reporter. Successfully transfected cells were pooled and activated with a weak activation factor, and allowed to expand for several days. After expansion and confirmation of cytotoxic potential, the activated cells, tumor infiltration capacity was analyzed in 3D culture

На рисунке 3 показан результат эксперимента. Нокаутные по PD-1 клетки после расширения и восстановления после целенаправленного воздействия сохраняли свою цитотоксическую способность. Когда нокаутные клетки PD-1 были подвергнуты воздействию опухолевых клеток в 3D-модели, скорость инфильтрации опухоли значительно увеличилась более чем в 3 раза. Видеозаписи этих культур с временной задержкой приведены в Дополнительных материалах 1 и 2. Однако интересна и очевидная реакция опухолевых клеток на усиленную инфильтрацию Т-клетками. В эксперименте с нокаутом PD-1 миграция опухолевых клеток оказалась намного выше, чем в контроле. На обоих видео видна миграция опухолевых клеток. В клетках с нокаутом PD-1 эта миграция происходит значительно быстрее и в большей степени. С нашей точки зрения, это фундаментальные наблюдения, которые потребуют более научно обоснованной серии экспериментов для установления положительной корреляции. Но, безусловно, интригует то, что генетические манипуляции с другими локусами могут повысить эффективность модифицированных Т-клеток для иммунотерапии.



Figure 3. 3D culture-based infiltration assay outline. (A) Fluorescence-labeled T cells were suspended in a collagen matrix, layered with fibroblasts and labeled melanoma cells in the displayed layered 3D culture. This culture was live imaged over the course of 72 hours, with the migration vector and velocity of the T-cells recorded. (B) After 72 hours, the overall velocity of the T cells with and without PD-1 knockout were analyzed. Mock-transfected cells exhibited surface PD-1 on approximately 25% of cells, while PD1-KO cells showed surface PD-1 on less than 5%. An increase in tumor infiltration velocity of over 3x was seen between mock-transfected and PD-1 KO T cells

Таким образом, теперь возможно, даже реально использовать CRISPR/Cas для отключения генов в аллогенной Т-клетке, чтобы обойти иммуносупрессивную реакцию? Возможно. При преобразовании любой клетки млекопитающего, скорее всего, будет отключен только определенный процент клеток, а если для уничтожения будут выбраны несколько мишеней, то возникнет мозаичная популяция. Некоторые клетки будут содержать нокаут гена А, другие могут содержать нокаут гена В, возможно, будет определенный процент с нокаутом А + В + С и т.д.; нет гарантии, что мультиплексирование будет одинаково эффективно в каждой клетке-мишени, и это стало проблемой для различных скринингов рака. Важно также отметить, что генетически модифицированные клетки склонны изменять паттерны роста, даже если целевой и отключенный ген обычно не связан с пролиферацией клеток. Bialk и др. [32] продемонстрировали, что нокаут NRF2, транскрипционного регулятора, участвующего в химио-резистентности, но не влияющего на жизнеспособность, привел к уменьшению времени клеточного цикла, замедлению процесса деления клеток. Снижение скорости репликации клеток часто может быть невыгодным для комбинаторного стандарта лечения, такого как химиотерапия. Важно понимать, что негативные последствия CRISPR-направленного редактирования генов касаются не только генома человека; метаболические пути, некоторые из которых неизвестны, также могут быть затронуты даже незначительным снижением экспрессии генов и привести к неожиданному поведению клеток. Gao и др. [33] представили отличный обзор проблем, стоящих на пути внедрения CRISPR/Cas редактирования генов в инженерию Т-клеточной терапии. Эти авторы подчеркивают, что сложность изготовления биомолекулярных инструментов и инфильтрация прижившихся клеток являются простыми, но основополагающими препятствиями для клинического применения. Таким образом, требуется дополнительная работа на молекулярном, клеточном и производственном уровнях, чтобы обеспечить полную реализацию потенциала активности CRISPR/Cas.

Трудности, связанные с реализацией клинического применения, невозможно переоценить. Даже при использовании подходов CAR и TCR терапии, двух уже применяемых терапевтических методов, существует значительное несоответствие в способах доставки. Доставка биотерапевтических препаратов, в частности генных лекарств, является серьезным препятствием уже более 25 лет, и, несмотря на значительный прогресс, не существует универсального вектора, способного обеспечить эффективную и действенную доставку биологической полезной нагрузки. Работники естественным образом выбрали вирусы человека, которые были модифицированы таким образом, чтобы не вызывать присущую им инфекцию, и, как и предсказывалось, проникновение в клетки и тропизм остаются высокими. Однако эти вирусные векторы все еще могут вызывать иммунный ответ, несмотря на четверть века молекулярно-биологической деятельности по снижению этого ответа. Наконец, много шума вокруг активности CRISPR в плане потенциальной способности модифицировать нецелевые сайты. Мы считаем, что это неизбежно, поскольку CRISPR/Cas - это естественная биологическая активность. Однако, хотя другие сайты неизбежно станут мишенью, выбор в пользу редактирования генов, вероятно, будет включать анализ рисков: перевешивает ли потенциал генетической модуляции на второстепенных сайтах, встречающихся с очень низкой частотой, потенциал долгосрочных выгод. Как и фармацевтические препараты, CRISPR-направленное редактирование генов не лишено побочных эффектов.

Как бы ни были интересны все замечательные достижения науки в области CRISPR, существует реальность применения редактирования генов у пациентов, которую часто упускают из виду. Многие ученые, вероятно, согласятся, что еще слишком рано переводить CRISPR-направленное редактирование генов в клиническую плоскость, однако в FDA в процессе рассмотрения находятся сотни клинических протоколов, а несколько клинических испытаний находятся на средней стадии [34]. В настоящее время нет сообщений о серьезных побочных эффектах при использовании CRISPR в качестве основного генетического инструмента, хотя более традиционные методы генотерапии продолжают вызывать проблемы [35]. Продвижение генного редактирования в клинику - дело непростое, и одно из самых важных препятствий не имеет отношения к науке, а живет в материальном мире. Получение соответствующих лицензий на производство терапии, которая может быть использована в определенной популяции пациентов, является сложным, дорогостоящим и, в лучшем случае, запутанным делом. Известные патентные войны по CRISPR между Массачусетским технологическим институтом и Калифорнийским университетом в Беркли доминируют в научной судебной практике. Хотя это, безусловно, развлекает тех из нас, кто ежедневно использует этот инструмент, сложный характер лицензирования использования этой технологии может помешать проведению важных исследований. Откровенно говоря, сейчас не совсем ясно, сколько лицензий необходимо для того, чтобы оформить и произвести терапевтический продукт, способный дойти до людей, которые больше всего нуждаются в лечении [36].