В последние годы, с развитием генной терапии, и особенно системы CRISPR/Cas, появляется возможность использования плазмид в качестве терапевтических инструментов. Основными недостатками этого нового подхода являются нестабильность нуклеиновых кислот, которые быстро разрушаются эндонуклеазами внутри организма [1], и неэффективная интернализация экзогенных голых плазмид клетками. Кроме того, компоненты системы CRISPR/Cas (направляющая РНК и CRISPR-ассоциированная эндонуклеаза) часто доставляются в клетки в виде плазмидных векторов большого размера (9-19 кб) [2]. Из-за своего большого размера эти векторы значительно затрудняют трансфекцию и являются потенциально цитотоксичными [3]. Поэтому разработка эффективных и безопасных векторов переноса генов имеет большое значение для успешной генной терапии.

Возникли различные системы доставки генов на основе вирусных и невирусных векторов, таких как липоплексы или полимерные наночастицы [4,5,6,7], хотя ни одна из них до сих пор не является полностью удовлетворительной. Вирусы обеспечивают высокую эффективность трансдукции, сохранность и клеточный тропизм, но имеют ряд существенных недостатков, которые препятствуют их внедрению в клиническую практику. К ним относятся ограниченный размер генетического материала груза (упаковочная ёмкость), их случайная интеграция в геном, генерация иммуногенного ответа после повторных введений и их потенциальная токсичность [8]. В настоящее время невирусные векторы находятся в центре внимания из-за их преимуществ перед вирусами, таких как предсказуемый профиль безопасности, простота крупномасштабного производства и контроля качества, повышенная универсальность, устойчивое высвобождение груза и возможность загрузки нуклеиновых кислот большого размера. Однако их специфичность и эффективность доставки в настоящее время ниже, чем у вирусных систем.

В этом смысле наночастицы из поли(лактид-со-гликолевой кислоты) (PLGA NPs) стали важным инструментом в научных и биомедицинских исследованиях благодаря своей высокой биосовместимости и низкой токсичности [9]. Одним из основных преимуществ PLGA является образование молочной и гликолевой кислот при гидролизе, двух эндогенных метаболитов, которые могут быть разложены в цикле Кребса [10]. Это приводит к минимальной токсичности и делает PLGA одним из наиболее легко метаболизируемых и переносимых организмом полимеров. Более того, NPs PLGA могут инкапсулировать различные грузы, от небольших гидрофобных и гидрофильных лекарств до нуклеиновых кислот и белков [11-15]. Более того, PLGA NPs могут быть легко конъюгированы с молекулами, изменяя их заряд, гидрофобность, период полураспада в кровообращении и даже позволяя избирательно связываться с определенными типами клеток [16].

Эти характеристики способствовали использованию NPs на основе PLGA в качестве наносистем доставки лекарств (nanoDDS) при широком спектре заболеваний, включая сердечно-сосудистые [17,18], нейродегенеративные [19,20], воспалительные заболевания и заболевания иммунной системы [21,22], инфекции [23], рак [24,25], регенеративную медицину [26,27] и даже в области терагностики и вакцин [28,29]. Эффективность этих nanoDDS на основе PLGA уже доказана в клинических испытаниях [30], а производство таких препаратов, как Atridox® (для доставки доксициклина при лечении пародонтоза), Sandostatin® (содержащий октреотид при акромегалии) и Lupron depot® (с леупрорелином при раке простаты), одобрено FDA и EMA и уже коммерчески доступно [31].

В отличие от PLGA, инкапсулирующих лекарства в nanoDDS использование PLGA NPs в качестве векторов для генной терапии все еще находится в зачаточном состоянии. Фактически, за редким исключением, исследования ограничиваются анализами in vitro и доставкой малых не-кодирующих РНК, таких как siRNA [32-34]. Кроме того, следует отметить, что в большинстве исследований, в которых наночастицы PLGA использовались для инкапсуляции плазмид, применялись конструкции небольшого размера (менее 6 кб) [35-37], в то время как, как упоминалось выше, для кодирования компонентов редактирования генов (т.е. Cas9 и направляющих РНК) требуются более крупные (9-19 кб) плазмиды.

PLGA NPs могут быть синтезированы с использованием различных технологий, что позволяет получить наночастицы с различными свойствами в плане размера, времени гидролиза, формы, поверхностного заряда, целостности груза и последующей эффективности поглощения клетками.

Синтез наночастиц PLGA с помощью двойной эмульсии вода-масло-в-воде (в/о/в) является золотым стандартом в инкапсуляции гидрофильных фармацевтических препаратов, и были разработаны модифицированные методы в зависимости от спецификаций и потребностей каждого применения, поскольку он обеспечивает наибольший достижимый контроль над физико-химическими свойствами получаемых наночастиц [35,38-41].

Этот метод заключается в эмульгировании с помощью соникации (sonication) несмешивающейся с водой органической фазы (масла), содержащей растворенный полимер, из которого будут образованы наночастицы, с поверхностно-активным веществом или стабилизатором (водой). Эта первая эмульсия способствует образованию мелких капель полимера. Полученную эмульсию добавляют к более крупной водной фазе и перемешивают в течение нескольких часов, что позволяет растворителю испариться и запускает процесс образования наночастиц [40]. Препараты могут быть растворены в органической фазе, если они гидрофобны (при использовании одинарной эмульсии "масло в воде"), или в первой водной фазе, если они гидрофильны (для двойной эмульсии "масло в воде"). В случае наночастиц на основе PLGA, нагруженных нуклеиновыми кислотами, которые будут использоваться в качестве векторов генной терапии, метод выпаривания растворителя двойной эмульсии был представлен с использованием различных органических и водных растворителей/поверхностно-активных веществ, таких как поливиниловый спирт (ПВС), цетилтриметиламмоний бромид (ЦТАБ), Span 80, додецилсульфат натрия (SDS), Triton X-100, Tween 20 и Tween 80 [35,42]. Тем не менее, эмульгирование ультразвуком имеет несколько недостатков: (1) ограниченная масштабируемость, поскольку оно эффективно только для небольших партий препаратов, (2) перекрестное загрязнение из-за мусора, образующегося в на конечнике sonotrode в результате кавитации, и (3) высокое напряжение создает высокую температуру, которая может повлиять на термочувствительные грузы [43].

Альтернативный метод нанопреципитации (или метод вытеснения растворителя) основан на использовании смеси органических и водных смешиваемых растворителей, используя преимущества низкой растворимости полимера в одном из этих растворителей, чтобы вызвать осаждение полимера в наночастицы при испарении органического растворителя, обычно при перемешивании или пониженном давлении. Хотя этот метод изначально был разработан для захвата гидрофобных соединений [44], недавно он был модифицирован для гидрофильных соединений, таких как ДНК [45,46].

Эмульгирование и нанопреципитация на основе ультразвука в основном проводятся в непрерывных периодических процессах, где воспроизводимость между партиями и масштабируемость ограничены, что препятствует быстрому переносу в клинику. С другой стороны, микрофлюидика - это новая технология, которая может быть использована для приготовления полимерных наночастиц с помощью одно- и двукратной эмульсии и нанопреципитации, в зависимости от требований, с существенным преимуществом непрерывного производства и строгого контроля параметров синтеза. Микрофлюидика позволяет использовать межфазное натяжение между двумя фазами в качестве движущей силы для формирования наночастиц путем молекулярной диффузии с использованием микроканалов, встроенных в микрореакторы [47]. Геометрия этих микроканалов (т.е. Т-образные, перекрестные, Y-образные и фокусирующие поток устройства) позволяет использовать различные ориентации контактов, поверхности и скорости потока между фазами, что приводит к образованию наночастиц с различными свойствами [48]. Микрореакторы непрерывного потока позволяют лучше контролировать процесс синтеза, что выражается в снижении полидисперсности и облегчает многостадийную обработку [49]. Эта техника является относительно новой, и, насколько нам известно, существует только одно сообщение о синтезе на основе микрофлюидики нагруженных нуклеиновыми кислотами PLGA NPs, в котором в качестве груза использовались siRNAs [50].

Важно отметить, что нанопреципитация и эмульгирование с помощью микрофлюидики являются более мягкими методами по сравнению с двойным эмульгированием с помощью ультразвука (которое требует соникации и увеличения скорости перемешивания для испарения растворителя, при этом могут быть достигнуты высокие температуры), что может способствовать сохранению структуры загруженной нуклеиновой кислоты и, следовательно, функциональности.

Для использования в генотерапии эти методы в основном исследовались для инкапсуляции небольших нуклеиновых кислот, таких как siRNAs (20-25 нуклеотидов). Однако, как мы уже упоминали, новые системы редактирования генов, такие как CRISPR/Cas9, требуют векторов, способных вмещать более крупные нуклеиновые кислоты, такие как высокомолекулярные плазмиды. Физико-химические свойства этих плазмид отличаются от малых не-кодирующих РНК не только размером, но и зарядом, структурой и чувствительностью к стрессу, что необходимо для проверки и оптимизации ранее установленных протоколов синтеза PLGA NP для инкапсуляции этого типа нуклеиновых кислот.

В данной работе мы оценили два различных метода синтеза (двойная эмульсия и нанопреципитация) для инкапсуляции большой плазмиды размером 9,4 кб в PLGA NPs. В рамках этих методов мы протестировали две различные технологии синтеза с пакетной обработкой (ультразвуковая соникация и магнитное перемешивание) и сравнили результаты с результатами, полученными при использовании метода двойной эмульсии с помощью микрофлюидики в непрерывном потоке.

Эффективность любой нанотерапии в значительной степени зависит от эффективной интернализации наночастиц в клетке-мишени, которая сильно зависит от их поверхностной функционализации и размера частиц, оптимальный диаметр которых составляет от 70 до 200 нм [51-53]. Поверхностный заряд также имеет решающее значение для поглощения клетками, влияя на пути интернализации и обеспечивая выход из эндосом [54,55]. Наконец, в случае использования наноносителей в качестве носителей векторов экспрессии генов необходимо обеспечить сохранность ДНК. В целом, все эти факторы делают концепцию оптимального носителя наночастиц сложной задачей.

В частности, мы сравнили физико-химические свойства полученных наночастиц (морфологию, размер частиц, эффективность формирования наночастиц, заряд поверхности, эффективность инкапсуляции и структурную целостность загруженной плазмидной ДНК), чтобы показать преимущества и недостатки существующих технологий. Примечательно, что в данной рукописи впервые рассматривается синтез на основе микрофлюидики нагруженных плазмидной ДНК PLGA NPs.

В целом, наши данные продемонстрировали критические различия в биофизических свойствах и поведении in vitro NPs PLGA, синтезированных по ранее представленным протоколам, при загрузке высокомолекулярными нуклеиновыми кислотами. Эти результаты обеспечивают подробное сравнение процедур загрузки генов для ученых в данной области и подчеркивают необходимость дальнейшего совершенствования использования наноносителей в качестве векторов доставки высокомолекулярных нуклеиновых кислот, таких как системы редактирования генов CRISPR/Cas.

Как упоминалось выше, многие факторы могут влиять на эффективность наноносителей как носителей экспрессии генов. Среди этих факторов особое значение имеют размер наночастиц, заряд поверхности, загрузочная способность, сохранение целостности груза и высвобождение, которые будут проанализированы в данной работе для каждой из процедур синтеза.

Хотя три изученные процедуры синтеза PLGA NP (ультразвук и микрофлюидика с помощью в/в и нанопреципитации) основаны на различных физических принципах, все они объединяет использование органических растворов, содержащих растворенный PLGA, водные буферы с гидрофильным грузом (т.е. pDNA) и поверхностно-активные вещества для содействия образованию эмульсии, стабильности и контроля размера. DCM широко используется в качестве растворителя PLGA; однако природа и концентрация буферов на водной основе сильно варьируется в разных протоколах [42]. Тип используемого растворителя имеет решающее значение для структурной целостности плазмиды, потенциально изменяя естественную сверхсвернутую изоформу плазмидной pDNA в линейную, расслабленную или денатурированную конформацию. Сверхсвернутая конформация обладает самой высокой трансфекционной способностью и считается транскрипционно активной, в то время как другие изоформы приводят к значительной потере функциональности.

Учитывая высокую молекулярную массу нашей плазмиды (9,4 кб) и важность структурной целостности pDNA для поддержания функциональности, мы сначала попытались проанализировать влияние наиболее часто используемых органических и водных буферов на конформацию плазмиды.

Результаты показали, что инкубация только с DCM приводит к конформационному изменению денатурированной сверхсвернутой pDNA (Рисунок 2, полоса 2), что приводит к более быстрой миграции в агарозном геле по сравнению с необработанным контролем. Вероятно, это связано с низкой полярностью DCM, поэтому pDNA, которая является гидрофильной и полярной молекулой, приобретает конформацию, которая минимизирует воздействие этого органического растворителя. Этот эффект отсутствует, когда pDNA подвергается воздействию смеси, которая, помимо DCM, содержит водный раствор, такой как холат натрия или PVA (рис. 2, полосы с 3 по 6 и 7, соответственно). И наоборот, инкубация с DCM плюс 1% (41% Tween 80 и 59% Tween 20) индуцировала денатурированную сверхсвернутую конформацию у 50,18% плазмид (Рисунок 2, полоса 8). Аналогично, инкубация с Triton X-100 также приводила к изменению конформации pDNA в данном случае к расслабленной форме (Рисунок 2, полоса 9). Интересно, что наши результаты показывают, что большинство не-ионных поверхностно-активных веществ (Tween 80, Tween 20 и Triton X-100, но не PVA) не сохраняют сверхсвернутую конформацию плазмиды при воздействии DCM.

Наноматериалы 11 02723 g002 550 Рисунок 2. Влияние растворителей для синтеза на стабильность структуры pDNA. Изображение показывает миграцию плазмиды pRFP в (1) Milli-Q water, (2) DCM, (3) DCM + 0,01% холат натрия, (4) DCM + 0,3% холат натрия, (5) DCM + 0. 6% холат натрия, (6) DCM + 1% холат натрия, (7) DCM + 1% PVA, (8) DCM + 1% (41% Tween 80 + 59% Tween 20) и (9) DCM + 1% Triton X-100 после 3 ч инкубации при комнатной температуре.

Наши результаты отличаются от результатов, описанных Doolaanea и коллегами, которые сообщили, что Triton X-100 хорошо сохраняет структуру pDNA [42]. Эти расхождения могут быть обусловлены различиями в размерах плазмид или непосредственным воздействием на pDNA смеси растворителей по сравнению с анализом структуры плазмид в контексте реакции синтеза, проведенным Doolaanea.

Учитывая наши результаты, PVA и холат натрия были выбраны в качестве лучших сохранителей структуры плазмид в наших условиях синтеза и в дальнейшем использовались для синтеза НП PLGA с помощью ультразвука и микрофлюидики в/б/б.

СЭМ-изображение подтвердило, что все три процедуры синтеза привели к образованию сферических и неповрежденных наночастиц (рис. 3).

Как уже упоминалось ранее, эффективность любой нанотерапии зависит от эффективной интернализации наночастиц в клетке-мишени, что, в свою очередь, в значительной степени зависит от их размера и поверхностного заряда (дзета-потенциала). Было доказано, что PLGA NPs с размером от 70 до 200 нм стабильны в циркуляции, в отличие от тех, которые имеют больший или меньший размер [51,52]. Сообщалось, что наночастицы размером менее 70 нм накапливаются в печени, где они быстро метаболизируются. С другой стороны, наночастицы размером более 200 нм преимущественно находятся в селезенке, где они фагоцитируются макрофагами [53].

По данным ТЭМ-изображений, наши результаты показали, что микрофлюидная технология позволила получить более крупные наночастицы (212 ± 87 и 258 ± 140 нм для синтеза холата натрия и ПВС, соответственно) по сравнению с ультразвуковым методом в/в и нанопреципитации, причем последние два находятся в желаемом диапазоне размеров 70-200 нм для данного исследования. Ультразвуковая обработка в/в/в привела к промежуточному размеру частиц (116 ± 24 и 123 ± 67 для стандартной и модифицированной процедур, соответственно), а нанопреципитация оказалась лучшим методом для получения наночастиц меньшего размера (88 ± 21 и 93 ± 29 нм для PLGA-COOH и PLGA-NH2, соответственно) (Таблица 1, Рисунок 4). Не было обнаружено статистически значимых различий между нано-частицами, синтезированными любым из вариантов методик двойной эмульсии под действием ультразвука (стандартная против модифицированной) и нано-преципитации (PLGA-COOH против PLGA-NH2). Однако значительные различия были обнаружены между NPs при синтезе двойной эмульсии с использованием микрофлюидики с добавлением холата натрия или PVAС (Таблица 1, Рисунок 4). Наночастицы PLGA были визуализированы с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ), а распределение по размерам наночастиц PLGA было представлено в процентах. Данные были получены из измерений диаметров на ТЭМ изображениях не менее 100 сухих наночастиц для каждого метода синтеза с помощью программного обеспечения ImageJ. (A) Стандартный метод двойной эмульсии с использованием ультразвука, (B) модифицированный метод двойной эмульсии с использованием ультразвука, (C) метод двойной эмульсии с использованием холата натрия в качестве ПАВ, (D) метод двойной эмульсии с использованием ПВА в качестве ПАВ, (E) метод нано-преципитации с карбоксил-терминированным PLGA, (F) метод нано-преципитации с амино-терминированным PLGA, (G) сравнение диаметров между различными методами синтеза. * p < 0,05, ** p < 0,01.

Таблица 1. Свойства нагруженных pDNA PLGA NPs, синтезированных методом двойной эмульсии с использованием ультразвука или микрофлюидики и нано-преципитации.

Полидисперсность размеров НП для обоих методов двойной эмульсии и нанопреципитации была ниже по сравнению с полидисперсностью, полученной методом микрофлюидики (Таблица 1, Рисунок 3 и Рисунок 4). Интересно, что полидисперсность НП, синтезированных с помощью эмульсии при использовании микрофлюидики, была выше, чем в наших предыдущих исследованиях [43], даже при использовании тех же гидродинамических параметров. Это может быть объяснено использованием DCM в качестве растворителя PLGA в органической фазе вместо этилацетата, поскольку последний, как сообщалось ранее, вызывает деградацию ДНК. Различные плотности для DCM (1,33 г/см3) и этилацетата (0,90 г/см3), различные вязкости (0,413 сП и 0,428 при 25 °C для DCM и этилацетата, соответственно) и различные полярности (3,1 и 4. 4 индекс полярности для DCM и этилацетата, соответственно), вероятно, повлияли на напряжение сдвига, смачиваемость канала, эффективность смешивания и, таким образом, на контроль эмульсии в процессе синтеза, способствуя расхождениям в полученной полидисперсности между обеими работами. Эти результаты также свидетельствуют о необходимости специальных протоколов синтеза НП и реагентов для инкапсуляции больших pDNA как для сохранения структуры pDNA так и для контроля морфологии NPs. С точки зрения эффективности образования NPs, методы на основе двойной эмульсии (в/в/б) имеют выход NPs приблизительно 40% по отношению к исходному PLGA. Этот выход ниже (27,20 ± 10,68%) в случае метода синтеза на основе микрофлюидики с использованием холата натрия в качестве поверхностно-активного вещества (Таблица 1). Более того, процедура нано-преципитации с использованием аминотерминированного PLGA также показала относительно низкую эффективность (28,48 ± 10,57%), тогда как при использовании карбоксилтерминированного PLGA были достигнуты значения до 54,96%.

С другой стороны, поверхностный заряд НП, также известный как дзета-потенциал, влияет на стабильность частиц в суспензии и, следовательно, в кровотоке. Дзета-потенциал, близкий к нулю (изоэлектрическая точка), способствует агрегации, в то время как абсолютные значения выше 30 мВ делают НП стабильными в суспензии. Более того, знак заряда и его величина также определяют способ взаимодействия частиц с плазматической мембраной клеток и, следовательно, влияют на их интернализацию [57]. Хотя лучшая интернализация клеток наблюдается, когда наночастицы заряжены положительно (из-за их взаимодействия с остатками отрицательного заряда цитоплазматической мембраны), отрицательно заряженные наночастицы также могут быть интернализованы. Существующие гипотезы предполагают, что такая интернализация происходит через механизмы рецептор-опосредованного эндоцитоза [58] или взаимодействие с положительно заряженными специфическими участками на клеточной мембране [59]. В дополнение к интернализации было показано, что отрицательно заряженные PLGA NPs могут быстро покидать эндо-лизосомы благодаря селективной инверсии их поверхностного заряда (от анионного к катионному) в эндо-лизосомальном компартменте [54]. Это позволяет NPs взаимодействовать с эндо-лизосомальной мембраной и выходить в цитозоль, избегая деградации внутрилизосомального груза и обеспечивая устойчивое внутриклеточное высвобождение широкого спектра терапевтических агентов, включая макромолекулы, такие как ДНК.

В данной работе все методики синтеза позволили получить отрицательно заряженные наночастицы PLGA с дзета-потенциалами от ~33 до ~57 мВ, более отрицательными были модифицированный метод двойной эмульсии с ультразвуковой обработкой (~57,32 ± 10,16 мВ) и метод нанопреципитации с использованием аминотерминированного катионного PLGA (~46,22 ± 12,49 мВ) (Таблица 1). Эти различия были статистически значимыми для модифицированного ультразвукового в/в метода (p < 0,01 для всех сравнений, кроме метода нано-преципитации с использованием катионного PLGA, p = 0,1653), в то время как они оставались лишь тенденцией для случая нано-преципитации с PLGA-NH2.

Учитывая катионную природу аминотерминированного PLGA, дзета-потенциал должен быть положительным; однако электростатические взаимодействия между высокомолекулярной pDNA и PLGA-NH2, вероятно, способствуют накоплению плазмиды на поверхности наночастиц, что и является причиной отрицательного заряда, наблюдаемого для pDNA-нагруженных PLGA NPs. ДНК - отрицательно заряженная молекула, причем этот заряд обычно связан с размером (чем длиннее, тем больше отрицательный заряд). Соответственно, можно предположить, что чем больше количество плазмиды, захваченной в частице, тем большее количество pDNA останется на поверхности NPs и, следовательно, тем более отрицательным будет ее поверхностный заряд. Это согласуется с наблюдаемой тенденцией отрицательной корреляции между Z-потенциалом и выходом инкапсуляции, полученной для каждой из реплик различных синтезов (Дополнительный рисунок S2). Эта корреляция также наблюдалась при объединении данных, полученных при различных методах синтеза и полимерах, хотя большая вариабельность не позволила получить статистическую значимость.

Наночастицы PLGA продемонстрировали способность загружать множество различных биомолекул, включая нуклеиновые кислоты, белки и диагностические агенты в дополнение к малым молекулам, которые традиционно используются в качестве терапевтических препаратов [11].

Эффективность инкапсуляции лекарственных препаратов, описанная в литературе, сильно варьируется от 10 до 96% в зависимости от типа наночастиц и их физико-химических характеристик, процесса синтеза и природы препарата [37,41,60,61].

Наше исследование также отражает эту изменчивость, получая диапазон значений от 20 до 60% эффективности инкапсуляции для плазмидной ДНК (табл. 1), будучи значительно выше для NPs, синтезированных с помощью микрофлюидики - в/в с PVA (50,91 ± 23,27%) (p < 0,01) и нано-преципитации с использованием PLGA-NH2 (56,84 ± 16,09%) (p < 0,01). Интересно, что в отличие от процедуры двойной эмульсии, синтез нано-преципитата с использованием карбоксил-терминированного PLGA не привел к инкапсуляции. Это можно объяснить электростатическими силами отталкивания между полимером и pDNA во время нано-преципитации, в отличие от двойной эмульсии и микрофлюидики, где другие силы, такие как эмульгирование с помощью соникации и межфазное натяжение в каналах микрореактора, способствуют инкапсуляции.

Сохранение структурной целостности и функциональности инкапсулированного генетического материала является критически важным при использовании наночастиц в качестве векторов генотерапии. В этом смысле наши результаты показали, что метод двойной эмульсии при помощи ультразвука привел к расщеплению pDNA на мелкие фрагменты в результате действия тонкозондового соникатора (Рисунок 5, полоса 1 и Дополнительный рисунок S3). Модификация времени и амплитуды соникации не предотвращала деградации плазмиды (данные не показаны). В этом смысле инкубация с PEG, как утверждается, защищает целостность pDNA во время пакетного синтеза двойной эмульсии под действием ультразвука [56]. Однако в этих условиях наши данные показали обширную деградацию плазмиды (73,64% от общего количества pDNA) и разворачивание в никелированную открыто-циркулярную изоформу (18,86% от общего количества pDNA) (Рисунок 5, полоса 2).

В качестве альтернативы некоторые авторы использовали гомогенизаторы вместо соникации тонкого зонда для эмульгирования, сообщая об открытых циркулярных и сверхсвернутых конформациях [42]. Однако в наших руках использование гомогенизаторов не сохраняло структуру инкапсулированной высокомолекулярной pDNA (Дополнительный рисунок S3, полосы 2, 3 и 4) и приводило к образованию более крупных наночастиц (данные не показаны).

Несмотря на то, что метод выпаривания растворителя из двойной эмульсии с помощью ультразвука был использован для синтеза функциональных наночастиц PLGA, нагруженных нуклеиновыми кислотами, структура нуклеиновых кислот обычно не анализируется, а соникаторы или гомогенизаторы, используемые для приготовления эмульсий, могут вызывать механический сдвиг. Этот тип напряжения приводит к нарушению последовательности нуклеотидов или изменяет сверхсвернутую функциональную конформацию плазмиды на открытые кольцевые или линейные изоформы [62,63].

Более того, эти исследования обычно проводятся с использованием плазмид средней и низкой молекулярной массы (обычно около 5,5 кб, но до 7,3 кб) [35,42,64-66], которые могут быть менее чувствительны к разворачиванию или разрыву при соникации, чем более крупные цепи нуклеиновых кислот. Фактически, насколько нам известно, это первое исследование, подтверждающее возможность инкапсулирования с помощью ультразвука или микрофлюидики в двойную эмульсию больших pDNA (9,4 кб), подобных тем, которые кодируют систему редактирования генов CRISPR/Cas (размер которых обычно составляет около 9,10 кб) [2].

С другой стороны, методы на основе микрофлюидики полагаются не на соникацию для эмульгирования, а на поток через микро-каналы небольшого размера. Инкапсулирование pDNA с помощью двойной эмульсии на основе микро-флюидики привело к высокому напряжению сдвига, которое изменило сверхсвернутую структуру плазмиды.

В частности, синтез на основе микро-флюидики с использованием холата натрия показал 64,80 ± 1,99% и 35,20 ± 1,99% для линейной и никелированной открыто-круговой изоформ (Таблица 1 и Рисунок 5, полоса 3), в то время как использование PVA привело к 45,01 ± 26,28% и 54,99 ± 26,28%, соответственно (Таблица 1 и Рисунок 5, полоса 4). Сообщается, что обе изоформы останавливают трансфекцию клеток [67], что, наряду с большим размером плазмиды, который также снижает эффективность трансфекции "per se" [3], способствовало отсутствию экспрессии pDNA в экспериментах с клетками in vitro (данные не показаны).

Учитывая, что реагенты, использованные для двойной эмульсии, были общими для пакетного ультразвукового и микро-флюидического синтезов и не влияли на структуру плазмид (Дополнительный рисунок S3), это, вероятно, является следствием механического напряжения при прохождении через микроканалы. К сожалению, снижение напряжения сдвига путем уменьшения скорости потока жидкости приводит к увеличению размера и поли-дисперсности наночастиц [68].

В свою очередь, нано-преципитация с аминоконцевым PLGA сохранила часть сверхсвернутой и функциональной изоформы плазмиды (приблизительно 42%), в то время как оставшиеся 58% показали расслабленную конформацию (Рисунок 5, полоса 6). Расслабленная конформация, вероятно, вызвана воздействием комбинации реагентов для синтеза (Дополнительный рисунок S4). Однако, учитывая высокую эффективность инкапсуляции (56,84 ± 16,09%, что эквивалентно 4,12 ± 1,09 масс.%) и то, что NPs не являются цитотоксичными и достигается эффективная интернализация клеток и высвобождение груза, эти нано-структуры имеют потенциал для индуцирования экспрессии pDNA в клетках in vitro. Поэтому далее были проанализированы цитотоксичность NPs, интернализация клеток и высвобождение груза.

Отслеживание высвобождения pDNA из наночастиц, синтезированных методом нано-преципитации с аминотерминированным PLGA, показало, что в течение первых 24 ч при 4 °C и 37 °C высвободилось только около 2,2% и 4% инкапсулированной pDNA соответственно. Этот результат можно объяснить электростатическими взаимодействиями между крупной pDNA и положительно заряженным аминотерминированным PLGA в водной среде, которые могут быть достаточно сильными, чтобы предотвратить высвобождение плазмиды из частицы или быструю реадсорбцию после высвобождения, как сообщалось ранее для других полимеров и грузов [69-71].

Предварительные исследования нашей группы показывают, что высвобождение груза из наночастиц также может варьироваться в зависимости от используемой жидкости для суспендирования. В этом смысле, при использовании фосфатно-буферного солевого раствора (PBS) при различных pH, скорость высвобождения pDNA достигала 40% при 4 °C и 70% при 37 °C в течение первых 24 часов (Дополнительный рисунок S5A,B, соответственно). Эти результаты также можно объяснить электростатическими взаимодействиями, поскольку PBS содержит соли, которые создают ионную среду, отличную от водной, что может изменить взаимодействие между pDNA и PLGA. Действительно, эти данные согласуются с литературными данными, в которых другие авторы сообщали о высвобождении до 50% pDNA из наночастиц PLGA, разведенных в PBS при pH от 4,5 до 7 в течение первых часов после синтеза [45,46].

Наконец, при определенном методе синтеза модификация используемого поверхностно-активного вещества может способствовать высвобождению груза [42]; однако другие физико-химические характеристики NPs, такие как размер частиц, также будут варьировать.

Примечательно, что после 72 ч инкубации в воде Milli-Q при 37 °C наблюдалось резкое снижение измеренной концентрации высвобожденной pDNA что было совместимо с расщеплением pDNA наблюдаемым при электрофорезе в агарозном геле (Дополнительный рисунок S6). Поскольку это событие повторялось в нескольких синтезах, проведенных с различными запасами реагентов, прошедших автоклавирование и/или стерилизацию, а также поскольку прямая инкубация запасов pDNA в воде при 37 °C не показала деградации плазмиды (Дополнительный рисунок S6, полоса 1), это явление вряд ли связано с загрязнением реагентов и/или буферов ДНК. Однако, в растворах, содержащих первичные амины [72], таких как полимер PLGA-NH2, сообщалось о депуринизации спирали ДНК, что могло усилиться в наших экспериментальных условиях при 37 °C. Поэтому мы не можем исключить, что это расщепление нуклеотидов лежит в основе измеряемого низкого высвобождения плазмидной ДНК.

Действительно, эта гипотеза согласуется с результатами, полученными в анализе высвобождения с использованием PLGA NPs, разведенных в PBS при различных pH, где деградация плазмиды, хотя и при недельной инкубации, также наблюдается при 37 °C при 5,5 и 6 pH (Дополнительный рисунок S5D), но не при 4 °C (Дополнительный рисунок S5C). Согласно литературным данным, депуринизация зависит от pH; чем больше кислотность, тем больше депуринизация [73]. Кроме того, высокая температура (37 °C) способствует деградации PLGA в молочную и ко-гликолевую кислоты, которые постепенно подкисляют среду [74,75].

В совокупности эти данные согласуются с прогрессирующим закислением среды, окружающей НП, в результате гидролиза PLGA, усиленного высокотемпературной инкубацией при 37 °C. Кислые pH выше 3, как известно, способствуют депуринизации цепей ДНК в среде, богатой первичными аминами, такой как аминотерминированный PLGA, и, таким образом, объясняют деградацию, наблюдаемую в агарозных гелях. Поскольку PBS является лучшим буферным раствором по сравнению с водой, процесс окисления, вероятно, замедляется, что приводит к более поздней деградации pDNA (одна неделя инкубации против 72 ч).

Взаимодействие между нагруженными pDNA PLGA NPs и клетками было также проанализировано с точки зрения жизнеспособности и поглощения клеток in vitro. Как пустые, так и нагруженные pDNA наночастицы оказались не-цитотоксичными для клеток NSC-34 (рис. 6). Этот результат подтверждает литературные данные о высокой биосовместимости и низкой токсичности PLGA NPs [9].

Следует отметить, что при концентрациях выше 0,2 мг/мл наблюдалось увеличение жизнеспособности клеток (Рисунок 6А), что, возможно, связано с активацией плазмидой путей роста клеток, поскольку обработка пустым NPs не показала никакого эффекта (Рисунок 6Б). В качестве альтернативы, индуцированное увеличение метаболической активности клеток, обработанных pDNA-NP, может привести к большему снижению ресазурина при этих концентрациях. Для понимания молекулярных механизмов, лежащих в основе этих результатов, необходимы дальнейшие исследования.

Средние показатели интернализации PLGA и pDNA в одной клетке были определены с помощью флуориметрии через 24 ч и 48 ч после обработки. Результаты показали, что большинство нагруженных pDNA PLGA NPs интернализуются в течение первых 24 часов (Рисунок 7A,B). В частности, 0,127 ± 0,029 и 0,137 ± 0,016 нанограмм PLGA на клетку были интернализированы в течение 24 и 48 часов, соответственно. Исходя из эффективности инкапсуляции pDNA это соответствует 2,282 и 2,469 пикограммам pDNA на клетку, что составляет более 235 000 копий плазмиды на клетку.

Интернализация нагруженных pDNA PLGA NPs была также продемонстрирована с помощью конфокальной микроскопии (Рисунок 7C). Через 4 ч после обработки уже были видны небольшие агрегаты наночастиц на поверхности клеточной мембраны и цитоплазмы NSC-34. Через 8 ч поглощение наночастиц увеличилось, и поверхностные наночастицы наблюдались редко. Наибольшее количество цитоплазматических наночастиц было достигнуто через 12, 24 и 48 ч после обработки. Кроме того, было показано, что как покоящиеся, так и делящиеся клетки интернализируют наночастицы (Рисунок 7C, 8 ч).

К сожалению, экспрессия плазмиды не наблюдалась на основании обнаружения белка RFP (Дополнительный рисунок S7), что может быть следствием медленного высвобождения плазмиды из PLGA, наблюдаемого для этих наночастиц в водной среде. Тем не менее, поглощение и экспрессия pDNA сильно зависят от клеточной линии, а клеточные модели нейронов часто относительно трудно интернализировать даже с помощью коммерческих реагентов, таких как липофектамин. В качестве альтернативы, для достижения экспрессии плазмиды следует рассмотреть другие аспекты, а именно увеличение загрузочной способности NPs или улучшение сохранения функциональной структуры плазмиды и интернализации клеток. В этом смысле интернализация клеток pDNA PLGA NPs в значительной степени зависит от размера частиц и дзета-потенциала, клатрин-зависимый и -независимый эндоцитоз являются основными путями для частиц размером от 90 до 120 нм [76]. Как упоминалось выше, нагруженные pDNA PLGA NPs имеют отрицательный дзета-потенциал (несмотря на то, что PLGA-NH2 является катионом); однако положительный заряд поверхности позволит взаимодействовать с клеточной мембраной и будет способствовать интернализации NPs. Альтернативно, катионное полимерное покрытие и/или конъюгация лигандов могут способствовать таким взаимодействиям и поглощению клеток, но структурная целостность и функция pDNA должны быть заново оценены в этих условиях.

4. Все три метода синтеза, рассмотренные в данной работе, продемонстрировали частичное или полное изменение структуры плазмидной ДНК большого размера.

При двойной эмульсии механическое напряжение сдвига, индуцированное соникаторами и гомогенизаторами, вероятно, стоит за нарушением последовательности нуклеотидов или изменением функциональной конформации плазмиды в виде открытой кольцевой или линейной изоформы. Более того, впервые в данной работе инкапсуляция pDNA была проанализирована с использованием микрофлюидных систем, где механическое напряжение более мягкое и ограничено потоком раствора pDNA через микроканалы. Однако баланс, необходимый между высоким напряжением сдвига для продвижения процесса эмульгирования при достижении высокой загрузки груза и низким напряжением сдвига для предотвращения повреждения плазмиды, был недостижим в изученных условиях.

В качестве альтернативы, нано-преципитация с аминотерминированным PLGA привела к высокой (57%) эффективности инкапсуляции и частичному сохранению сверхсвернутой структуры pDNA. Однако высвобождение груза pDNA в воде снижается, вероятно, из-за сильных электростатических взаимодействий между PLGA и pDNA что ограничивает его использование для подходов in vitro и in vivo. При условии, что этот последний недостаток будет успешно преодолен, наночастицы, синтезированные методом нанопреципитации, изготовленные в данной работе, являются перспективными кандидатами в качестве крупногабаритных носителей плазмид, исходя из их размера, эффективности инкапсуляции и сохранения сверхсвернутой конформации pDNA.

Кроме того, хотя было продемонстрировано значительное поглощение клетками этих наночастиц, инкапсуляция pDNA большого размера привела к образованию отрицательно заряженных наночастиц, что может препятствовать высокому взаимодействию с клеточной мембраной и поглощению. Такие стратегии, как конъюгация лигандов или покрытие наночастицы катионным полимером (например, с помощью полилизина), могут быть использованы для изменения этого заряда и содействия интернализации клеток. Однако следует учитывать последующее изменение размера частиц или конформации плазмиды.

Важно отметить, что существуют многочисленные и технически сложные переменные и требования к векторам, которые могут влиять на трансфекцию клеток, например, размер наночастиц, сохранение целостности груза и его высвобождение, заряд поверхности или загрузочная способность. Эти параметры часто трудновыполнимы в целом, как это наблюдалось в данном исследовании с большими плазмидами, что делает большинство традиционных методов синтеза наночастиц непригодными для инкапсуляции последовательностей, кодирующих механизмы редактирования генов.

В целом, в нашей работе мы сравнили наиболее часто встречающиеся в литературе методики инкапсуляции лекарств и нуклеиновых кислот в наночастицы на основе полимера PLGA, включая новую микрофлюидическую эмульсионную систему. Однако особенности плазмид, используемых в технологии редактирования генов, с точки зрения размера и заряда делают их чувствительными к некоторым процессам и наиболее часто используемым реагентам. Таким образом, для адаптации наночастиц PLGA в качестве векторов доставки для терапевтической технологии редактирования генов необходима дальнейшая оптимизация или альтернативные методы синтеза.