A flexible split prime editor using truncated reverse transcriptase improves dual-AAV delivery in mouse liver
 Volume 30, Issue 3, 2 March 2022, Pages 1343-1351 https://doi.org/10.1016/j.ymthe.2022.01.005 | |
|---|---|
|
|
Prime editor (PE) имеет огромные перспективы для генотерапии. Однако доставка PE (более 6,3 кб) in vivo остается сложной задачей. Хотя PE может быть разделен на два фрагмента и доставлен с помощью двойных адено-ассоциированных вирусов (AAV), выбор сайтов разделения происходит в Cas9 - это влияет на эффективность редактирования - ограничена из-за большого размера PE. Кроме того, избыточная экспрессия обратной транскриптазы в клетках млекопитающих может нарушить терминацию трансляции через ее домен RNase H. Здесь мы разработали компактный PE без домена RNase H, который продемонстрировал редактирование, сравнимое с полноразмерным PE. В компактном PE мы использовали сайт сплайсинга Cas9 (Glu 573), который поддерживал надежное редактирование в клетках (до 93% от полноразмерного PE) и в печени мыши. Затем мы продемонстрировали, что split-cPE573, доставленный с помощью dual-AAV8, эффективно опосредует вставку 3-bp TGA в гене Pcsk9 в печени мыши. Компактный PE без домена RNase H отменил связывание с пептидил-релизинг фактором 1 (eRF1) и смягчил эффект считывания стоп-кодона, наблюдаемый у полноразмерного PE. Это исследование выявило компактный PE с гибкой конструкцией расщепления, что позволит расширить возможности редактирования праймеров in vivo.  Dual-AAV delivering split prime editor system for in vivo genome editing Shengyao Zhi, Yux Chen, Guanglan Wu et al. https://doi.org/10.1016/j.ymthe.2021.07.011 Prime editor (PE), новый инструмент редактирования генома, может генерировать все 12 возможных переходов между основаниями, вставку и удаление короткого фрагмента ДНК. PE имеет потенциал для исправления большинства известных мутаций, связанных с генетическими заболеваниями человека. Адено-ассоциированные вирусы (AAV), безопасные векторы, широко используемые в клиниках, не способны доставлять PE (~6,3 кб) в одном векторе из-за ограниченной загрузочной способности (~4,8 кб). Чтобы учесть загрузочную способность AAVs, мы сконструировали четыре сплит-PE (сплит-PE994, сплит-PE1005, сплит-PE1024 и сплит-PE1032) с использованием интеина Rma (Rhodothermus marinus). С помощью репортерной системы, мутировавшей в GFP, был проведен скрининг активности восстанавливающих PE, и были выявлены два эффективных сплит-PE (сплит-PE1005 и сплит-PE1024). Затем мы продемонстрировали, что сплит-PE, доставляемые с помощью dual-AAV1, особенно сплит-PE1024, могут опосредовать трансверсию и инсерцию оснований в четырех эндогенных сайтах в клетках человека. Чтобы проверить эффективность сплит-PE in vivo, сплит-PE1024 был доставлен в сетчатку взрослой мыши с помощью dual-AAV8. Мы продемонстрировали успешное редактирование Dnmt1 в сетчатке взрослой мыши. Наше исследование предоставляет новый метод доставки PE в ткани взрослого человека, прокладывая путь для терапии путем редактирования генов in vivo с помощью PE. 
|