PLK1 (поло-подобная киназа 1) - это серин/треониновая киназа, которая высоко экспрессируется в фазе G2 клеточного цикла, где она контролирует переход метафазы в анафазу и выход из митоза [31]. Она часто избыточно экспрессируется во многих опухолевых клетках [32,33]. Нокаут или нокдаун гена PLK1 с помощью редактирования генов или других технологий является перспективным подходом для лечения рака [1,[34-37]]. Перед конструированием плазмиды CRISPR/Cas9 мы разработали четыре одноцепочечные последовательности sgRNA, нацеленные на ген PLK1, с помощью онлайн-инструмента проектирования (http://crispr.mit.edu) и приготовили двуцепочечные sgRNAs методом градиентного отжига. Затем мы модифицировали коммерческую плазмиду PX458 (PX458-E), вставив последовательности sgRNAs в каркас sgRNAs с помощью ДНК-лигазы T4 (рис. S1). Модифицированные плазмиды были размножены путем трансфекции и культивирования в E coli. Результаты секвенирования показали отсутствие несовпадений пар оснований, что подтвердило успешное создание рекомбинантной Cas9-sgPLK1 плазмиды (psgPLK1) (рис. S1).

На сегодняшний день для доставки РНК и ДНК было успешно разработано несколько ионизируемых липидов, таких как Dlin-MC3-DMA и C12-200. Как правило, ионизируемый липид состоит из гидрофильной амино-головки и гидрофобных хвостов из алкильных цепей. Сообщалось, что липиды, содержащие ионизируемые амины, более эффективно доставляют малые РНК in vivo, чем неионизируемые липиды, которые содержат постоянно заряженные четвертичные аминные молекулы в своей гидрофильной головной группе. Оптимальная внутриклеточная доставка зависит от оптимального баланса ионизированных аминов для облегчения связывания и высвобождения нуклеиновых кислот LNPs. Значение pKa является важной молекулярной характеристикой ионизируемых липидов, и липиды со значением pKa между 6,2 и 6,5 показали лучшую доставку siRNA in vivo. При таком резком значении pKa ионизируемые ЛНП имеют минимальный заряд в нейтральной физиологической среде для максимального поглощения гепатоцитами путем ApoE-опосредованного эндоцитоза и максимальный положительный заряд в кислом эндосомном отсеке для содействия разрушению мембраны. В результате липиды со значением pKa между 6,2 и 6,5 обеспечивают баланс между двумя противоположными требованиями к доставке, улучшая результирующую функциональность. pKa клинически применяемого Dlin-MC3-DMA составляет 6,44, а ED50 (средняя эффективная доза для подавления гена FVII у самок мышей C57BL/6 при внутривенном введении) LNPs, приготовленных на основе Dlin-MC3-DMA и C12-200, составляет 0,03 мг/кг (до оптимизации состава) или 0,005 мг/кг (после оптимизации состава) [38], и 0,02 мг/кг [39], соответственно, это два липида с наилучшей эффективностью доставки, о которых сообщалось в настоящее время. В дополнение к pKa, соответствующие показатели гидрофобных хвостов, длина и ненасыщенность липидной цепи также служили важными факторами при разработке липидов. Основываясь на этих принципах конструирования липидов, мы синтезировали и исследовали ионизируемый липид, названный iLY1809. Химические структуры iLY1809, DSPC, DMG-PEG2000 и холестерина показаны на рис. S2.

LNPs на основе iLY1809 (iLP181), содержащие различные липиды, были довольно легко приготовлены путем выливания раствора липидов (органическая фаза) в цитратный буфер для формирования классических пузырьков с бислойной структурой (рис. 1A). Затем плазмиды CRISPR/Cas9 были инкапсулированы в LNPs посредством дополнительного этапа инкубации с iLP181. Этот этап инкубации необходим для сборки LNPs и стабилизации системы. Липид iLY1809, использованный в данном исследовании, является запатентованным ионизируемым липидом, который обладает положительным зарядом и захватывает нуклеиновые кислоты при кислом pH, но становится нейтрально заряженным при физиологическом pH. Липид PEG образует диффундирующий внешний слой PEG для увеличения периода полураспада LNPs в кровотоке [40]. DSPC влияют на морфологию и размер наночастиц, тем самым влияя на эффективность доставки [41]. Последний компонент холестерин является наиболее распространенным липидом, используемым при приготовлении LNPs, который помогает стабилизировать LNPs [41,42]. Значение pKa состава iLP181, определенное с помощью TNS-анализа, составило приблизительно 6,43 (рис. 1B), что соответствовало нашей концепции проектирования и отвечало требованиям ионизируемой липидной наночастицы, обеспечивающей эффективный эндосомный выход полезной нагрузки нуклеиновой кислоты в клетках [38,43]. Кроме того, сформулированные LNPs iLP181/CRISPR имели однородную сферическую форму с четкими бислойными мембранами (рис. 1С). Размер составлял приблизительно 100 нм (рис. 1С, D и 1E). Индекс полидисперсности (PDI) был ниже 0,2, что указывает на узкое распределение частиц по размерам (рис. 1E). zeta-потенциал был близок к нейтральному при физиологическом pH. В клетках, обработанных составом iLP181, наблюдалась жизнеспособность более 85% клеток, что свидетельствует об идеальной биосовместимости LNPs iLP 181 in vitro (рис. 1F).



Fig. 1. Physicochemical characteristics of iLP181 LNPs. (A) The schematic diagram of LNPs. (B) The pKa value of iLP181 formulation determined via TNS assay. (C) The morphology of LNPs was visualized by TEM. (D and E) The physicochemical parameters and size distribution of the formulation. (F) The cell viability was measured by MTT assay. (G and H) The stability of iLP181 LNPs was evaluated in body fluid-mimicking system for two weeks. HS, human serum.

Кроме того, стабильность LNPs iLP181/psgPLK1 была измерена в системе, имитирующей жидкость организма. Размер и zeta-потенциал LNPs были стабильными и однородными после инкубации в PBS или в 10% сыворотке человека в течение двух недель, что подтверждает исключительную стабильность и относительную безопасность LNPs iLP181 (рис. 1G и H).

Чтобы проверить эффективность редактирования генов, мы трансфицировали psgPLK1 в клетки HEK293A с помощью Lipo2000. Экспрессия GFP, белка-метки в плазмиде PX458, наблюдалась с помощью флуоресцентного микроскопа через 24 ч и 48 ч после трансфекции, соответственно (рис. S3A и S3B). Было показано, что и PX458-E, и psgPLK1 эффективно экспрессировали GFP в клетках HEK293A. Кроме того, эффективность доставки LNPs iLP181 в клетки также оценивалась с помощью лазерной конфокальной микроскопии. Как показано на рис. S3C и 3D, картина экспрессии GFP была такой же, как и на рис. S3A и 3B. Таким образом, iLP181 продемонстрировали сопоставимую с Lipo2000 эффективность внутриклеточной доставки CRISPR/Cas плазмиды.

Кроме того, на основе самостоятельно разработанной серии последовательностей sgRNA, нацеленных на ген PLK1, мы также сконструировали серию плазмид CRISPR/Cas9 и оценили эффективность их генного редактирования в клетках HEK293A с помощью Lipo2000. Было показано, что последовательность sgPLK1-1 проявила наилучшую активность, а эффективность редактирования генов достигла 33% (рис. 2А). Затем мы трансфицировали плазмиду psgPLK1, содержащую последовательность sgPLK1-1, с помощью iLP181 и определили эффективность долгосрочного нокдауна мРНК в клетках HepG2-Luc. Клетки трансфицировали в течение 3 и 7 дней, соответственно, и собирали для анализа уровня мРНК. Было обнаружено, что iLP181 обеспечивает значительную эффективность нокдауна мРНК в клетках HepG2-Luc, особенно 32%-ный нокдаун на 7-й день, что указывает на долгосрочность эффекта редактирования генов, опосредованного плазмидой (рис. 2B).



Fig. 2. Evaluation of iLP181/psgPLK1-mediated gene editing and endocytosis mechanism on cells. (A) sgRNA sequence selection. (B) Long-term evaluation of iLP181/psgPLK1-mediated gene editing in HepG2-Luc cells. (C-F) ApoE-dependent cellular uptake of iLP181 LNPs in HepG2-Luc cells. (C) Flow cytometry recorded internalization of iLP181 LNPs. (D) Quantitative analysis of (C) by using FlowJo 7.6.1 software. (E) Confocal laser scanning microscopy (CLSM) images of cells received various treatments. Scale bar, 50 ?m. (F) Quantitative analysis of (E) by using Image J software. Opti-MEM and DMEM represented the cells transfected with iLP181/Cy5-NA in serum-free medium (Opti-MEM) or complete medium (DMEM), respectively. 'DMEM+ApoE' represented the cells treated with iLP181/Cy5-NA/ApoE mixture in complete medium. Cy5-NA, Cy5-labelled nucleic acid. # represents comparison with Lipo2000/siPLK1, * represents the comparison with control in (A) or Lipo2000/psgPLK1 in (B). * or #, P < 0.05; ** or ##, P < 0.01; *** or ###, P < 0.001. "ns", no statistical difference.

Сообщается, что ионизируемые LNPs (iLNPs) могут доставлять полезную нагрузку в гепатоциты через активный механизм нацеливания на печень. При системном введении iLNPs могут связываться с аполипопротеином E (ApoE) в кровообращении, затем взаимодействовать с рецептором липопротеина низкой плотности (LDLR), высоко экспрессирующимся белком в гепатоцитах, и, наконец, интернализироваться гепатоцитами через LDLR-опосредованный эндоцитоз [43,44]. В данном исследовании клетки HepG2-Luc с избыточной экспрессией LDLR использовались для оценки того, является ли ApoE важным фактором для поглощения iLNPs клетками. Как показано на рис. 2C и D, можно четко определить, что при добавлении ApoE в культуральную среду количество поглощенных клетками LNPs iLP181 было значительно больше, чем без ApoE, что свидетельствует о том, что ApoE значительно увеличивает поглощение iLNPs клетками. Кроме того, субклеточная локализация нуклеиновых кислот полезной нагрузки также подтвердила, что ApoE способствовал интернализации iLP181 LNPs (рис. 2E и F).

Все больше фактов показывают, что только 3,5% (даже менее 1%) интернализованных нуклеиновых кислот могут выйти из эндосомы и попасть в цитозоль, чтобы опосредовать замалчивание генов [45-48], это требует разработки средств доставки, способных быстро выходить из эндосом. Поэтому мы провели эксперименты по изучению эндосомного выхода iLP181 и сравнили преимущества iLP181 и коммерческих трансфекционных реагентов Lipo2000. На рис. S4A для выяснения основного механизма были тщательно изучены интернализация и внутриклеточное перемещение iLP181/Cy5-меченых нуклеиновых кислот (iLP181/Cy5-NA) в клетках HepG2-Luc. Было замечено, что через 1-3 ч после трансфекции iLP181/Cy5-NA и Lipo2000/Cy5-NA попадали в клетки и интернализировались эндосомами или лизосомами (рис. S4A, 4B, 4D, 4E). По-разному, примерно через 3-5 ч после трансфекции, iLP181/Cy5-NA выходили из эндосом/лизосом (рис. S4C), в то время как в группах Lipo2000 значительного выхода из эндосом не наблюдалось (рис. S4F). MFI iLP181/Cy5-NA и Lipo2000/Cy5-NA увеличивался с увеличением времени трансфекции, что указывает на накопление все большего количества нуклеиновых кислот в клетках HepG2-Luc (рис. S4B и 4E).

Далее мы исследовали интернализацию и субклеточную локализацию (рис. 3A) в присутствии хлорохина (50 µM, агент, разрушающий лизосомы) и бафиломицина A1 (200 нМ, ингибитор протонного насоса, избирательно ингибирующий вакуолярную H+- АТФазу), чтобы оценить, вызывают ли iLP181/нуклеиновые кислоты эффективное усиление трансфекции и используют ли iLP181 лизосомы/эндосомы для внутриклеточной транспортировки, соответственно [49]. Трансфекцию iLP181 LNPs и состава Lipo2000 проводили в полной среде (DMEM), содержащей сыворотку. MFIs iLP181 LNPs был значительно выше, чем у группы Lipo2000 (рис. 3B). Между тем, коэффициент колокализации между нуклеиновой кислотой и лизосомой/эндосомой был рассчитан и применен для оценки эффективности выхода из эндосомы. Добавление хлорохина в клетку привело к значительному снижению значения коэффициента колокализации LNPs iLP181 (~58,33%) и состава Lipo2000 (~17,26%), тогда как добавление бафиломицина A1 в клетку привело к значительному увеличению значения коэффициента колокализации LNPs LP181 (~87,00%) и состава Lipo2000 (~43,32%) (рис. 3C). MFI составов Lipo2000/Cy5-NA были в целом слабыми, что приводит к меньшему значению коэффициента колокализации по сравнению с комплексами iLP181/нуклеиновая кислота. Результаты показали, что хлорохин несколько увеличивал трансфекцию LNPs iLP181 и Lipo2000, а бафиломицин A1 снижал их трансфекцию (рис. 3C).



Fig. 3. Endosomal escaping of iLP181 on cells. (A) Subcellular localization of iLP181/Cy5-NA in HepG2-Luc cells observed with confocal laser scanning microscopy (CLSM). Scale bars, 20 ?m. (B) Mean fluorescence intensities (MFIs) of Cy5-NA. (C) Colocalization ratio of Cy5-NA and Lysotracker Green-stained endosomes. The MFI and colocalization ratio were analyzed with Nikon NIS-Elements analysis software. *, P < 0.05; **, P < 0.01.

Затем мы оценили биораспределение LNPs iLP181 в организме носителей опухолей. Плазмида, экспрессирующая Cy5-NA и красный флуоресцентный белок (RFP), была соединена с iLP181 для получения однородных LNPs, которые вводили через хвостовую вену мышам C57BL/6 в дозе 1 мг/кг (рис. 4). Флуоресценцию Cy5 и RFP оценивали с помощью системы визуализации in vivo в разные моменты времени. Как показано на рис. 4A и B, флуоресценция Cy5 в группе голых Cy5-NA исчезла через 24 ч после введения, тогда как LNPs iLP181 демонстрировали значительно более сильную флуоресценцию в течение как минимум 24 ч в организме мышей и накапливались в основном в печени и опухоли. Количественный анализ средней интенсивности флуоресценции подтвердил вышеуказанные результаты (рис. 4C-F). Кроме того, была обнаружена экспрессия RFP. На рис. 4Г видно, что группа LNPs имела самый сильный сигнал флуоресценции RFP в опухолях в течение исследуемых часов. Голым нуклеиновым кислотам крайне сложно накапливаться в опухолях. Более того, интенсивность флуоресценции RFP в опухолях не уменьшилась в течение 5 дней. Это явление соответствовало количественному анализу флуоресценции различных органов (рис. S5). Эти результаты позволили предположить, что iLP181 является отличной системой системной доставки CRISPR/Cas системы.



Fig. 4. In vivo biodistribution of iLP181/psgPLK1 LNPs. (A)The whole body and (B) isolated main organs were fluorescently examined using an in vivo imaging system at different times post administration. The mean fluorescence intensities (MFIs) of the tumors in vivo (C) and the isolated organs at (D) 6 h, (E) 12 h and (F) 24 h were quantitatively analyzed. (G) The isolated organs were imaged at 2 d, 3 d and 5 d post administration.

PLK1 считается прото-онкогеном, участвующим в регуляции клеточного цикла, неопластической трансформации и опухолевого супрессора p53. Избыточная экспрессия PLK1 является объяснимым событием в опухолевых клетках. Липосомный препарат siPLK1, TKM-080301, ранее был исследован во II фазе клинических испытаний для лечения солидных опухолей [50]. Таким образом, противоопухолевый эффект iLP181/psgPLK1 был оценен с использованием ксенотрансплантата опухоли на мышиной модели. Мышам давали различные составы каждые два дня, регистрировали объем и вес опухоли (рис. 5А). В конце эксперимента экспрессию люциферазы в опухолях определяли путем внутрибрюшинного введения субстрата люциферазы. По сравнению с другими группами, активность люциферазы у мышей, обработанных iLP181/psgPLK1, значительно снизилась, что можно объяснить уменьшением размеров опухоли и снижением популяции раковых клеток (рис. 5B). Кроме того, были зарегистрированы изменения объема опухоли (рис. 5C), указывающие на то, что скорость роста опухоли в группе iLP181/psgPLK1 была значительно медленнее, чем в других группах. В конце эксперимента опухоли были изолированы и выделена общая РНК. Было замечено, что экспрессия мРНК PLK1 была явно подавлена iLP181/psgPLK1 (рис. 5D), что указывает на редактирование генов в этой группе. Группа iLP181/siPLK1 показала сопоставимую эффективность ингибирования в отношении мРНК PLK1, поскольку не наблюдалось никакой разницы между iLP181/psgPLK1 и iLP181/siPLK1. Более того, не было зарегистрировано значительных изменений массы тела (рис. 5E) и отношения массы печени к массе тела (рис. 5F), что подтверждает, что препарат iLP181 не вызывал значительных побочных эффектов у мышей. Окрашивание H&E срезов опухоли показало, что у животных, получавших iLP181/psgPLK1 или iLP181/siPLK1, наблюдался значительный апоптоз и гибель клеток (рис. 5G). Эти результаты показали, что система редактирования генов psgPLK1 была успешно доставлена в опухолевые клетки с помощью iLP181, и было достигнуто значительное ингибирование роста опухоли in vivo. Учитывая, что PLK1 является широко экспрессированным и сверхэкспрессированным онкогеном, поэтому iLP181/psgPLK1 можно применять для лечения других опухолей с высокой экспрессией гена PLK1, таких как рак легких, рак молочной железы и так далее.



Fig. 5. In vivo anti-tumor efficacy of iLP181/psgPLK1 LNPs. (A) Scheme of tumor inoculation and intratumoral injection of PBS, iLP181/PX458-E, iLP181/siPLK1, and iLP181/psgPLK1 in HepG2-Luc tumor-bearing mice. Mice were injected 7 days post tumor inoculation (day 1). Injections were performed every 2-4 days for 8 times. (B) Bioilluminance imaging of animals at the end of experiment. (C) Tumor growth curves monitored throughout the experimental period. (D) PLK1 mRNA expression in the tumor tissues at the end of experiment. (E) Organ coefficient of the liver at the end of experiment. (F) Body weight recorded during the treatment course. (G) H&E staining of tumor sections prepared at the end of treatment. Scale bar, 50 ?m. N = 6. * represents comparison with PBS, and *, P < 0.05; ***, P < 0.001. "ns", means no statistical difference.

Для оценки безопасности LNPs iLP181 в системе кровообращения был применен анализ гемолиза (рис. 6А). В группах LNPs с формулой iLP181 PX458-E, siPLK1 и psgPLK1 при pH7.4 гемолиз не наблюдался, в то время как при pH5.5 в этих группах наблюдался небольшой гемолиз, что свидетельствует о достаточной безопасности LNPs iLP181 в физиологических условиях, в то время как в кислой среде может произойти эффективный выход эндосом. Более того, токсичность составов iLP181 в естественных условиях была дополнительно оценена после того, как мышей обрабатывали различными LNPs в течение более 20 дней. Образцы крови были собраны для биохимического анализа сыворотки, а основные органы были вскрыты для окрашивания H&E в конце эксперимента. Функции печени и почек, двух основных органов распределения и выведения препарата iLP181, хорошо сохранялись, так как биохимические показатели сыворотки крови оставались на нормальном уровне (рис. 6B). Более того, по сравнению с группой PBS (рис. 6C), iLP181/psgPLK1 не вызвали никаких патологических повреждений основных органов. На основании этих наблюдений мы пришли к выводу, что состав iLP181 хорошо переносится животными, и его можно использовать для безопасной и эффективной доставки системы CRISPR/Cas как in vitro, так и in vivo.



Fig. 6. In vivo safety evaluation of iLP181 formulations. Mice were treated with various iLP181 formulations via intravenously injection at a dose of 0.5 mg/kg (for siRNA or plasmid). (A) Hemolysis assay. (B) Examinations of serum biochemistry parameters. (C) H&E staining of the major organ sections. Scale bar, 100 ?m.

Технология CRISPR/Cas стала мощным инструментом редактирования генома для биомедицинских целей. Однако разработка безопасной и эффективной невирусной технологии доставки для системы CRISPR/Cas является неотложной и сложной задачей. Мы представили запатентованный ионизируемый липидный LNP, названный iLP181, и тщательно оценили его эффективность по доставке противораковой системы CRISPR/Cas9 как in vitro, так и in vivo. Были разработаны и проверены четыре плазмиды, содержащие экспрессионную рамку белка Cas9 и sgRNA, нацеленные на PLK1. Одна из них с наилучшей активностью (psgPLK1) была выбрана и загружена в iLP181. Наше исследование показало, что iLP181/psgPLK1 эффективно интернализировались клетками карциномы печени путем связывания с ApoE. Долгосрочное редактирование генов было достигнуто как in vitro, так и in vivo. Более того, LNPs iLP181 продемонстрировали надежный эндосомный выход при доставке нуклеиновых кислот по сравнению с коммерческим Lipo2000, что привело к значительному торможению роста опухоли у мышей-носителей опухолей. Кроме того, предложенная липидная формула продемонстрировала идеальный профиль безопасности in vivo. Таким образом, данное исследование позволяет создать мощную невирусную платформу для доставки CRISPR/Cas системы и потенциальную схему лечения рака на основе редактирования генов.