Посещений:
В-клеточные лейкозы и лимфомы



Биотерапевтика с помощью blinatumomab, контролирующего продолжительность действия

Leveraging gene therapy to achieve long-term continuous or controllable expression of biotherapeutics
TIMOTHY P. CRIPE , BRIAN HUTZENMARK A. CURRIER, YU CHENANDREA M. GLASPELL et al.
SCIENCE ADVANCES 13 Jul 2022 Vol 8, Issue 28 DOI: 10.1126/sciadv.abm1890

T cells redirected to cancer cells either via a chimeric antigen receptor (CAR-T) or a bispecific molecule have been breakthrough technologies; however, CAR-T cells require individualized manufacturing and bispecifics generally require continuous infusions. We created an off-the-shelf, single-dose solution for achieving prolonged systemic serum levels of protein immunotherapeutics via adeno-associated virus (AAV) gene transfer. We demonstrate proof of principle in a CD19+ lymphoma xenograft model using a single intravenous dose of AAV expressing a secreted version of blinatumomab, which could serve as a universal alternative for CD19 CAR-T cell therapy. In addition, we created an inducible version using an exon skipping strategy and achieved repeated, on-demand expression up to at least 36 weeks after AAV injection. Our system could be considered for short-term and/or repeated expression of other transgenes of interest for noncancer applications.
Большинство лекарственных препаратов назначаются по прерывистому графику, что приводит к фармакокинетическим пикам и впадинам. Прилагаются большие усилия для поиска дозировок и графиков, которые минимизируют время, проведенное вне терапевтического окна, что приводит к более частым дозам для препаратов с более коротким периодом полураспада, неизбежно приводящим к впадинам ниже эффективных уровней. Такие "впадины" представляют собой особую проблему для рака, поскольку они обеспечивают периоды перерождения рака и развития лекарственной устойчивости. Кроме того, препараты с очень коротким периодом полураспада требуют непрерывных вливаний, которые неудобны, поскольку требуют частого посещения больницы или домашнего ухода для смены пакетов или шприцев, создают проблемы с доступом к сосудам и создают риск инфекций. Такие заболевания, как рак, сердечно-сосудистые заболевания и хроническая боль, требуют длительной терапии, а другие, например, ревматологические заболевания, требуют периодической терапии в течение длительных периодов времени.
Последние достижения в генотерапии для коррекции моногенных заболеваний привели к успешной замене отсутствующих или дефектных генов, что позволяет добиться постоянной экспрессии трансгена в течение нескольких месяцев или лет. Мы стремились определить, может ли генотерапия также потенциально решить проблемы пиков и впадин для лекарств на основе белка, обеспечивая устойчивый и постоянный уровень терапевтических препаратов в крови и тканях после однократного приема.
В качестве доказательства принципа генотерапии рака мы разработали векторы рекомбинантного адено-ассоциированного вируса (rAAV) для экспрессии биспецифического Т-клеточного энхансера. Эти белки обычно состоят из двух различных одноцепочечных вариабельных фрагментов антител (scFv), соединенных линкером [биспецифическое тандемное диабоди (1)], и временно соединяют Т-клетки с клетками-мишенями, способствуя активации Т-клеток и апоптозу клеток-мишеней. Наиболее современным из этих препаратов является блинатумомаб (blinatumomab), состоящий из анти-CD19 scFv, соединенного с анти-CD3 scFv, который в настоящее время одобрен Управлением по контролю за продуктами и лекарствами (FDA) для лечения CD19+ В-клеточной acute lymphoblastic leukemia (ALL) у детей и взрослых с рецидивом или рефрактерностью заболевания или с минимальной остаточной болезнью после первой или второй ремиссии. Короткий период полураспада блинатумомаба [~2,1 часа; (2)] обуславливает необходимость его непрерывной внутривенной инфузии в течение 2-6 месяцев (с перерывами). Как следствие, все полезные свойства этого терапевтического препарата, позволяющего подвергать раковые клетки последовательному, длительному давлению, еще не реализованы.
Мы создали rAAV с человеческим кодон-оптимизированным трансгеном, кодирующим сигнальный пептид, за которым следует аминокислотная последовательность блинатумомаба, который мы назвали CD19 TransJoin, по имени экспрессии трансгена, соединяющего две клетки вместе. Выделяемый вирусом белковый продукт мы называем анти-CD19-анти-CD3 (αCD19-αCD3) "dimert." Помимо того, что требуется только одна доза, наша система также позволяет оказывать длительное давление на опухолевую клетку-мишень, в результате чего терапия продолжается более 1 года, что считается важным для долгосрочного излечения, вызванного химерными антигенными рецепторами (CAR) при Т-клеточном подходе. Однако, в отличие от CAR-T клеток, TransJoin является готовым решением, что позволяет обойти громоздкие производственные проблемы, присущие CAR-T терапии.
Для решения клинических сценариев, требующих только краткосрочной экспрессии или повторяющейся, прерывистой экспрессии терапевтического препарата, мы также разработали сопутствующую AAV-конструкцию под названием TransSkip, в которую мы вставили два интрона, фланкирующих дефектный экзон, в кодирующий последовательность трансгена. Таким образом, конститутивное включение экзона в необработанные образцы делает трансген нефункциональным. При введении морфолино, комплементарного сайту сплайсинга 3' экзона, экзон пропускается, что приводит к альтернативному сплайсингу, восстанавливающему экспрессию полноразмерного трансгена. Таким образом, TransSkip представляет собой индуцируемый метод генотерапии.
RESULTS
TransJoin development






FIG. 1. Construction and verification of an ?CD19-?CD3 dimert construct for AAV delivery.

(A) Schematics of αCD19-αCD3 dimert-expressing plasmids. CAG, cytomegalovirus (CMV) early enhancer/chicken β-actin promoter; K, Kozak sequence; Sec, secrecon signal peptide with 0 to 2 alanine spacers; pA, polyadenylation site. The dimert protein is composed of single-chain antibodies for CD19 (clone HD37) and CD3 (clone L2K-07) joined by a peptide linker (L). (B) Flow cytometry histograms of Jurkat T cells following exposure to media containing αCD19-αCD3 dimerts. Secreted dimerts compete with labeled CD3ε antibody for access to the Jurkat cells, reflected by a signal shift on the x axis. (C) Competitive binding assays demonstrating a dose-response effect of the Secrecon+1 alanine (Sec1A) αCD19-αCD3 dimert in binding to CD19 and CD3ε on Raji and Jurkat cells, respectively. APC, allophycocyanin. (D) Impact of AAV8-αCD19-αCD3 (AAV8-CAG193) administration on CD20+ B cell and CD4+ and CD8+ T cell populations in humanized mice. Each graph represents a single mouse. (E) AAV8-CAG193 administration (5 x 1012 gc/kg) resulted in tumor clearance in a Raji lymphoma-bearing humanized mouse. (F) Treatment regimen for double-blinded AAV8-CAG193 efficacy study. (G) Bioluminescent images of the mice over time. (H) Top row: Individual tumor bioluminescent values over time. Middle row: Tumor volumes calculated by caliper measurements. Bottom row: Individual mouse weight changes, presented as percent change from initial weight. (I) Kaplan-Meier survival curve. Statistical significance was determined using the log-rank test [n = 5 for human peripheral blood mononuclear cell (huPBMC) and AAV8-CAG193 only mice, n = 10 for AAV8-green fluorescent protein (GFP) + huPBMC and AAV8-CAG193 + huPBMC mice]. (J) Biodistribution of AAV8-CAG193 in mouse tissues. Error bars represent SD (n = 4 to 7 per tissue).




FIG. 2. . Preclinical evaluation of potential toxicity in NSGS mice bearing Raji-Luc/GFP tumors treated with AAV8-CAG193 and huPBMCs. (A) Graphical representation of the experiment timeline, mirroring the efficacy study presented in Fig. 1. The mice were euthanized on day 21 after tumor implantation for analyses. (B) Serum concentration of ?CD19-? CD3 dimert present in each experimental group at the time of sacrifice. Dimert quantification was performed using a T cell activation assay and interpolated from a blinatumomab standard curve. (C) Serum chemistry profiles of the mice in each experimental group as determined by the AU680 Chemistry System (Beckman Coulter). Values from the AAV-treated groups were generally in line with the control huPBMC group apart from slightly elevated levels of blood urea nitrogen in the AAV-GFP group. (D) Enzyme-linked immunosorbent assay analyses of murine cytokine and chemokine levels in the serum at the time of sacrifice. (E) Flow analysis of peripheral blood samples from each mouse at the time of sacrifice and examining the levels of human T cells and murine macrophage, monocyte, and neutrophil cell populations. Statistical significance was assessed with one-way analysis of variance. *P

FIG. 1. 0.05. IL-1α, interleukin-1α; G-CSF, granulocyte colony-stimulating factor.



FIG. 3. . Preclinical evaluation of AAV8-CAG193 in NSGS mice bearing more established Raji-Luc/GFP tumors.

(A) Graphical representation of alternative treatment regimen enabling larger Burkitt's lymphoma tumors before therapy. (B) Bioluminescent images of tumors in each treatment group. (C) Individual tumor bioluminescent values recorded for each mouse are shown in the top row of panels. Tumor volumes calculated by caliper measurements are shown in the middle row, and weight changes over time are displayed in the bottom row, presented as a percent change of each individual mouse's initial weight. (D) Kaplan-Meier survival curve. Statistical significance was determined using the log-rank test (n = 5 for HuPBMC and AAV8-CAG193 only mice and n = 10 for AAV8-GFP + HuPBMC and AAV8-CAG193 + HuPBMC mice).



FIG. 4. AAV gene therapy using an EFS promoter-driven ?CD19-?CD3 dimert reduces tumor burden and significantly increases survival in a mouse xenograft model of Burkitt's lymphoma.

(A) Construct map of AAVrh74-EFS193. The αCD19-αCD3 dimert itself is identical in sequence to that described in Fig. 1A. EFS, promoter from elongation factor 1α (short form); WPRE, woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element. (B) Nod-scid gamma-SGM3 (NSGS) mice were implanted subcutaneously with 5 x 106 Raji-Luc/GFP lymphoma cells and injected with AAV (5 x 1012 gc/kg) the following day. (C) Bioluminescent images of NSGS mice bearing Raji-Luc/GFP lymphoma tumors. (D) Kaplan-Meier survival curve. Statistical significance was determined using the log-rank test (n = 5 for huPBMC and AAVrh74-EFS193 only mice and n = 10 for AAVrh74-GFP + huPBMC and AAVrh74-EFS193 + huPBMC mice). (E) Serum concentration of αCD19-αCD3 dimert at the time of each mouse's sacrifice. Dimert quantification was performed using a T cell activation assay and interpolated from a blinatumomab standard curve. (F) Associated values for tumor radiance, tumor volume, and mouse weights over the course of the experiment. (G) Production of EFS-driven αCD19-αCD3 dimert in NSGS mice over time. Dimert quantification was performed using a T cell activation assay and interpolated from a blinatumomab standard curve. Each data point represents a serum sample from an individual mouse. (H) Top: Comparison of EFS-driven ?CD19-?CD3 dimert production in female (F) and male (M) NSGS mice over time at different dose levels. The numbers in the key correspond to the AAV dose in gc/kg. GFP denotes control mice injected with AAVrh74-GFP (2.2 x 1012 gc/kg for female and 1.8 x 1012 gc/kg for male). Bottom: Corresponding mouse weights for the longitudinal dimert quantification assay. Weights are presented as the average percent change for each treatment group (n = 3 to 5 for AAVrh74-EFS193 treatment groups and n = 1 to 2 for AAVrh74-GFP controls).
TransSkip development






FIG. 5. Inducible dimert technology (TransSkip).

(A) The dimert coding sequence is interrupted by a mutated version of Exon 1 (stop codons in all reading frames) and flanking intronic sequences derived from the human KRAS gene. A functional dimert mRNA is expressed when a complementary morpholino binds to the exon-intron junction and induces exon skipping. Because the wild-type exon contains the KRAS transcriptional start site, the morpholino was designed to also down-regulate endogenous KRAS expression. (B) Generalized construct map of a αCD19-αCD3 TransSkip dimert. The forward ("For") and reverse ("Rev") RT-PCR primers are shown by arrows. (C) Three constructs with different U2AF splicing factor binding site sequences were evaluated for exon skipping after morpholino administration, where a lower band indicates the skipped mRNA (coding for an intact dimert). Flow histograms show the results of competitive binding assays for access to CD3ε on Jurkat T cells. mAb, monoclonal antibody. (D) Production of αCD19-αCD3 dimert in NSGS mice injected with 5 x 1012 gc/kg AAV8-EFS193 (TransJoin) or AAV8-EFS-KM2-193 (TransSkip) with functional (V-KTS) or inverted vivo-morpholino (V-KTSinvert), both administered at time points shown by arrows. Error bars represent SD. (E) Production of αCD19-αCD3 dimert in Raji-Luc/GFP tumor-bearing NSGS mice. The experimental design is identical to Fig. 1F apart from the administration of morpholinos. (F) Individual tumor volumes for each treatment cohort over time were plotted against predicted growth trend (thick lines) as determined by mixed-effects modeling. Values in parentheses indicate average tumor growth rate per day. (G) Plot of cumulative incidence of death related to tumor burden for each treatment group. Statistical significance was assessed using Gray's test.

Мы выбрали второй экзон (экзон 1) KRAS, поскольку он содержит сайт начала транскрипции KRAS и, если его исключить, можно ожидать снижения экспрессии полноразмерного белка Kras. Мы мутировали экзон 1 в конструкции TransSkip, чтобы он содержал стоп-кодоны во всех трех рамках считывания для обеспечения нефункциональности трансгена при включении в транскрипт. Мы называем эту производную интрон-экзон-интрон кассетой KRAS Exon 1-mutated (KM). Мы предположили, что введение морфолино [названного KRAS TransSkip (KTS)], предназначенного для пропуска экзона на основе вмешательства в сайты связывания сплайсосомы 3' экзона, вызовет экспрессию терапевтического трансгена в трансдуцированных вирусом клетках и одновременно снизит экспрессию Kras в раковых клетках (рис. 5A).
Мы определили кодирующие последовательности трансгена, где экзоновая часть консенсусной последовательности донора сплайсинга (AAG или CAG) была удачно расположена рядом с экзоновой частью консенсусной последовательности акцептора сплайсинга (GG или GT), так что помещенная туда вставка при сплайсинге давала родную последовательность. Мы вставили кассету KM в самый 5' вариант сайта потенциального соединения донора сплайсинга и акцепторной последовательности, чтобы нарушить кодирующую последовательность как можно раньше во время трансляции (рис. 5B). По данным ПЦР с обратной транскрипцией (RT-PCR) мРНК из клеток 293T, трансфицированных плазмидой, эта начальная конфигурация (KM1) показала в основном транскрипты, содержащие все три экзона с существенным дозо-зависимым увеличением пропуска экзонов после воздействия морфолино KTS с носителем Endoporter, но не инвертированным морфолино (KTSinvert) (рис. 5C).
Для дальнейшей оптимизации конструкции с целью снижения экспрессии пропущенной мРНК в отсутствие морфолино мы создали и протестировали два других варианта (KM2 и KM3) с заменой пар оснований в полипиримидиновом сайте связывания вспомогательного фактора сплайсинга U2 на сайте сплайсинга 3' интрона восходящего потока. Идея заключалась в том, чтобы увеличить включение экзона в отсутствие морфолино и в то же время сохранить восприимчивость к пропуску экзона при введении морфолино.



FIG. 6. . In vitro verification of KRAS Exon 1 skipping in cancer cells. (A) RT-PCR of treated RH30 rhabdomyosarcoma, HeLa cervical cancer cells, H441 lung adenocarcinoma cells, and primary human hepatocytes following exposure to KTS morpholino or its inverted control. The upper 307-bp band indicates the presence of Exon 1 in the PCR amplicon, whereas the lower 185-bp PCR amplicon indicates exon skipping. We observed a dose-dependent induction of KRAS Exon 1 skipping following treatment with the morpholino, while KRAS Exon 2/3 and GAPDH housekeeping controls were not affected. (B) Immunoblots of KRAS and glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) protein levels for the cell lines in (A). (C) KRAS expressed isoforms identified by PacBio Iso-Seq. 3?UTR, 3? untranslated region. (D to F) KRAS isoforms detected in H441 cells exposed to KTS morpholino, inverted morpholino, or endoporter control. Isoforms displaying Exon 1 skipping are highlighted. Allele phasing by single nucleotide polymorphism database (dbSNP) represented by A (dbSNP containing) or B (lack of dbSNP) allele designation. (G) Percentage of circular consensus sequencing (CCS) reads that displayed KRAS Exon 1 skipping for each treatment group.
DISCUSSION


Системная генотерапия с использованием AAV интенсивно изучается для лечения редких, одногенных заболеваний, таких как гемофилия и мышечная дистрофия (10), и уже одобрена FDA для лечения спинальной мышечной атрофии. Здесь мы сообщаем о ранее не описанном методе использования той же платформы для достижения устойчивой экспрессии терапевтического белка в кровоток после одной внутривенной инъекции. В качестве доказательства концепции мы экспрессировали мимикрированный блинатумомаб (αCD19-αCD3 димерт), расщепленный из пропептида и секретированный в кровоток мышей из различных конструкций (CD19 TransJoin), в течение как минимум 1 года без токсичности. Однократного введения было достаточно для лечения мышей, у которых была обнаружена фланговая лимфома CD19+. Мы не наблюдали эффекта уменьшения опухоли до 2-3 недель после инъекции, что соответствует задержке примерно в 2 недели для достижения стабильной фармакокинетики. У некоторых животных мы наблюдали полное рассасывание относительно больших опухолей (до ~1500 мм3). Уменьшение объема опухоли происходило медленно, как правило, в течение нескольких недель или месяцев, что подчеркивает необходимость последовательного, долгосрочного терапевтического воздействия, которое обеспечивает наш подход. В дополнение к CD19+ злокачественным опухолям, благодаря своей долгосрочной персистенции, терапия CD19 TransJoin также может быть полезна для лечения хронических заболеваний с патофизиологией, опосредованной В-клетками, включая некоторые аутоиммунные заболевания, такие как рассеянный склероз (11). Концепция однократной дозы может быть особенно полезна для пациентов из малообслуживаемых групп населения, которым в настоящее время приходится неоднократно преодолевать большие расстояния для лечения.
Для решения сценариев, требующих краткосрочной или периодической экспрессии, мы также создали систему индуцибельной экспрессии, встроив в трансген неработающий экзон, который может быть исключен экзогенным морфолино. Вставка кассеты интрон-экзон-интрон эффективно устраняла обнаруживаемую экспрессию трансгена в крови мышей после системного введения 5 x 1012 копий генома на килограмм. Системное введение когнатного морфолино было многократно более эффективным для индукции экспрессии блинатумомаба до уровня более 500 пг/мл эквивалента. После каждой индукции мы наблюдали медленное угасание экспрессии в течение 10-14 дней. Продолжительность экспрессии, вероятно, является результатом времени пребывания морфолино в тканях и периода полураспада мРНК. Мы также показали, что можем поддерживать экспрессию при повторных инъекциях. Хотя уровень экспрессии составлял лишь около 25% от уровня, достигнутого с помощью конститутивно экспрессируемого вектора, мы достигли достаточного уровня экспрессии, чтобы вызвать терапевтический эффект. Помимо лечения периодических вспышек заболевания, система может быть использована в тех случаях, когда желательна однократная переходная экспрессия, например, экспрессия Cas9 для редактирования генов с целью минимизации внецелевых эффектов (12) и уменьшения иммуноопосредованного разрушения трансдуцированных клеток (13), как in vivo, так и ex vivo. Учитывая, что сплайс-модулирующие олигонуклеотиды были одобрены FDA для лечения множества генетических заболеваний (14), этот подход должен быть применим в клинической практике.
Наша стратегия решает проблему короткого периода полураспада малых диабетонов, таких как блинатумомаб, который у человека составляет 2,11 часа (2), что требует непрерывной инфузии, частой замены шприцев и создает риск инфекции, который препятствует его долгосрочному использованию. В краткосрочной перспективе блинатумомаб высокоэффективен и одобрен FDA как для педиатрических, так и для взрослых пациентов с рецидивом ALL или с минимальной остаточной болезнью. Однако в ходе основного исследования TOWER пациенты, получавшие блинатумомаб, прошли в среднем только два цикла (4 недели приема, 2 недели перерыва; от 1 до 9) (15), поэтому они могли не получить полного эффекта, который мог бы быть получен при более длительном воздействии. Аналогичным образом, в одноручном исследовании, в котором пациентам с минимальной остаточной болезнью назначали до четырех циклов блинатумомаба, 79,6% достигли полного ответа после двух циклов (16). К сожалению, у 34,5% в конечном итоге произошел рецидив, что позволяет предположить, что им помогло бы более длительное воздействие терапевтического агента.
Блинатумомаб также показал эффективность у пациентов с CD19+ не-ходжкинскими лимфомами (5, 17). Фармакодинамическое моделирование показало, что эффективность зависит от уровня и продолжительности воздействия, при этом для противолимфомной активности желательны уровни стабильного состояния более 1830 пг/мл, что выше уровней, обнаруженных у пациентов с ALL при рекомендуемой дозе 28 г/день (731 ± 444 пг/мл) (18). Эти уровни были легко достижимы в наших исследованиях на мышах. Полученные данные также свидетельствуют о том, что для уменьшения размеров лимфомы требуется длительное воздействие, уменьшаясь наполовину каждые 4 недели (т.е. 12 недель для 87,5% уменьшения). Однако большинство пациентов получали только 4 недели терапии, а некоторые - не более 9 недель. Таким образом, польза от еще более длительного лечения лимфомы с помощью блинатумомаба, скорее всего, осталась нереализованной.
CAR-T клетки, направленные на CD19, также стали прорывом в лечении В-клеточных лейкозов и лимфом (19), и важной особенностью их успеха считается длительная персистенция. Тем не менее, технология CAR-T требует проведения кондиционирующей химиотерапии, а производство остается существенной и громоздкой задачей, поскольку клетки готовятся от каждого отдельного пациента и могут иметь низкий выход, неэффективную трансдукцию генов, сниженную функцию и плохую персистенцию, что приводит к рецидиву заболевания (20). TransJoin - это готовый альтернативный подход для достижения долгосрочного перенаправления Т-клеток на клетки-мишени без этих проблем. Хотя аллогенные CAR-T-клетки также обещают обойти эти проблемы, для их успешного применения необходимо решить вопросы болезни "трансплантат против хозяина" и клиренса иммунитетом хозяина (21).
Для экспрессии диабоди было протестировано несколько других подходов на основе генов. В исследовании с использованием электропорации плазмидной ДНК в мышцу биспецифическое Т-клеточное диабоди против рецептора 2 эпидермального фактора роста человека (HER2) показало противоопухолевую эффективность в модели HER2+ рака яичников (22). Однако после первых нескольких недель экспрессия неуклонно снижалась, а через ~4 месяца исчезла. Местная доставка также остается сложной задачей, и маловероятно, что она даст высокие системные уровни. Другие ученые внедрили трансгены в онколитические вирусы, что повысило их противоопухолевую эффективность (23, 24), но эти векторы дают лишь кратковременную экспрессию, поскольку вирусы убивают клетки, которые они заражают. Трансгены также тестировались в адоптивных клеточных терапиях, таких как CAR-T клетки (25), хотя эти подходы не являются готовыми решениями в отличие от переноса генов с помощью AAV.
Потенциальная токсичность TransJoin может быть вызвана как вектором, так и трансгеном. Хотя мы не наблюдали никаких сигналов безопасности в наших краткосрочных или долгосрочных исследованиях на мышах, в ходе испытаний нейромышечного AAV9 (но не AAVrh74) были высказаны опасения по поводу противовирусных иммунных реакций, включая активацию комплемента и токсичность печени (26). В то время как высокие дозы вектора [1014 векторных геномов (vg)/кг] необходимы для достижения высокой доли нервных или мышечных клеток при нервно-мышечных расстройствах, для успешной терапии TransJoin (аналогично генотерапии гемофилии) требуется трансдуцировать лишь часть клеток печени (или других клеток). Таким образом, в соответствии с нашими данными на мышах и исследованиями гемофилии у человека, мы ожидаем, что дозировка для человека будет составлять всего 1012 vg/кг, что снижает вероятность токсичности, опосредованной вектором.
Что касается токсичности трансгена, мы ожидаем, что экспрессия αCD19-αCD3 будет представлять определенный риск синдрома высвобождения цитокинов (CRS) и синдрома нейротоксичности, связанной с иммунными эффекторными клетками (ICANS), аналогично другим CD19-таргет-иммунотерапиям, включая блинатумомаб и CAR-T. В исследовании TOWER, посвященном блинатумомабу, у 5% пациентов наблюдался CRS 3-го или более высокого класса, а у 9% - ICANS (27), большинство из которых возникли в первые несколько циклов, что совпадает с результатами другого исследования (16). Поскольку поэтапное дозирование показало снижение уровня цитокинов (5), рекомендация по применению блинатумомаба заключается в том, чтобы начинать с одной трети дозы в течение первой недели, а затем увеличивать дозу до полной. Медленное накопление сывороточных уровней в течение примерно 2 недель, которое мы наблюдали при использовании платформы AAV, должно аналогичным образом минимизировать риск развития CRS на ранних стадиях терапии. В то время как инфузии блинатумомаба могут быть прекращены, однако в случае с CD19 TransJoin нам придется полагаться на антиинтерлейкин-6 терапию для лечения CRS и варианты поддерживающей терапии для лечения ICANS, подобно тому, как это делается с CAR-T пациентами, у которых также нет "выключателя".
Ранее AAV был испытан в качестве платформы для экспрессии антиинфекционных антител, например, для лечения ВИЧ (28). Одним из ограничений, возникших в исследованиях на не-человекообразных приматах, является развитие иммунной реакции против продукта трансгена, так называемых анти-лекарственных антител (ADA). Мы не ожидаем, что ADA будет ограничением для CD19 TransJoin, поскольку у менее 1% пациентов, получающих лечение блинатумомабом, развивается ADA (2), вероятно, потому, что он истощает В-клетки, необходимые для выработки неоантител. Мы ожидаем, что некоторым пациентам, получающим лечение CD19 TransJoin, потребуется восстановление гуморального иммунитета с помощью ежемесячных инфузий внутривенного иммуноглобулина, как это происходит с пациентами, получающими CD19-направленную CAR-T терапию (29).
Для достижения прерывистой экспрессии с помощью TransSkip мы решили использовать последовательность онкогена KRAS в качестве источника нашего искусственного экзона на тот случай, если он может одновременно обладать противоопухолевой активностью. Хотя нам удалось продемонстрировать умеренное снижение уровня общей мРНК KRAS, этого оказалось недостаточно, чтобы повлиять на уровень белка Kras. Возможно, по мере совершенствования технологии морфолино удастся реализовать это потенциальное преимущество, например, при использовании стереоизомерных (30) олигонуклеотидов или пептидных фосфородиамидатных морфолиноолигонуклеотидов (31), которые показали более высокую эффективность. При более эффективном пропуске может возникнуть возможность токсичности "на мишени" и "вне опухоли", поэтому нормальный ген, используемый в качестве последовательности для морфолино мишени конструкции TransSkip, должен быть тщательно выбран. Тем не менее, мы можем представить себе парную терапию TransSkip/OncoSkip, в которой соответствующий онкоген, вызывающий данный тип опухоли, используется для активации экспрессии соответствующего терапевтического препарата.
Для применения генотерапии давно требуется жесткий контроль экспрессии трансгенов. Наиболее часто используемая в лабораторных условиях система Tet-On/Off ограничена in vivo иммунными реакциями на бактериальные белки (32). Совсем недавно в условиях AAV-трансгена была описана система включения-выключения, которая, подобно нашему подходу, позволяет избежать иммуногенных регуляторных белков (33). Авторы добились конститутивно низкой экспрессии путем включения в транскрипт РНК саморасщепляющегося рибозима hammerhead, которому противодействовал анти-смысловой олигонуклеотид, что приводило к экспрессии трансгена. Этот подход лучше всего работал при прямом местном введении вектора и анти-смыслового вектора в мышцу, но был неэффективен при системном введении.
Таким образом, мы предполагаем, что долгосрочная стабильная экспрессия биотерапевтических препаратов, достижимая путем переноса генов, может быть использована для решения проблемы колебания уровня препарата, присущей традиционным способам введения, и громоздкой механики, сопровождающей постоянные внутривенные инфузии. Применительно к раку преимущество нашей стратегии заключается не только в однократном введении терапевтического препарата вместо частых посещений клиник и больниц, но и в перспективе долгосрочного, постоянного давления на опухолевые клетки, что может решить проблему стойкого микрометастатического заболевания, которое является причиной рецидива. Мы также разработали сопутствующий переключатель TransSkip, который обеспечивает экспрессию по требованию для сценариев, в которых предпочтительна только краткосрочная или прерывистая экспрессия. Эти технологии концептуально открывают новую широкую область генотерапии для решения терапевтических задач, выходящих далеко за рамки коррекции нарушений, связанных с одним геном.