AAV-опосредованное редактирование генов может стать еще одним способом преодоления этого ограничения. Редактирование генов - это новый метод, который позволяет разрезать, вставлять или заменять ДНК в геноме хозяина. В отличие от традиционных методов генотерапии, которые осуществляют генетические изменения случайным образом, редактирование генома позволяет точно редактировать ген в мутировавшем(их) участке(ах) [52]. Разработка системы кластеризованных регулярно перемежающихся коротких палиндромных повторов-ассоциированной эндонуклеазы 9 (CRISPR/Cas9) привлекла внимание к лечению LCA. Исследователи использовали стратегии редактирования генов для решения проблемы CEP290 IVS26-мутации, связанной с LCA. Maeder и др. загрузили AAV5 с Cas9 из Staphylococcus aureus и специфическими для CEP290 направляющими РНК (gRNAs), а для доставки системы (названной EDIT-101) в клетки фоторецепторов была выбрана субретинальная инъекция [53]. Авторы разработали два вида sgRNAи показали, что они не вызывают никаких внецелевых явлений для мутировавшего участка CEP290 и обладают высокой специфичностью. Почти нормальное зрение можно было получить при 10% от нормального уровня функциональных фовеальных конусных фоторецепторов, и было установлено, что система соответствует или превышает этот целевой терапевтический уровень в фоторецепторных клетках, полученных от мышей или приматов (не-человекообразных). Редактирование генов также применялось при LCA 2-го типа [54]. AAV, несущий донорскую ДНК и CRISPR-Cas9, был введен путем субретинальной инъекции, что привело к восстановлению функции сетчатки и защитило от дальнейшей дегенерации сетчатки. Эти исследования показали, что генетическая коррекция, опосредованная CRISPR-Cas9, может быть распространена на другие типы LCA, помимо LCA2 и LCA10, а также на другие офтальмологические заболевания, связанные с мутацией генов.

Хотя генотерапия на основе вирусных векторов в настоящее время доминирует при LCA, она имеет потенциальные ограничения, связанные с мутагенезом, высокой стоимостью и иммуногенностью. Поэтому исследователи также изучают невирусные векторы, которые могут преодолеть эти ограничения. Существует несколько широких категорий невирусных векторов, таких как те, которые используют голую ДНК, физические методы (генная пушка, электроперенос и т.д.) и химические подходы (липоплексы и полиплексы). Cideciyan и коллеги использовали "голый" анти-смысловой олигонуклеотид, нацеленный на мутацию гена CEP290, и наблюдали очевидное улучшение зрения у пациентов в течение 3 месяцев, без серьезных побочных явлений [55].

Другая группа использовала (1-aminoethyl) iminobis[N-(oleicylcysteinyl-1-amino-ethyl) propionamide] (ECO) для направленной липоплекс-опосредованной генотерапии LCA 2 типа. ECO, нагруженный плазмидной ДНК при надлежащем соотношении аминов и фосфатов (N/P), образовал стабильный липоплекс, который обеспечил высокоэффективную трансфекцию генов in vitro благодаря превосходному выходу из лизосом и восстановительному цитозольно-опосредованному высвобождению генов [56]. Авторы также наделили липоплексы полностью транс-ретиниламином, что позволило наночастицам специфически воздействовать на интерфоторецепторный ретиноид-связывающий белок (IRBP). После субретинальной инъекции многофункциональные комплексы ECO/pDNA обеспечили устойчивую экспрессию генов у мышей с мутацией RPE65, что привело к улучшению функции сетчатки без явного ее повреждения. Эти результаты показали, что использование all-trans-retinylamine-based ECO, безусловно, заложило основу для разработки потенциальной невирусной генотерапии редких моногенных заболеваний глаз, особенно LCA2.

В дополнение к вышеперечисленным стратегиям, многие исследовательские группы предложили различные методы повышения эффективности глазной генотерапии путем устранения различных барьеров в глазу. Хитозан, являясь катионным полимером природного происхождения, прикрепляется к слизистому слою на поверхности глаза и проникает в роговицу, преодолевая несколько барьеров доставки [57]. Поэтому он широко используется для глазной генотерапии. Jiang и коллеги обволокли несущую pDNA наночастицу (CS-NP) хитозаном, чтобы создать липо-наночастицу с двойной оболочкой (DLCS-NP), обладающую электроположительностью (рис. 2А). Чтобы оценить генную трансфекцию DLCS-NP/генных комплексов, авторы вводили различные плазмиды усиленного зеленого флуоресцентного белка (pEGFP)/полимерные комплексы модельным кроликам. Обработка DLCS-NP обеспечила самую высокую экспрессию маркера GFP через 2 дня [58].



Fig. 2. Examples for ocular delivery in the eyes, which are small but complicated. (A) Chitosan as a natural cationic polymer that can attach to the mucosal layer of the ocular surface for high-efficiency gene delivery. Permission from Ref. [58]. (B) Hyaluronic acid (HA) as a well-tolerated and biocompatible polymer is used to coat particles for intravitreal injection, and transfection efficiency was assessed in ARPE-19 cells. Permission from Ref. [59]. (C) The gene delivery efficiency of chondroitin sulfate-coated polyplex in dividing and differentiated RPE cells. Permission from Ref. [60].

HA хорошо переносится и биосовместима, поскольку широко распространена в организмах млекопитающих. Поэтому она приобрела значительный интерес в смысле доставки лекарств. Группа Martens синтезировала N, N'-цистаминбисакриламид-4-аминобутанол с электроположительной, содержащей отзывчивые дисульфидные связи основой, и НАs с различной молекулярной массой были применены для электростатического покрытия катионных полимерных pDNA генных комплексов. НА с молекулярной массой 22 кДа или 137 кДа заметно увеличивали подвижную фракцию полиплексов, а анализ трансфекции генов, проведенный в клетках ARPE-19, показал, что такое покрытие повышает эффективность доставки генов полимерами (рис. 2B) [59]. Подобно НА, хондроитинсульфат может повышать поглощение и эффективность трансфекции в глазах (рис. 2C). Subia et al. охарактеризовали комплексы, покрытые хондроитинсульфатом, с амфипатическими и катионными пептидами, кроме того, была оценена эффективность доставки генов в делящиеся и дифференцированные клетки RPE. Авторы обнаружили, что пептиды эффективно конденсировали плазмидную ДНК, а покрытие из хондроитинсульфата способствовало накоплению комплексов в стекловидном теле, и стабильность гена также повышалась при воздействии анионного гепаринсульфата [60].

(A) Хитозан как природный катионный полимер, который может прикрепляться к слизистому слою глазной поверхности для обеспечения высокоэффективной доставки генов [58]. (B) Гиалуроновая кислота (HA) как хорошо переносимый и биосовместимый полимер используется для покрытия частиц для интравитреальной инъекции, а эффективность трансфекции оценивалась в клетках ARPE-19. [59]. (C) Эффективность доставки генов полиплекса с покрытием из хондроитинсульфата в делящиеся и дифференцированные клетки RPE [60].

Болезнь Паркинсона (PD) характеризуется глубокой дегенерацией nigrostriatal дофаминовых нейронов (DA) среднего мозга и тяжелыми двигательными симптомами. PD - это прогрессирующее нейродегенеративное заболевание, распространенность которого зависит от возраста; оно преобладает у пожилых людей и редко встречается у молодых взрослых. В Китае общий уровень распространенности PD составляет 1% среди людей старше 50 лет, а среди людей старше 65 лет распространенность составляет 1,7% среди мужчин и 1,6% среди женщин. Распространенность заболевания в развитых странах Запада аналогична китайской. В настоящее время в Китае насчитывается 2,2 миллиона пациентов с PD, что составляет примерно половину от общемирового показателя. Среди пациентов с более ранним возрастом начала заболевания, PD с возрастом начала заболевания до 50 лет была определена как PD с ранним началом (EOPD), в то время как другие определяют PD с возрастом начала заболевания менее 40 лет как PD с молодым началом (YOPD). Как EOPD, так и YOPD встречаются относительно редко. В западных странах распространенность EOPD составляет всего 0,0081‰. В литературе мало эпидемиологических данных о ВЗОМТ, поэтому необходимы дальнейшие исследования [61]. EOPD и YOPD - аутосомно-доминантные PD, которые связаны с участком гена размером 2,5 мб на коротком плече хромосомы 2, но потенциальные мутации не определены, и дефект причинного гена требует дальнейшего изучения. Кроме того, EOPD и YOPD обычно связаны с некоторыми генами, кодирующими некоторые белки, такие как PTEN-индуцируемая предполагаемая киназа 1 (PINK), Паркин и DJ-1, и все это свидетельствует о том, что EOPD/YOPD является редким генетическим заболеванием [62]. Поскольку EOPD/YOPD являются нейродегенеративными заболеваниями, связанными с центральной нервной системой (ЦНС), критическим аспектом лечения является накопление лекарств в очагах поражения головного мозга [63]. Кроме того, мозг является наиболее развитой частью нервной системы и физической основой высшей нейронной активности; в нем эндотелиальные клетки тесно взаимодействуют друг с другом в ЦНС. Мозговой барьер (BBB) формируется из микроглии, нейронов, эндотелиальных перицитов и астроцитов [64]. Эти клетки обладают низкой вазоконстрикторной активностью, располагаются между кровью и ЦНС, образуя ВВВ, который является наиболее избирательным физическим барьером в организме [65]. Он непосредственно взаимодействует с циркулирующей кровью, строго контролируя микросреду клеток мозга. Гидрофильность/гидрофобность, размер молекулы и заряд системы доставки лекарств определяют, сможет ли она пройти через ВВВ [66]. Таким образом, ВВВ, вероятно, будет основным барьером для большинства систем доставки лекарств или генов при заболеваниях ЦНС, включая EOPD/YOPD.

В целом, PD имеет множественную этиологию, включая генетические мутации, факторы окружающей среды, травмы и даже старение. Однако при EOPD и YOPD генетические факторы имеют более высокую нагрузку. Существующие методы лечения PD, включающие нейровосстанавливающие и нейропротекторные препараты (леводопа), которые замедляют прогрессирование PD, также применимы к EOPD и YOPD. Однако имеющиеся клинические методы лечения PD могут только облегчить симптомы, и они имеют побочные эффекты, которые, как правило, усиливаются по мере прогрессирования заболевания. Обычные методы лечения PD в настоящее время направлены на повышение уровня DA, включая заместительную терапию DA. Однако DA, биодоступность которая низкая, а период полураспада в плазме короткий, не может пройти через ВВВ из-за своей гидрофильности. Модифицированная levodopa как предшественник DA может быть транспортирована L-аминокислотами и затем декарбоксилирована в DA для более легкого прохождения через ВВВ. Хотя levodopa может преодолеть некоторые ограничения DA, все больше данных указывают на то, что леводопа также страдает от плохой фармакокинетики, низкой биодоступности (только около 1% препарата достигает целевых участков) и риска тяжелой дискинезии и других системных токсических побочных эффектов [67].

Генотерапия представляется перспективным подходом для лечения EOPD/YOPD, связанных с мутацией генов, а более общие методы генотерапии PD могут быть распространены на EOPD/YOPD В последнем контексте не модифицирующие болезнь генотерапии, включая те, которые направлены на манипулирование с уровнем DA или синтезом GABA, могут облегчить симптомы PD и потенциально обратить вспять прогрессирование заболевания. Несколько нейротрофических факторов показали обнадеживающие результаты в качестве не-модифицирующих болезнь генотерапий в доклинических исследованиях; к ним относятся нейретурин (neurturin), нейротрофический фактор, порождаемый глиальными клетками (GDNF), нейротрофический фактор мозга (BDNF) и фактор роста эндотелия сосудов-A (VEGF-A). Не модифицирующие болезнь методы лечения PD направлены на уменьшение симптомов путем нормализации атипичного функционирования базальных ганглиев. Предполагается, что генотерапия может преодолеть трудности в лечении PD.

В последние несколько десятилетий появились многообещающие методы лечения EOPD и YOPD на основе генотерапии [68]. Для лечения PD использовались как лентивирусы, так и AAV, причем AAV вышел на передний план, поскольку он обеспечивает прямую долгосрочную экспрессию с низким риском интеграции, как обсуждалось ранее. Кроме того, AAV был использован в ряде клинических испытаний для генотерапии PD (табл. 1), но остается проблемой то, что AAV может переносить только менее 5 кб генного материала (рис. 3A) [69]. Несколько групп предложили лечить PD с помощью генов, кодирующих ферменты, связанные с синтезом DA [70]. Другие предложили увеличить экспрессию такого фактора роста, как GDNF, который может повысить выживаемость нейронов [71]. Генотерапия также может вызывать нейромодуляцию, воздействуя на субталамическое ядро. В субталамическом ядре (STN) обычно преобладают глутаматергические нейроны, а glutamate decarboxylase (GAD) может преобразовывать глутамат в GABA; таким образом, увеличение GAD может преобразовывать глутаматергические нейроны в GABAергические и переводить сигналы STN из активированного состояния в подавленное. В этом контексте AAV-опосредованная доставка генов GAD может стать перспективным подходом к индуцированию нейромодуляции для лечения PD [72].



Fig. 3. Gene therapy for PD and strategies to break through the BBB barrier. (A) The gene therapy approaches for PD. Permission from Ref. [69]. (B) A dual-functionalized Pen-Tf liposome for crossing the BBB. (C) Successfully directing GFP expression in primary neuronal cells. Permission from Ref. [77]. (D) FUS combined with brain-penetrating nanoparticles for overcoming the BBB and providing uniform GDNF expression. (E) Improving the motor dysfunction in 6-OHDA-lesioned rats. Permission from Ref. [82].

Исследований по применению невирусных векторов в генотерапии EOPD/YOPD немного, но есть несколько соответствующих исследований для PD. Липидные наночастицы широко исследуются для генотерапии. Например, Lin и др. провели неинвазивную генотерапию PD с помощью липосом/генных комплексов GDNF, вызванную фокусированным ультразвуком [73]. Эта биотинилированная липосома показала отличную эффективность в сопровождении функциональной ДНК к целевым участкам в животной модели PD. Другие исследователи сосредоточились на факторах роста, например, VEGF, при разработке потенциальной генной терапии PD.

Полилизин-модифицированный полиэтиленимин был создан для упаковки гена VEGF в полиплексы, и было обнаружено, что лечение этими полиплексами уменьшает апоптоз или увеличивает активацию микроглии in vivo и in vitro. Это было первое исследование с использованием нового полимерного вектора для доставки плазмиды, кодирующей VEGF, в DA нейроны, и оно дало многообещающие результаты [74].

Во всех описанных выше клинических испытаниях использовалась прямая инъекция различных составов в путамен, что позволяет обойти ВВВ. Однако это инвазивный способ введения, сопряжен с риском. Преодоление BBB под действием носителей генов и прямое накопление генов в мозге выглядит желательным методом, так как это может быть осуществлено дополнительными путями (например, внутривенно) и уменьшить физический дискомфорт/повреждения. Следовательно, разработка эффективных стратегий доставки, направленных на BBB, является жизненно важной частью генотерапии для EOPD/YOPD.

Из связанных с BBB транспортных механизмов, опосредованный транспортными рецепторами эндоцитоз наиболее часто используется для доставки макромолекул в мозг [75]. Из-за большого количества рецепторов трансферрина (TfR) в мозге, трансферрин (Tf) обычно используется для доставки лекарств в мозг и эффективного накопления препарата в мозге; Tf обладает высоким эндоцитарным потенциалом и широко распространяется в эндотелии головного мозга и нейронах [76]. Rodrigues et al. синтезировали липосомы с двойным функционалом пенетратин (Pen)-Tf для пересечения BBB и получили эффективную трансфекцию генов в первичных нейронных клетках. Tf был введен в качестве подхода для нацеливания на BBB и усиления эндоцитоза путем преодоления насыщения рецепторов. Хитозан был использован для предотвращения повреждения ДНК ферментом и улучшения трансфекции генов (рис. 3B). В коре головного мозга и гиппокампе животных в группе липосом Pen-Tf наблюдалось более высокое накопление и трансфекция генов. Кроме того, GFP сильно перекрывался с клетками, положительно окрашенными нейрон-специфическим антителом (рис. 3C). Эти результаты показали, что эта липосома с двойным функционалом может эффективно пересекать ВВВ, обеспечивая превосходное накопление в мозге и способность к трансфекции генов нейронов [77].

Магнитно-резонансный (МР) фокусированный ультразвук (FUS) позволяет неинвазивно открыть BBB для ускорения доставки комплексов в мозг [78,79]. Механическая сила, создаваемая микропузырьками, активированными FUS, временно разрушает плотные соединения стенок кровеносных сосудов, после чего наночастицы размером до 100 нм могут пересечь BBB [80]. И это разрушение полностью восстанавливается в течение 4-6 ч [81]. Некоторые исследователи объединили FUS с наночастицами, проникающими в мозг, чтобы преодолеть BBB и достичь целевой доставки в мозг; эта стратегия обеспечила стабилизированную и последовательную экспрессию GDNF по всему мозгу, предоставляя новые стратегии для генотерапии PD. Плазмида GDNF была перенесена в стриатум крысы с PD с помощью наночастиц, проникающих в мозг, и BBB этих крыс был открыт под воздействием FUS, управляемого МР-изображением (рис. 3D). Было обнаружено, что такое лечение восстанавливает плотность DA нейронов , это улучшает уровень DA и восстанавливает поведенческие способности мышей, моделирующих PD (рис. 3E) [82].

CF, серьезное заболевание легких, вызывается аутосомно-рецессивной моногенной мутацией и в конечном итоге приводит к ранней смерти из-за прогрессирующего повреждения легких. В мире насчитывается около 80 000 пациентов с легочным CF . Причинная мутация обычно обнаруживается в гене, кодирующем муковисцидозный трансмембранный регулятор проводимости (CFTR); он функционирует в основном как канальный белок для двунаправленного транспорта заряженных ионов (например, хлорида) и воды. Внутриклеточный/внеклеточный баланс хлоридов регулирует образование тонкой слизи, которая смазывает внутренние органы, такие как легкие, репродуктивные органы и так далее [83]. Следовательно, аномалия в гене CFTR может привести к серьезному повреждению легких и/или других органов.

Легкие являются наиболее значимой с медицинской точки зрения мишенью легочного CF . Верхние дыхательные пути частично функционируют для того, чтобы не допустить попадания инородных тел в легкие: слизь и респираторные эпителиальные клетки, покрывающие эпителий дыхательных путей, образуют ряд сложных барьеров [84]. Гелеобразующие муциновые волокна в виде компактной сети составляют слой слизи. Эти макромолекулы состоят из гликановых цепей с отрицательным зарядом, которые периодически перемежаются в гидрофобной области; муцины могут связывать вдыхаемые инородные вещества, и механизмы клиренса слизи являются основным подходом для их удаления. Когда инородный материал (например, носитель гена) попадает в легкие CF , он сталкивается с повышенным барьером из-за вызванного окислительным стрессом усиления дисульфидных сшивок между волокнами муцина, которые могут уплотнять расстояние между ячейками слизи [84]. Различные молекулы в слизи (например, растворимые макромолекулы, липиды и белки) также могут нарушить стабильность чужеродного гена в верхних дыхательных путях. Поэтому для защиты экзогенных генов от повреждения в респираторной генной терапии большинство исследователей используют легочные системы доставки.

Исследователи пытались использовать мелкомолекулярные препараты для лечения легочного CF путем регулирования белка CFTR и восстановления транспорта заряженных ионов или путем прямого исправления мутировавшего CFTR на уровне ДНК или РНК. С 2012 года три низкомолекулярных препарата были одобрены Управлением по контролю за продуктами и лекарствами США (FDA) для лечения легочного CF : ивакафтор (торговое название: Kalydeco), люмакафтор/ивакафтор (торговое название: Orkambi) и тезакафтор/ивакафтор (торговое название: Symdeko). Ivacaftor относится к классу препаратов, называемых потенцирующими CFTR, и действует путем замещения функционального белка, уменьшая накопление густой слизи в легких и улучшая другие симптомы легочного C . Orkambi содержит комбинацию ивакафтора и лумакафтора [85], а Symdeko состоит из ивакафтора и тезакафтора для компенсации мутации Phe508del [86]. Однако по-настоящему эффективная стратегия лечения легочного CF должна быть направлена на устранение самой генетической мутации, например, с помощью генотерапии.

С глубоким пониманием патологического механизма улучшения CF и появлением клонирования гена CFTR все чаще звучит призыв к генотерапии, направленной на основные дефекты легочного CF . Первые исследования были направлены на применение AAV в качестве вектора доставки генов при CF . Уже в 1996 году исследователи использовали AAV для переноса кДНК CFTR в эпителий дыхательных путей, что позволило пересмотреть дефицит хлоридного транспорта. Однако потребовалось повторное введение, поскольку оказалось, что генные векторы на основе AAV трудно интегрировать в геном, а клиническому применению AAV для лечения легочного CF препятствовало развитие иммунитета при повторном введении [87]. Консорциум по генотерапии CF Великобритании и японская корпорация DNAVEC предложили использовать лентивирусный вектор, псевдотипированный белками HN и F вируса Сендай, для повышения эффективности трансфекции генов в дыхательных путях без повреждения эпителия. Группа под руководством Parsons and Anson также разработала лентивирусную генотерапию легочного CF [88].

Направленные на лечение легочного CF , описанные выше вирусные векторы потерпели неудачу в основном из-за возникновения иммунного ответа при повторном введении. Лишь немногие (если вообще какие-либо) изученные вирусные агенты для переноса генов могут сохранять свою эффективность при повторных введениях, необходимых для лечения легочного CF . Учитывая это, McLachlan и коллеги попытались исследовать безопасную и эффективную невирусную генную терапию легочного CF [89]. Модельный вид (овца) был выбран из-за сопоставимости анатомии и функции легких овец и человека, что, как надеялись авторы, позволит им лучше предсказать клиническую эффективность коммерческого реагента для трансфекции невирусных генов. Использованный электроположительный липосомальный материал (GL67A) обладал большей способностью к аэрозольной доставке в эпителий дыхательных путей по сравнению с 25 кДа-разветвленным полиэтиленимином (PEI 25K). Важно отметить, что в данном исследовании была минимизирована острая токсичность GL67A и достигнута устойчивая экспрессия CFTR для улучшения клинического потенциала терапии легочного CF при повторном применении. В исследовании фазы 2b, в котором проводилась повторная nebulization невирусная генная терапия пациентов с легочным CF, группа, получавшая ежемесячное введение GL67A-опосредованной терапии, продемонстрировала значительные преимущества (например, стабилизацию функции легких) по сравнению с группой плацебо в течение 1 года [90].

Высокая эффективность нокаута генов и простота конструкции системы CRISPR/Cas9 побудили исследователей изучить возможность ее применения при легочном CF [91]. Адениновые редакторы на основе CRISPR также перспективны для клинического применения, и их редактирование генов не требует двухцепочечных разрывов, которые необходимы в традиционной системе CRISPR/Cas9. Группа исследователей создала биобанк органоидов кишечника больных легочным CF на основе легочных больных CF и применила два вида редактирования адениновых оснований (ABE) под названием SpCas9-ABE (последовательность распознавания PAM: NGG) и xCas9-ABE (последовательность распознавания PAM: NGN) с помощью электропорации для лечения четырех образцов легочного CF . Генетическая коррекция и функциональное восстановление были достигнуты во всех случаях (рис. 4A) [92]. Полученные данные показали, что адениновые редакторы на основе CRISPR безопасны и эффективны для использования в клетках человека. Schwank и соавторы разработали стратегию CPISPR/Cas9 для редактирования мутировавшего участка CFTR (рис. 4B) [93]. Сначала они использовали мышиные антиген-презентирующие клетки (APC) для оптимизации системы CRISPR/Cas9. Трансфекция CRISPR/Cas9 на основе липофектамина, направленная на APC, подтвердила, что CRISPR/Cas9-опосредованное редактирование генов может происходить в стволовых клетках органоидов кишечника пациентов с легочным CF , что позволяет предположить, что в конечном итоге оно может быть использовано для лечения легочного CF .



Fig. 4. Gene therapy for pulmonary CF treatment and overcoming lung gene delivery barriers. (A) [92] and (B) [93] The gene editing strategies for pulmonary CF treatment. (C) Combining guanine with CPs to increase the interaction between the carrier and the mucosal layer, enhance mucus penetration, and improve the efficacy of cellular uptake [99]. (D) Hydrophilic and net-neutral charged peptides for improving mucous membrane penetration [100]. Permissions from Refs. [92,93,99,100].

Помимо липоплексов и физических методов, некоторые новые полиплексы были представлены в качестве средств доставки для генотерапии при легочном CF . Guan и коллеги создали самособирающиеся пептидно-полоксаминовые системы доставки генов для восстановления генома при легочном CF [94]. Используемый пептид, состоящий из трех функциональных молекул, был разработан для формирования однородных и монодисперсных наноструктур с полоксамином и молекулами терапевтических нуклеиновых кислот. Эта стратегия позволила преодолеть низкую эффективность трансфекции полоксамина, которая ранее ограничивала его клиническое применение. Интегрирующий вектор в конечном итоге реализовал долгосрочное восстановление генома легочного CF , еще раз продемонстрировав потенциальную ценность невирусных стратегий доставки генов при редких легочных моногенных заболеваниях.

В целом, стратегии генотерапии, корректирующие CFTR, продолжают появляться на доклинических и клинических стадиях, с целью лечения большего числа пациентов с легочным СА с помощью вирусных или невирусных векторов (Таблица 1) [95].

Помимо традиционной вирусной/ невирусной генотерапии и редактирования генов, все новые стратегии генотерапии были изучены для преодоления специфических легочных барьеров в функциональном генном лечении легочного CF . Существуют две противоречивые стратегии для преодоления барьера слизи. Первая заключается в её разрушении, чтобы лекарство могло более эффективно проникать через слизистый слой [96]. Когда слизистый барьер разрушен, эпителиальные плотные соединения в барьере будут временно разрушены. Это позволит векторам приблизиться к базолатеральной мембране вокруг клеток-мишеней, а в этой области имеются богатые рецепторы и более высокая доля эндоцитоза. Ferrari и др. предложили, что терапевтический ген может быть доставлен в эпителий дыхательных путей с помощью катионных липидов (gl-67 или EDMPC: Chol) или катионных полимеров (PEI), обработанных муколитическим агентом, таким как Nacystelyn, что позволит частично преодолеть mucilage барьер [97]. Однако в различных руководствах нет единого мнения относительно использования муколитических агентов [98], и обычно требуются высокие концентрации, чтобы разрушить или нарушить слизистый слой. Таким образом, разрушение слизистого барьера в легких сопряжено с определенными рисками.

Вторая стратегия преодоления слизистого барьера заключается в увеличении взаимодействия между лекарством и слизистым слоем и, таким образом, увеличении времени пребывания лекарства в слизистой [96]. Ahmed и др. сообщили о методе прямой химической модуляции, они ввели гуанин в конъюгированные полимеры (CPs) (рис. 4C), которые показали хорошую эффективность трансфекции генов в хорошо дифференцированных первичных нормальных клетках бронхиального эпителия человека (NHBE). Авторы исследовали проницаемость гуанина для слизи и пришли к выводу, что регулирование гидрофильно-гидрофобных свойств и заряда экзогенного вещества может критически управлять эффективностью проникновения в слизь при сохранении одинаковой ионной силы комплексообразования [99]. С целью улучшения проникновения через слизистую оболочку Leal и др. недавно определили потенциально полезные гидрофильные и нейтрально заряженные пептидные покрытия путем объединения пептид-представляющих фаговых библиотек и секвенирования следующего поколения (NGS). Проникновение в слизь CF легких человека группы пептидов с покрытием было в 600 раз эффективнее, чем составы без покрытия, и это демонстрировало длительное удержание в слизистой оболочке (рис. 4D) [100]. Эти пептиды могут быть конъюгированы или модифицированы в общей системе доставки генов, чтобы потенциально улучшить поглощение лекарства в CFTR-абнормальном эпителии и тем самым способствовать клиническим исходам легочного CF .

Помимо слизистого слоя, эпителий дыхательных путей содержит гликокаликс, который может связываться с носителями генов и препятствовать их контакту с рецепторами клеточной поверхности [84]. Неэффективная трансфекция генов аденовирусным вектором (AdV) может быть связана с недостатком вирусных рецепторов в эпителиальных клетках [101]. Pickles и др. сообщили, что клетки, обработанные агентами, удаляющими гликокаликс (например, нейроаминидазой), проявляют большую чувствительность к вирусу [102].

SCD - это наследственное заболевание крови, вызванное аутосомно-рецессивной генетической мутацией, приводящей к замене валина на глутаминовую кислоту в β-глобине и образованию гемоглобина S (HbS), который является неполноценной формой гемоглобина [103]. Полимеризация HbS происходит в условиях гипоксической ниши, тем самым нарушая функцию эритроцитов (RBC) и значительно сокращая их продолжительность жизни из-за гемолиза. Патологические мутации вызывают клинические проявления в 4 общих группах: анемия, инфекция, вазоокклюзивные кризы и синдром жировой эмболизации костного мозга, а также дисфункция различных органов. SCD поражает несколько миллионов человек во всем мире; его можно считать относительно серьезным моногенным расстройством, особенно в странах, где отсутствует скрининг новорожденных и эффективная профилактика заболевания [104].

Хроническая трансфузионная терапия, трансплантация гемопоэтических стволовых клеток (HSCT), препараты на основе малых молекул и генотерапия могут обеспечить эффективное лечение SCD. Все эти терапевтические методы рассматривают эритроциты как внутренние мишени и/или нацелены на внешние факторы крови, такие как кровеносные сосуды и тромбоциты. Таким образом, при рассмотрении терапевтической стратегии крайне важно выяснить терапевтические барьеры в крови. Ретикулоэндотелиальная система ( RES) - это клеточная сеть, которая удаляет метаболиты и распознает посторонние вещества в крови. Как правило, после внутривенной инъекции системы генотерапии функциональные гены должны не только избегать RES в процессе циркуляции, но и преодолеть несколько барьеров, чтобы достичь ядра или органелл клеток-мишеней [105]. Хорошая стабильность генов считается необходимым условием для терапевтического применения in vivo, но деградация голых чужеродных генов легко происходит под действием нуклеаз, присутствующих в крови. Хотя модификация нуклеиновых кислот может в определенной степени повысить нуклеазную устойчивость генетической последовательности, модифицированные нуклеиновые кислоты все равно не обладают специфичностью и быстро выводятся из крови [106]. Поэтому исследователи обратились к использованию генных векторов. Большинство используемых наночастиц содержали поликатионы, которые помогали концентрировать отрицательно заряженные нуклеиновые кислоты в частице для доставки [107]. Хотя поликатионы способствуют поглощению клетками, они могут создавать неспецифические взаимодействия с вне-клеточными компонентами, такими как сывороточные белки и компоненты вне-клеточного матрикса, и, таким образом, могут инициировать иммунный или цитотоксический ответ в кровотоке [108]. В целом, кровяные барьеры будут препятствовать работе функциональных генов различными способами, например, обеспечивая короткое время циркуляции, препятствуя неспецифическому связыванию с веществами в крови и поддерживая быстрый клиренс крови.

Установленные методы лечения SCD включают переливание крови и трансплантацию, которые являются основными методами лечения, используемыми для снижения осложнений SCD у пациентов [109]. HSCT дает некоторую надежду на излечение SCD, но родственный подходящий донор обычно доступен только для ~15% пациентов с SCD, а тяжелое отторжение часто ограничивает эффективность HSCT. Кроме того, эти методы не улучшают вазоокклюзивные риски, которые являются обычным осложнением у пациентов с SCD. Использование переливания крови для лечения SCD также сопряжено с определенными рисками, такими как перегрузка железом, анафилаксия, аллоиммунизация и инфекция [110].

Гидроксикарбамид является потенциальным вариантом лекарственной терапии SCD в клинике. Являясь мощным ингибитором рибонуклеотидредуктазы, гидроксикарбамид блокирует синтез и восстановление ДНК, повышает уровень фетального гемоглобина у пациентов с SCD [111] и снижает полимеризацию HbS. К сожалению, гидроксикарбамид может только модулировать тяжесть заболевания; он не может действительно вылечить пациентов с SCD.

Помимо терапевтических стратегий, таких как переливание крови, трансплантация и ингибиторы малых молекул, подавляющие образование тетрамеров гемоглобина, генотерапия направлена на генетическое устранение мутации при SCD. Некоторые исследования показали, что фетальный гемоглобин (HbF, α2γ2) является ключом к сдерживанию внутриклеточной полимеризации HbS, и увеличение генной экспрессии HbF должно стать эффективной стратегией лечения SCD. Действительно, растущее число доказательств свидетельствует о том, что подходы генотерапии могут быть перспективной стратегией лечения SCD в утробе матери [112]. Современные подходы генотерапии для лечения SCD включают гемопоэтическую генотерапию посредством экспрессии гена глобина, точный пересмотр аномального гена SCD путем редактирования генов и генетические средства для улучшения экспрессии HbF [113].

Лентивирусные векторы являются основными кандидатами в генотерапии SCD, поскольку они могут быть интегрированы в геном и демонстрировать постоянную экспрессию генов. Однако было высказано предположение, что подходы к редактированию генов более безопасны, поскольку они исключают возможность полуслучайной интеграции в геном. В настоящее время проводятся некоторые клинические испытания этих двух подходов (табл. 1). Среди испытаний по переносу генов, опосредованных лентивирусами, компания Bluebird Bio спонсировала исследование, в котором оценивалась эффективность опосредованного лентивирусным вектором добавления гена anti-sickling β-глобина (коммерческое название LentiGlobin BB305). Через 15 месяцев после обработки аутологичных гемопоэтических стволовых клеток (HSCs) экспрессия терапевтического белка все еще поддерживалась на высоком уровне (50% от уровня β-подобного глобина), и у пациентов не было никаких признаков повторения серповидно-клеточного криза. Исследования по изучению эффективности LentiGlobin BB305 как при основной β-талассемии, так и при SCD были завершены по состоянию на 10 марта 2020 года [114]. Другие подходы на основе генотерапии для коррекции фенотипа SCD включают попытки индуцировать эндогенный HbF и использование shRNA, нацеленной на BCL11A (один из транскрипционных факторов, участвующих в производстве γ-глобина) в эритроидных клетках, полученных из HSCs, для усиления экспрессии ?γ-глобина и снижения аберрантной продукции βS-глобина (NCT03282656). В совокупности, во всех вышеупомянутых клинических испытаниях использовались лентивирусы в качестве носителей для проведения генотерапии SCD.

Было доказано, что метод на основе CRISPR-Cas9 обеспечивает высокую результативность и стойкость редактирования генов в HSCs, однако нежелательные события разрезов , называемые "эффектами вне мишени", могут нарушать соответствующие функции стволовых клеток и/или вызывать канцерогенность. Поэтому до клинического применения редактирования генома необходимо снизить риск возникновения явлений "вне мишени". Vakulskas и соавторы нашли единственную точечную мутацию в Cas9 (p.R691A), которая значительно уменьшает вне-целевые эффекты, не влияя на высокоуровневое восстановление SCD с помощью редактирования генов на основе CRISPR/Cas9 [115]. Эта стратегия позволила добиться превосходной ревизии аномального SCD-индуцирования в HSCs и их клеток предшественников (HSPCs) при 20-кратном снижении событий вне мишениt по сравнению с обычным Cas9.

Хотя редактирование генома является потенциальным подходом к лечению SCD, остаются заметные проблемы, связанные с разработкой высокоэффективных методов поэтапной трансфекции систем CRISPR-Cas9 в мутировавшие клетки. Так, некоторые исследователи изучили возможность редактирования генов HSCs на основе рибонуклеопротеина (РНП) Cas9/sgRNA без отбора по мишени с помощью электропорации РНП с целью значительного снижения содержания BCL11A и регуляции фетального γ-глобина [116]. Эта стратегия редактирования энхансера BCL11A достигла аллельного повреждения в HSCs, это указывает на то, что она может быть эффективным методом лечения для устойчивой индукции HbF.

Кроме того, Yang и др. разработали схему супрамолекулярного полимера для загрузки генообразующей наночастицы (SMNP), включая адамантан-модифицированный дендример (Ad-PAMAM), β-циклодекстрин (CD)-привитый разветвленный полиэтиленимин (CD-PEI) и адамантан-привитый поли(этиленгликоль) (Ad-PEG) [117]. Для того чтобы решить проблему ограничения доставки SMNP, авторы использовали систему супрамолекулярной наносубстрат-опосредованной доставки (SNSMD), в которой Ad-привитые кремниевые нанопроволочные подложки (Ad-SiNWS) были ключом к клеточному поглощению SMNP. Эта система доставки, названная SMNP/SNSMD, позволила осуществить CRISPR-Cas9-опосредованный knock-in гена HBB [118]. Измененные геном клетки были пересажены мышам, и жизнеспособность клеток была подтверждена in vivo. Это исследование позволило по-новому взглянуть на общие и клинические решения генотерапии для лечения гемоглобинопатий, включая SCD, с невирусной точки зрения.

Хотя некоторые носители генов (например, лентивирусы) в определенной степени позволяют нуклеиновым кислотам избегать барьеров, связанных с кровью, эти комплексы вектор/ген не обладают достаточной специфичностью и легко выводятся из организма после внутривенного введения [106]. Чтобы продлить циркуляцию, уменьшить неспецифические взаимодействия, решить проблемы иммуногенности и другие вопросы, исследователи изучили различные материалы и модификации для облегчения доставки генов SCD [119].

PEG - широко используемый полимер с долгой историей применения в различных терапевтических стратегиях, включая генотерапию [119]. Cai и др. объединили PEG с имидазол-модифицированным полилизином для повышения стабильности наночастиц и продления времени их циркуляции в крови [120]. Хотя PEG-илирование является безопасным и распространенным методом, позволяющим избежать негативного влияния крови, однократная доза PEG-илированных полимеров вызовет выработку PEG-специфических антител, которые повлияют на последующие терапевтические эффекты. Таким образом, исследователи изучили потенциальные альтернативы PEG, такие как поли(N-(2-гидроксипропил) метакриламид) (HPMA), поли(глицерин) (PG) и так далее [121].

Помимо улучшения времени циркуляции крови, исследователям необходимо было решить проблему иммуногенных реакций крови в контексте лечения SCD. Вирусные векторы представляют собой наиболее распространенный тип векторов в генной терапии SCD. AAV, который считается привлекательным вектором для генной терапии SCD, содержит три основных капсидных белка (гексон, основание пентона и белок волокна), которые склонны вызывать иммуногенные реакции или нейтрализацию [122]. Чтобы избежать этой проблемы, Wagner и др. создали амфифильные полифениленовые дендримеры (PPD), которые служили биораспознающими участками при связывании с аденовирусом 5 (Ad5) (рис. 5A). Фактор коагуляции X (FX) обычно способен идентифицировать Ad5 в сыворотке, но это взаимодействие было заблокировано путем декорирования белков вирусного капсида амфифильными PPDs [123]. Это исследование позволило создать новую платформу, позволяющую вирусам избегать барьеров, связанных с кровью. В других исследованиях ученые разрабатывали полимеры с топографией поверхности, имитирующей вирусы, которые могли помочь носителю избежать иммуногенного ответа или нейтрализации. Например, Cai и др. разработали биоредуцируемые фторированные пептидные дендримеры (BFPDs), в которых вирусоподобные структуры были получены путем обратимого сшивания между пептидными дендримерами и фторированными группами (рис. 5B). Сообщалось, что BFPD эффективно противостоят взаимодействию с белками крови и не вызывают иммунного ответа [124].



Fig. 5. Strategies for avoiding obstacles to gene delivery in intravenous injection. (A) PPDs used to modify adenovirus 5 (Ad5) for avoiding the interaction with coagulation FX which normally binds to Ad5 in serum [123]. (B) Polymers used to engineer an inactive or virus-mimicking surface topography to effectively resist blood protein interactions [124]. Permission from Refs. [123,124].

Как упоминалось ранее, невирусные носители для доставки генов обычно включают катионные комплексы, поскольку положительный заряд способствует поглощению клетками и конденсации отрицательно заряженных нуклеиновых кислот [125]. Однако катионные полимеры также склонны к неспецифическому взаимодействию с внеклеточными компонентами крови (такими как белки сыворотки), что приводит к цитотоксичности. Для решения этой проблемы некоторые исследовательские группы применяли катионные соединения, украшенные различными способами. Kumari и др. использовали бычий сывороточный альбумин (BSA) для модификации олигохитозана, чтобы избежать неспецифического связывания в крови [126]. BSA часто включают в векторы доставки генов для защиты ДНК от сывороточных нуклеаз, что позволяет избежать неблагоприятных реакций in vivo.

Митохондрии являются важнейшими субклеточными органеллами, которые используют разнообразные метаболические пути для функционирования в качестве центра производства энергии и роста клеток [127]. Митохондриальные ДНК и РНК играют важнейшую роль в развитии многочисленных редких заболеваний. В клетках млекопитающих одна митохондрия содержит тысячи копий мтДНК. Нормальные и мутировавшие митохондрии могут сосуществовать в больных клетках, и доля мутировавшей мтДНК по отношению к мтДНК дикого типа указывает на тяжесть заболевания. Низкое соотношение мутировавшей мтДНК к нормальной мтДНК обеспечивает нормальный фенотип; наоборот, когда доля мутировавшей мтДНК в клетках превышает пороговое значение, возникают клинические проявления митохондриальных одногенных редких заболеваний. Аномалии мтДНК связаны с различными редкими моногенными заболеваниями, включая болезни сетчатки, системные заболевания и другие.

Хотя многие редкие заболевания были зарегистрированы как нарушения митохондриальных генов, для лечения редких заболеваний, связанных с митохондриальными барьерами, доступно мало митохондриальной генотерапии in situ. Необходимо продолжать исследования, чтобы создать системы доставки генов для селективного переноса генов в митохондриальный матрикс для лечения редких заболеваний.

Синдром MELAS, который является полиорганным заболеванием, часто сопровождается малым ростом, повторяющимися головными болями, эпилепсией, инсультоподобными эпизодами, нарушением слуха и так далее [128]. Клинические особенности миоклонической эпилепсии с синдромом MERRF включают миопатию, миоклонус, атаксию и эпилепсию [129]. Эти изнурительные заболевания, возникшие в результате преобладания патогенных вариантов мтДНК, передаются преимущественно по материнской линии и были идентифицированы как мультисистемные митохондриальные заболевания. У большинства людей с диагнозом синдром MELAS причинная мутация происходит в гене MT TL1, и мутация m.3243A < G на нем вызывает проблемы с кодоном tRNALeu(UUR) [130]. Прогрессирование MERRF связано с 4 сайтами мутации, наиболее частым из которых является переход от A к G на нуклеотиде 8344 на мтДНК [131].

Мутировавшие митохондрии обнаруживаются в клетках всего организма пациентов с MELAS и MERRF. Доставка терапевтических генов или лекарств в митохондрии является сложной задачей, учитывая двухслойную структуру митохондриальной мембраны, которая состоит из пористой внешней митохондриальной мембраны (OMM) и плотно упакованной гидрофобной внутренней митохондриальной мембраны (IMM) [132]. Мембраны митохондрий также имеют высокие митохондриальные мембранные потенциалы (MMP) - отрицательные 180-200 СА (внутри относительно наружной), измеренные in vitro, и отрицательные 130-150 СА в живых клетках [133]. Эти факторы жестко ограничивают доступ экзогенных ионов и молекул в межмембранное пространство. Митохондриальные барьеры ограничивают разработку терапии редких моногенных заболеваний, связанных с мутациями мтДНК, таких как синдромы MELAS и MERRF.

Эффективных методов лечения этих заболеваний не существует. Имеющиеся клинические методы лечения в основном направлены на устранение сопутствующих симптомов или восстановление функции митохондриальной дыхательной цепи. Например, терапия L-аргинином и цитруллином полезна для предотвращения инсультоподобных эпизодов, возникающих при MELAS [134]. Применение коэнзима Q10 (CoQ10), направленное на устранение мышечной слабости и усталости у пациентов с синдромом MELAS, было обнаружено в некоторых исследованиях [135]. Леветирацетам, топирамат, зонисамид, пирацетам и бензодиазепины, все из которых являются противоэпилептическими препаратами, часто используются для лечения миоклонуса и эпилепсии, вызванных синдромом MERRF [136]. Эти симптоматические методы лечения могут облегчить отмеченные симптомы, но они не влияют на другие осложнения, вызванные заболеваниями. Важно найти способ фундаментального устранения лежащих в основе заболевания генетических мутаций.

Генотерапия развивается быстрыми темпами, но большинство таких исследований сосредоточено на распространенных заболеваниях с большим количеством пациентов и широкой аудиторией. Редким заболеваниям, таким как MERRF и MELAS, уделяется относительно мало внимания.

Хотя лишь немногие исследования пытались разработать стратегии генотерапии для синдромов MERRF и MELAS, редактирование митохондриальных генов, исправляющее патогенные мутации мтДНК, может стать доступной стратегией лечения синдромов MERRF и MELAS. В то время как система CPISPR/Cas9 имеет преимущества для устранения мутаций в ядерной ДНК, она слишком велика для проникновения в митохондриальный матрикс. Вместо этого для редактирования митохондриальных генов, по-видимому, более применимы традиционные подходы к редактированию генов. Некоторые группы, соответственно, использовали AAV для доставки белков с цинковым пальчиками и митохондриально-нацеленных активаторов транскрипции, подобных эффекторным нуклеазам (mitoTALENs), в митохондрии и добились изменения фенотипов, связанных с болезнью, в мышиных моделях [137,138]. Mok и др. описали межбактериальный токсин DddA, катализирующий дезаминирование цитидинов в dsDNA. Авторы объединили отдельные части DddA, белки массива эффекторных белков, подобных активатору транскрипции, и ингибитор урациловой гликозилазы, чтобы создать свободный от РНК DddA-редактор цитозиновых оснований (DdCBE), который мог катализировать точно мишень и при водить к высоким преобразованиям C-G в T-A в мтДНК человека. Применение DdCBE позволило точно манипулировать мтДНК и, таким образом, открыло широкие перспективы для лечения митохондриальных заболеваний [139]. Эти новые стратегии предполагают новые направления для лечения MERRF и MELAS.

В отсутствие прямых исследований митохондриальной генотерапии при синдромах MELAS и MERRF полезно рассмотреть многочисленные стратегии доставки генов в митохондрии [140]. В некоторых исследованиях использовались физические подходы для прямой доставки генетического материала в митохондрии, но было установлено, что это вызывает слишком сильное повреждение клеток-мишеней. Затем были использованы химические или биологические подходы для реализации доставки генов в митохондрии благодаря высокой гидрофобности, а также мощной отрицательной MMP из IMM [141]. Обычно используемые митохондрии-мишени включают нелокализованную группу с чистым положительным зарядом, например, соединения малых молекул [трифенилфосфин (TPP) и деквалиний (DQA)] и проникающие в митохондрии пептиды [например, MP-пептиды (MPPs), mitochondrial-targeting sequence (MTS) и пептиды Szeto-Schiller (SS)] [142]. TPP обладает как положительными, так и гидрофобными свойствами и часто используется для нацеливания на митохондрии. Наша группа использовала его для создания сополимера, нацеленного на митохондрии, для эффективной совместной доставки siRNA и лекарства [143].

Кроме того, разрабатываются невирусные генные векторы для лечения митохондриальных моногенных заболеваний. Yamada и др. разработали комплекс под названием MITO-Porter для доставки биомакромолекул генотерапии в митохондрии через слияние мембран. Авторы отобрали различные липидные композиции для MITO-Porter и провели модификацию поверхности окта-аргинином для точного нацеливания на митохондрии (рис. 6А) [144]. Несколько лет спустя та же группа представила вектор pCMV-mtLuc, который содержал промотор CMV и люциферазу NanoLuc (Nluc). В данной работе использовавшийся ранее окта-аргинин был заменен на KALA-пептиды для создания KALA-MITO-портера. Комбинация KALA и слияния мембран обеспечила превосходное поглощение митохондриями фибробластов G625A, полученных от пациентов с митохондриальным моногенным заболеванием (рис. 6B) [145]. Невирусная векторная митохондриальная генотерапия, разработанная группой Yamada, может оказаться перспективной для лечения различных митохондриальных моногенных заболеваний, включая синдромы MELAS и MERRF.



Fig. 65. Strategies for overcoming mitochondrial barriers and realizing in situ mitochondrial gene therapy for single gene rare diseases with mitochondrial gene mutation. (A) A liposomal vector called MITO-Porter for transferring genetic macromolecular cargo to the mitochondrial interior through membrane fusion. Permission from Ref. [144]. (B) KALA-MITO-Porter for superior mitochondrial targeting and gene transfection in G625A fibroblasts from patient with mitochondrial monogenic disorder. Permission from Ref. [145]. (C) Naked DNA plasmid containing the mitochondrial HSP for mitochondrial gene therapy. Permission from Ref. [154]. (D) Dual-domain peptides with superior biocompatibility for mitochondria-specific gene delivery in a human cell line. Permission from Ref. [155].

LHON, слепота, как было указано, вызвана мутацией митохондриального генома (мтДНК) [146]. Хорошо известно, что слепота молодых людей создает проблемы для семьи и общества. Более 95% случаев LHON, являются результатом аномалии в одной из трех кодируемых мтДНК субъединиц комплекса I, который расположен в митохондриальной дыхательной цепи. У 90% пациентов с LHON, в Китае наблюдается замена гистидина на аргинин в субъединице 4 (ND4) убихинон-оксидоредуктазы (NADH) комплекса I; это происходит в позиции 11778 мтДНК, в которой происходит гомоплазматический переход гуанозина в аденозиновый нуклеотид [147]. Из остальных пациентов с LHON примерно 10% имеют мутации 14484T > C и 14484T > C в мтДНК [148]. вэж Хотя аномалии митохондриальных геномов носят системный характер, глаз особенно восприимчив, поскольку имеет высокую потребность в энергии. Восстановление митохондриальной активности в ганглиозных клетках сетчатки является ключевым вопросом в терапии LHON. В отличие от LCA, клетки-мишени сетчатки при LHON - это ганглиозные клетки сетчатки, которые расположены на поверхности сетчатки. Поэтому основным глазным барьером является стекловидное тело [149].

Стекловидное тело делится на две зоны: медуллярное стекловидное тело и периферическую зону (также называемую кортикальным стекловидным телом). Медуллярное стекловидное тело окружено кортикальным стекловидным телом, которое состоит из более уплотненного и фибриллярного типа стекловидного тела. Хотя кортикальное стекловидное тело составляет лишь небольшую часть (всего 2%) от общего объема стекловидного тела, оно содержит гиалоциты и имеет решающее значение для метаболизма стекловидного тела. Фиброциты, которые являются важными компонентами соответствующих соединительных тканей, расположены в кортикальном стекловидном теле. Медуллярное стекловидное тело представляет собой бесклеточную смесь коллагенов и НА, которая существует в гелеобразном или жидком состоянии [150]. Поэтому предпосылкой для осуществления доставки биомакромолекул при LHON является то, что состав должен оставаться подвижным после интравитреальной инъекции, чтобы достичь клеток-мишеней в сетчатке.

Идебенон (idebenone ) - единственный препарат, одобренный в настоящее время для лечения LHON. Считается, что этот антиоксидант переносит электроны непосредственно на комплекс III и минует комплекс I для восстановления баланса ROS и нормализации выработки клеточной энергии [151]. Однако он лишь облегчает симптомы LHON, а не излечивает генетическую мутацию. Генотерапия бесспорно полезна для лечения дефектов одного гена, таких как LHON [152]. Учитывая, что препарат Luxturna уже был представлен на рынке для лечения пациентов с LCA[13], кажется весьма вероятным, что LHON может быть вылечен с помощью глазной генотерапии.