Генетические заболевания кожи, также известные как генодерматозы, - это наследственные заболевания, поражающие кожу. Они представляют собой большую и гетерогенную группу заболеваний. Исследования показали, что мутации в более чем 500 уникальных генах могут вызывать заболевания с выраженным измененным фенотипом кожи.¹ В настоящее время лечение генодерматозов обычно ограничивается снятием симптомов.^{2, 3} С развитием молекулярных технологий было охарактеризовано большое количество наследственных заболеваний кожи, что открывает путь для разработки генотерапии серьезных, разрушительных и иногда опасных для жизни генодерматозов. Устраняя первопричину генетических кожных заболеваний, генотерапия открывает перспективу долговременного терапевтического вмешательства.

Аллогенная клеточная терапия проводилась для пациентов с тяжелыми генетическими заболеваниями кожи. При такой терапии клетки костного мозга (BMCs), мезенхимные стромальные клетки (MSCs) или соматические эпидермальные фибробласты от здоровых доноров пересаживались пациентам внутривенно или подкожно.^4-8 Эти методы терапии обеспечивали клинические преимущества, но совпадение антигенов лейкоцитов человека (HLA) доноров и пациентов всегда было сложной задачей. Иммуносупрессивное пре-кондиционирование должно использоваться в аллогенной клеточной терапии костного мозга для предотвращения болезни "трансплантат против хозяина" (GVHD), смертельного осложнения аллогенной трансплантации костного мозга, когда генетически несопоставимые клетки хозяина атакуются иммунокомпетентными Т-клетками донора.⁹ Кроме того, исследования заболевания дистрофического эпидермолиза буллезной формы показали, что после трансплантации аллогенных BMCs или MSCs можно было обнаружить только дисфункциональный белок коллагена VII типа (С7), секретируемый эпителиальными клетками пациентов, что позволяет предположить, что краткосрочное клиническое улучшение после трансплантации BMCs или MSCs скорее всего связано с противовоспалительным свойством этих клеток.^{4, 6, 7} По сравнению с аллогенной генотерапией, аутологичная генная модификация ex vivo, когда клетки пациента генетически модифицируются in vitro, а затем трансплантируются или вводятся обратно пациентам, преодолевает недостатки, наблюдаемые при аллогенной клеточной терапии, и стала излюбленной стратегией генотерапии при генодерматозах, особенно при заболеваниях с тяжелой потерей эпидермиса, таких как буллезный эпидермолиз (Junctional epidermolysis bullosa, JEB) и рецессивный дистрофический буллезный эпидермолиз (Recessive dystrophic epidermolysis bullosa, RDEB).

Местная доставка или внутривенное/внутридермальное введение терапевтических векторов непосредственно в кожу или организм пациента, известное как генотерапия in vivo, стало еще одной привлекательной терапевтической стратегией для лечения генодерматозов. Эта стратегия больше подходит для тех кожных заболеваний с поражением кожи, охватывающим все тело, при которых местные пересадки кожи и инъекции имеют свои ограничения. Было разработано несколько топических методов генотерапии с использованием модифицированного вируса простого герпеса (HSV), несущего гены дикого типа, такие как COL7A1 для RDEB или трансглутаминаза 1 (TGM1) для аутосомно-рецессивного врожденного ихтиоза^{10, 1}1 Результаты 1 фазы in vivo генотерапии с местной доставкой были многообещающими и обнадеживающими, хотя экспрессия терапевтических генов в коже/клетках хозяина была преходящей из-за не-интегрирующей особенности вируса простого герпеса, и требуется многократное введение терапевтического вектора в этой генотерапии in vivo. Кроме того, при местной доставке векторов трудно нацелиться на стволовые клетки кератиноцитов (KSCs), поскольку эти клетки рассеяны в самом нижнем слое эпидермиса. Без воздействия на долгоживущие стволовые клетки длительность терапевтического эффекта ограничена. Существует мало сообщений об исследованиях генотерапии in vivo с использованием внутривенной доставки при генодерматозах, поскольку необходимы обширные исследования, чтобы продемонстрировать риск и безопасность, связанные с прохождением векторов через систему циркуляции, и эффективность приживления терапевтических векторов в коже.

Кожа является привлекательной мишенью для генотерапии. Эпидермис можно легко собрать и манипулировать им ex vivo, а эффект терапии можно легко контролировать. Достижения в технике культивирования позволили культивировать кератиноциты, включая KSCs или голоклоны, in vitro.^12-14 Можно создавать листы эпителия, которые в течение более чем трех десятилетий использовались в качестве аутотрансплантатов у пациентов с тяжелыми ожогами.¹⁵ Все это привело к разработке ex vivo генно-модифицированной эпидермальной листовой терапии генодерматозов. Первый ex vivo ген-модифицированный эпидермальный лист для лечения JEB был получен в 2006 году после ретровирусной трансдукции KSCs.¹⁶ Это эпохальное исследование предоставило важные доказательства того, что коррекция стволовых клеток кожи может обеспечить эффективную терапию генодерматозов. С тех пор был проведен ряд ex vivo ген-модифицированных терапий с помощью эпидермальных листов. Самым примечательным из них была спасительная терапия эпидермальным слоем для пациента с JEB с полной потерей эпидермиса на 80% поверхности тела.¹⁴ Недавно также сообщалось об I фазе ген-модифицированной терапии эпидермальным листом при RDEB и Netherton syndrome (NS), которая показала восстановление экспрессии и функций трансгенов в определенной степени^{17, 18} (Таблица 1).



TABLE 1. Ex vivo epidermal sheet graft therapies discussed in this review.

Успех терапии ex vivo генетически модифицированного эпидермального листа зависит от эффективной модификации генов в KSCs пациентов, что позволяет обеспечить длительную экспрессию трансгенов в трансплантированном эпидермальном листе, созданном с использованием гетерогенных популяций кератиноцитов, включая KSCs. Таким образом, при разработке ex vivo генетически модифицированной терапии эпидермального листа существует две проблемы: коррекция мутантных генов в первичных кератиноцитах, полученных от пациентов, и сохранение стволовых KSCs в эпидермальном листе после генной модификации и культуры слоя. Было разработано несколько стратегий модификации генов. Они включают (i) добавление гена дикого типа в клетки пациентов с рецессивными мутациями^{14, 16-18}; (ii) введение антисмысловых олигонуклеотидов или малых интерферирующих РНК в клетки/ткани пациентов с доминантной мутацией для подавления мутантных аллелей^19-21; и (iii) редактирование геномной ДНК в клетках пациентов с использованием недавно разработанных наборов инструментов для редактирования генома, таких как активатор транскрипции, подобный эффекторным нуклеазам (TALENs), кластерные регулярно интерферирующие короткие палиндромные повторы (CRISPR) и CRISPR-ассоциированный белок 9 (CRISPR/Cas9), программируемое редактирование оснований и редактирование праймеров. ^22-29 После генной модификации следующим важным шагом для успешной генотерапии ex vivo является введение или доставка генетически модифицированных клеток пациентам. Общепринятым подходом к этому является пересадка эпидермальных листов, созданных с использованием генетически модифицированных кератиноцитов пациентов. Для этого требуется первичная культура кератиноцитов in vitro для расширения клеток, включая KSCs, а затем выращивание этих клеток в виде эпидермальных листов. Для культивирования первичных кератиноцитов использовалось несколько систем культивирования, но традиционная система культивирования, разработанная Рейнвальдом и Грином, является единственной, которая подтвердила сохранение популяции KSCs для достижения долгосрочного приживления трансплантата с длительной экспрессией трансгенов.^{14, 30}

Добавление экзогенного гена дикого типа в клетки пациентов для замены мутантного/дефектного эндогенного гена и восстановления функциональной экспрессии гена является распространенной стратегией генной модификации при рецессивных генетических заболеваниях кожи. Векторы, которые доставляют гены дикого типа в кератиноциты и фибробласты пациентов, обычно представляют собой ретро- и лентивирусные векторы.³¹ Оба вектора имеют емкость упаковки трансгенов ~8 кб и способны стабильно интегрировать трансгены в геном хозяина.¹⁶ Ретро- и лентивирусные векторы также могут трансдуцировать трудно трансдуцируемые клетки, такие как кератиноциты, с высокой эффективностью трансдукции и использовались в испытаниях I/II фазы генной терапии.³¹ Несмотря на успех, терапия с добавлением генов имеет свои ограничения, не в последнюю очередь нерегулируемая экспрессия генов и эктопические места вставки генов. Кроме того, в некоторых случаях эффективность переноса трансгенов была затруднена, если ген, вызывающий заболевание, был большим. Например, мутации в гене COL7A1, вызывающем RDEB, имеют размер более 9 кб, что превышает емкость упаковки ретро- и лентивирусных векторов, это приводит к низкому титру вирусов и эффективности трансдукции³².

Поэтому редактирование генома, направленное на прямое исправление мутаций на геномном уровне, является более мощным методом. В первые годы для исправления мутаций в COL7A1 в кератиноцитах использовались такие инструменты редактирования генома, как нуклеазы Zinc-finger и TALENs.^{25, 26, 33, 34} Однако эти технологии нелегко прижились из-за сложного дизайна, предполагающего белковую инженерию для каждого целевого гена, или низкой эффективности редактирования в определенных клетках или типах тканей.³⁵ Недавнее развитие технологии CRISPR/Cas9 произвело революцию в подходе к модификации генов, открыв новую эру в редактировании генома, поскольку она представляет собой простой, дешевый и универсальный механизм редактирования для коррекции генов. CRISPR основывается на активности ДНК-нуклеазы Cas9, которая может быть привлечена к целевой последовательности ДНК коротким фрагментом РНК, известным как направляющая РНК (gRNA). Мотив соотв. протоспейсера (PAM), который должен примыкать к целевой последовательности ДНК, необходим для связывания Cas9 для осуществления функции расщепления ДНК.³⁶ После расщепления ДНК запускаются клеточные механизмы репарации ДНК для устранения индуцированного Cas9 двунитевого разрыва ДНК (DSB). Наиболее распространенным механизмом репарации является негомологичное соединение концов (NHEJ), при котором разорванные концы ДНК соединяются вместе без учета гомологии. NHEJ вызывает инсерции или делеции (indels) нуклеотидов, которые могут вызвать сдвиг рамки считывания/преждевременные терминирующие кодоны на сайтах целевых генов, что приводит к нарушению работы генов и нокауту, и эта стратегия редактирования генома широко используется для создания моделей заболеваний с нокаутом генов.

Напротив, когда предоставляется шаблон ДНК, имеющий высокую степень гомологии с целевой последовательностью, задействуется путь гомологически-направленной репарации (HDR), что приводит к точным генетическим модификациям. Этот подход к редактированию генома с использованием CRISPR/Cas9 опосредованной HDR был экспериментально использован для коррекции мутантных генов в кератиноцитах и фибробластах пациентов с генодерматозами. Например, при использовании стратегии двойной sgRNA CRISPR/Cas9 для делеции экзона 80 COL7A1 в кератиноцитах RDEB, гомозиготных носителей мутации c.6527insC, была восстановлена экспрессия белка C7.23 Исследования также показали коррекцию мутации сайта сплайсинга (c.425 A > G) в экзоне 3 или нулевой мутации в экзоне 2 (c.189delG) COL7A1 с помощью CRISPR/Cas9 опосредованного HDR подхода с восстановлением экспрессии белка C7 и формированием якорных фибрилл.^{24, 25} Однако было замечено, что эффективность CRISPR/Cas9 опосредованного HDR была низкой около 11 - 15%, и это ограничивает возможности CRISPR/Cas9 опосредованного HDR редактирования генома для клинического применения.²⁴ Помимо низкой эффективности редактирования, HDR события часто превосходят NHEJ, что создает очень сложные условия для встраивания донорского шаблона и точного редактирования генома. Кроме того, беспорядочная активность Cas9 может вызывать случайные DSBs в неспецифических сайтах (вне мишеней), неожиданные NHEJ в сайтах вне мишеней и индуцировать пути p53 и апоптоза.^{37, 38} Все это требует дальнейшего усовершенствования традиционной технологии CRISPR/Cas9.

Недавно был разработан подход программируемого редактирования одного основания (BE).³⁹ Он позволяет точно, необратимо деаминировать один нуклеотид в другой программируемым образом, устраняя необходимость в двунитевом разрыве ДНК и в HDR, используемых в традиционном редактировании генома CRISPR/Cas9. В инструментарии BE с версиями 3 и 4 обычная эндонуклеаза Cas9 была мутирована в точках D10A и H840A, которые являются двумя важными остатками для активности эндонуклеазы. Эти изменения в конечном итоге привели к каталитической деактивации Cas9, известной как мертвая Cas9 (dCas9) или Cas9 nickase. Эндонуклеаза dCas9, связанная с ферментом цитидиндеаминазой и элементом uracil DNA-glycosylase (UGI), позволяет преобразовывать C > G в T > A путем деаминирования.⁴⁰ Также были разработаны редакторы адениновых оснований (ABE), которые могут преобразовывать A > T в G > C. В этой платформе редактирования фермент аполипопротеина B мРНК редактирования фермент каталитический субъединица 1 (APOBEC1) в наборе инструментов BE был заменен на фермент аденозиндеаминазы трансферной РНК (TadA).⁴¹ Таким образом, сочетание систем редактирования генов BE3/4 и ABE может потенциально опосредовать все четыре нуклеотидных перехода (C > T, A > G, T > C и G > A). Исследования показали, что программируемое редактирование оснований обеспечивает более высокую эффективность редактирования генома, чем традиционный CRISPR/Cas9-HDR (15?75% против 0,1?5%) при гораздо меньшей частоте нецелевого воздействия (<5% для BE и ~1% для ABE).^{42, 43} Разработка новых версий ABE, включая ABEmax, miniABEmax и ABE8e, а также библиотеки ABE8 еще больше повысила эффективность редактирования генома.^{39, 44-46} Кроме того, обеднение мРНК ABE уридином в сочетании с модификацией оставшегося уридина до 5-метоксиуридина стабилизирует транскрипт мРНК ABE, увеличивая экспрессию dCas9 и снижая иммунные реакции.⁴⁷ Все это позволяет более точно редактировать основания. В платформе CRISPR/Cas9 для редактирования генома каноническая PAM-последовательность NGG, прилегающая к последовательности целевой ДНК, необходима для связывания Cas9. Однако каноническая PAM-последовательность не всегда доступна на участке, прилегающем к целевой последовательности ДНК, и это ограничивает использование инструментария для редактирования оснований. Недавно Hu и др. изменили конфигурацию Cas9 на xCas9 для расширения совместимости с PAM, и исследования показали, что xCas9 может распознавать набор разнообразных последовательностей PAM.⁴⁸ Эти новые версии и модификации ABE и Cas 9 создают лучшую платформу для редактирования оснований при генетических заболеваниях с различными генными мутациями и расположением генов.

Osborn et al. провели исследование редактирования оснований ABE в фибробластах пациента с кожным заболеванием RDEB. Эти фибробласты несли мутации c.553C>T (R185X) и c.1573 C > T (R525X) в гене COL7A1. Восстановление экспрессии эндогенного C7 было обнаружено после редактирования оснований ABE. Эффективность коррекции составила 24% и 45% для мутации c.553C>T и 8% и 17% для мутации c.1573 C > T, что было подтверждено секвенированием ДНК и экспрессией мРНК, соответственно.²⁹ Эта эффективность была намного выше, чем у обычного CRISPR/Cas9. Тем не менее, редактирование оснований также имеет свои ограничения. Например, оно не способно исправлять мутации indels; оно требует последовательности PAM, прилегающей к целевой ДНК, которая не всегда доступна; и оно беспорядочно редактирует побочные основания, когда более одного нуклеотида C или A находятся в окне редактирования, вызывая потенциальные миссенс-мутации и нарушение работы генов.⁴⁹

Редактирование праймеров обходит недостатки обычного CRISPR/Cas9 и программируемого редактирования оснований, используя эндонуклеазу dCas9, слитую с преобразованной обратной транскриптазой, запрограммированной направляющей РНК prime editing guide RNA (pegRNA), которая определяет целевой сайт и кодирует желаемое редактирование.⁴⁹ Сообщалось, что платформа может вставлять до 44 пар оснований (п.о.) или удалять до 80 п.о. нуклеотидов и исправлять точечные мутации, включая трансверсии. Она также может выполнять комбинированные правки без создания явных DSBs ДНК. Исходя из этого, было предсказано, что прайм-редактирование может исправить до ~89% вариантов генов человека. Исправление с помощью правок вставки или трансверсии с путем прайм-редактирования было протестировано на трех линиях клеток человека, включая K562, U2OS и Hela, и эффективность редактирования в этих типах клеток составила от 12% до 30% при низком уровне undels 0,13-2,2%. Хотя коррекция, по-видимому, зависит от типа клеток, в целом эффективность коррекции была аналогичной или выше по сравнению с редактированием генома HDR, опосредованным CRISPR/Cas9, с гораздо меньшей частотой вне-целевого воздействия.⁴⁹ Поскольку прайм-редактирование является недавно разработанной технологией, необходимы дальнейшие испытания на различных типах клеток для определения эффективности редактирования и вне-целевого воздействия, особенно на трудно трансформируемых клетках, таких как кератиноциты. В настоящее время нет данных о применении прайм-редактирования в кератиноцитах.

Распространенными подходами к доставке инструментария для редактирования генома в кератиноциты или фибробласты пациентов являются вирусные векторы и электропорация. В одном из исследований была показана коррекция мутаций в LAMB3 путем доставки Cas9/sgRNA и шаблона гомологичной репарации в кератиноциты с помощью аденовирусного вектора и дефектного по интеграции лентивирусного вектора. Однако эффективность коррекции генов составила менее 0,5%.⁵⁰ Также сообщалось о коррекции мутаций в COL7A1 путем доставки sgRNA/Cas9 и шаблона гомологичной репарации в кератиноциты и фибробласты с использованием дефектных лентивирусных векторов, при этом эффективность редактирования генов составила 11% для кератиноцитов и 15,7% для фибробластов.²⁴ Причиной низкой эффективности доставки вирусного вектора может быть то, что размеры компонентов генного редактирования gRNA, кДНК Cas9 и ремонтного шаблона слишком велики, чтобы их можно было вместить в один вирусный вектор, и для редактирования генов приходится использовать несколько вирусных векторов, что приводит к снижению эффективности доставки⁵¹.

Электропорация с реагентом для нуклеофекции широко используется для доставки наборов инструментов для редактирования генома в клетки, чтобы преодолеть необходимость использования нескольких векторов и снизить риск генотоксичности. Исследование на клетках пациентов с RDEB показало успешную доставку двухцепочечного шаблона ДНК-донора вместе с sgRNA и белком Cas9 (комплекс RNP) в фибробласты с помощью электропорации с эффективностью доставки 33%.⁵² Другие исследования на пациентах с RDEB или клетках-донорах также показали высокую эффективность генного редактирования (70-85%) комплекса RNP для генного редактирования в кератиноцитах с помощью электропорации. Они также показали, что электропорация кератиноцитов может быть использована для создания эпидермального листа и трансплантации на модели пересадки кожи человек:мышь для формирования гуманизированной архитектуры кожи, что свидетельствует о сохранении стволовости в первичных кератиноцитах после электропорации.^{22, 53} Это также было подтверждено другим исследованием, в котором экспрессия интегринов β1, одного из маркеров KSC's , не изменилась в первичных кератиноцитах после электропорации.⁵⁴ Все это указывает на то, что электропорация может быть надежным и осуществимым подходом для доставки инструментария редактирования генома в кератиноциты пациентов с более высокой эффективностью доставки и сохранением стволовости KSC's . Тем не менее, сообщалось о низкой жизнеспособности клеток: после электропорации погибло около 20% клеток.⁵⁴ Для предотвращения гибели клеток в среде клеточной культуры после электропорации широко используется ингибитор rho-associated protein kinase inhibitor (ROCKi). Это основано на открытии, что ROCKi может способствовать росту стволовых клеток и предотвращать их гибель.^{55, 56} Однако точный механизм влияния ROCKi на выживание клеток и его цитотоксичность для клеток неясен и требует дальнейших доказательств.

Генная терапия ex vivo с использованием генетически модифицированных трансплантатов эпидермального листа была применена для лечения JEB и RDEB. Это связано с тем, что генерализованные волдыри, рецидивирующие раны и хрупкая кожа у этих пациентов настолько тяжелы, а аутологичная терапия ex vivo с использованием ген-модифицированного эпидермального листа не только обеспечивает долгосрочную функциональную экспрессию генов/белков, но и покрывает раны, поддерживая их заживление.⁵⁷ При терапии ex vivo с использованием трансплантата эпидермального листа кератиноциты пациентов выделяются из небольшого биоптата кожи, умножаются, генетически модифицируются и культивируются в виде эпидермального листа in vitro, а затем трансплантируются обратно пациентам (рис. 1). Mavilio и др. провели первую ex vivo ген-модифицированную аутологичную эпидермальную листовую терапию JEB.¹⁶ В этом исследовании кератиноциты, включая KSC's , выделенные от взрослого пациента JEB с дефицитом ламинина β3 (LAMβ3), были трансдуцированы ретровирусным вектором, несущим кДНК LAMβ3 дикого типа. Трансдуцированные клетки затем культивировали в виде эпидермального листа и прививали пациенту. В трансплантате был обнаружен прочно прилипший эпидермис и восстановленная экспрессия белка ламинина 332. Поразительно, что экспрессия трансгенов и восстановление нормального эпидермально-дермального соединения в пересаженной области продолжалось более 6 лет.⁵⁸ Эта стратегия генотерапии недавно была использована на 7-летнем ребенке с JEB. Пациент получил ~0,85 м2 ген-модифицированных эпидермальных листов, содержащих почти 1,6 х 10⁷ KSC's. Эпидермальная регенерация на пересаженных участках наблюдалась через 1 месяц после пересадки с нормальной морфологией кожи, без каких-либо волдырей или ран. Регенерированный эпидермис также показал физиологический уровень ламинина 332, базальную мембрану нормальной толщины, регулярное образование полу-десмосом и заживление ран в течение более 4 лет.¹⁴



FIGURE 1 A flow chart of ex-vivo epidermal sheet graft gene therapy. Patient cells isolated from a small skin biopsy are expanded, genetically modified, and cultured as epidermal sheet and then grafted back to the patients. = indicates lesions; = indicates epidermal sheet graft on the lesions; LEKTI = lympho-epithelial kazal-type related inhibitor; JEB = junctional epidermolysis bullosa; RDEB = recessive dystrophic epidermolysis bullosa

Кроме этих испытаний, была проведена генотерапия ex vivo с помощью эпидермального листа для лечения RDEB.¹⁸ В этом испытании экспрессия трансгена COL7A1, функциональное отложение белка C7 и образование якорных фибрилл в пересаженных областях были обнаружены через три месяца после трансплантации, но экспрессия белка C7 снизилась/исчезла в 58% пересаженных областей через 12 месяцев после трансплантации. Генная терапия эпидермального листа ex vivo также применялась для лечения синдрома Нетертона (СН).¹⁷ СН - это аутосомно-рецессивное заболевание, вызванное мутациями в гене SPINK5, который кодирует белок LEKTI. Доклиническое исследование НС показало исправление морфологии кожи во всем трансплантате, несмотря на то, что трансплантаты несли лишь ограниченное количество генно-модифицированных кератиноцитов. Поскольку LEKTI является секретируемым белком, было предположено, что ген-модифицированный трансплантат эпидермального листа может обеспечить пользу не только в месте пересадки, но и общую пользу вокруг трансплантата. Основываясь на этом, Di и др. провели генную терапию ex vivo эпидермального листового трансплантата для лечения НС. Экспрессия трансгена SPINK5, кодирующего белок LEKTI, могла быть обнаружена до трех месяцев после пересадки, но затем снизилась.¹⁷ Оба доклинических экспериментальных исследования для RDEB и NS продемонстрировали стабильную успешную экспрессию трансгена и функциональную коррекцию в моделях химерных кожных трансплантатов in vivo человек:мышь. Почему экспрессия трансгенов снизилась в экспериментах по RDEB и NS с использованием протоколов, разработанных в доклинических исследованиях? ^{59, 60} Хотя потеря долгосрочной экспрессии трансгенов в этих клинических исследованиях может быть вызвана чрезмерным ростом не-трансгенных клеток над трансгенными, нельзя исключить потерю KSC's или стволовых KSC's во время культивирования листа. Поскольку ни в одном из исследований не проверялась популяция KSC's после генной модификации и до пересадки листа, доля KSC's в эпидермальных листах в обоих исследованиях не ясна.

Сохранение генетически модифицированных KSC's в культивированных эпидермальных листках определяет успех терапии ex vivo генетически модифицированными эпидермальными листками. Культивирование in vitro первичных кератиноцитов имеет жизненно важное значение для поддержания KSC's. В коже базальный слой эпидермиса содержит KSC's и переходные усиливающие клетки для удовлетворения постоянного спроса на пролиферацию и дифференцировку эпидермальных клеток.^{61, 62} KSC's обладают высокой способностью к самообновлению и дают начало переходным усиливающим клеткам, которые имеют ограниченную способность к пролиферации в течение двух-четырех поколений, прежде чем подвергнуться терминальной дифференцировке.^{13, 63} Кератиноциты, свежевыделенные из биопсии кожи, содержат гетерогенные клеточные популяции и могут образовывать три типа клонов в культуре, включая голоклоны, мероклоны и параклоны в зависимости от их морфологии и размера, а клетки из голоклонов обладают самой высокой пролиферативной способностью.^{13, 61} Голоклон определяется как колония, дающая менее 5% абортивных колоний при субкультивировании. Мероклоны и параклоны не имеют такой характеристики.^{64, 65} Другими словами, клетки, образующие голоклоны, имеют признаки стволовых клеток, в то время как клетки, образующие мероклоны и параклоны, являются переходными клетками предшественниками.¹⁴ В настоящее время KSC's не могут быть отделены от гетерогенных первичных кератиноцитов, поскольку не удалось найти уникальный маркер KSC's . По этой причине для создания эпидермальных листов приходится использовать первичные кератиноциты с гетерогенной популяцией. Однако KSC's могут быть охарактеризованы панелью положительных маркеров экспрессии, включая интегрины α1, α6, β1 и β6, дельта N-P63 и кератин 14, и отрицательных маркеров экспрессии, которые экспрессируются только в дифференцированных кератиноцитах, таких как инволюкрин, лорикрин, кератин 1 и трансглутаминаза 1. Эти маркеры потенциально могут быть использованы для подтверждения популяций KSC's. ^66-69

На свойства KSC's в первичных клетках может влиять среда культивирования in vitro. Для культивирования первичных кератиноцитов используются две основные системы культивирования. Одна из них - традиционная культуральная система, разработанная Рейнвальдом и Грином.³⁰ В этой системе используется среда Gibco Dulbecco's Modified Eagle Medium и среда Ham's F12, содержащая фетальную телячью сыворотку и добавки гидрокортизона, три-йодтиронина, холерного токсина, эпидермального фактора роста, инсулина и аденина.³⁰ Эта культуральная система также требует совместного культивирования кератиноцитов с летально облученными или инактивированными митомицином С эмбриональными фибробластами мыши (3 T3-J2), известными как фидерные клетки, поскольку эти фидерные клетки откладывают гликопротеины базальной пластинки на поверхности культуральной посуды и выделяют растворимые факторы в культуральную среду для поддержки прикрепления и образования колоний первичных кератиноцитов, предотвращая раннюю дифференциацию кератиноцитов и чрезмерный рост фибробластов человека⁷⁰. Было замечено, что свежий биоптат кожи содержит около 1-10% KSC's , но только 0,1-1% KSC's могут выжить и вести себя как KSC's в культуре.⁷¹ Это связано с тем, что свежевыделенные KSC's могут подвергаться индуцированной диссоциацией гибели клеток, называемой anoikis. Благоприятная поверхность для прикрепления клеток и подходящая микросреда для роста клеток и образования колоний могут облегчить и уменьшить анойкис, например, совместное культивирование с клетками-фидерами.⁷² Исследования показали, что кератиноциты из голоклона можно размножить в 20-180 раз, если их культивировать в условиях, содержащих свеже-облученные клетки 3 T3 с соответствующей плотностью посева.^{30, 64} В испытании NS фазы I использовались замороженные облученные клетки 3 T3 вместо свежеприготовленных. Поскольку замораживание-размораживание облученных клеток 3 T3 помимо облучения вызывало огромный стресс для клеток-фидеров, это привело к изменению жизнеспособности клеток от партии к партии и непредсказуемой и неравномерной плотности посева клеток-фидеров 3 T3 в клеточных культурах. Последствия неправильного использования фидерных клеток привели к низкой эффективности посева, плохому образованию голоклонов, то есть потере популяции KSC's, ранней дифференцировке KSC's и чрезмерному росту фибробластов в культуре.¹⁷ Хотя переходные усиливающиеся и дифференцированные кератиноциты все еще могут образовывать эпидермальные листы, экспрессия трансгена исчезает, когда эти клетки подвергаются терминальной дифференцировке и в конечном итоге умирают.

Безсывороточная среда (SFM) без совместного культивирования с фидерными клетками - еще один подход к культивированию. В этой системе культуры используется базовая среда MCDB153 с низкой концентрацией кальция, дополненная экстрактом бычьего гипофиза, эпидермальным фактором роста, трансферрином, инсулином, гидрокортизоном, моноэтаноламином и фосфоэтаноламином.^{73, 74} Питающие клетки были заменены покрытием поверхности культуры внеклеточным матриксом, таким как коллаген, фибронектин или ламинин для прикрепления кератиноцитов.^75-77. SFM и культура без слоя фидера позволяют избежать использования животных материалов, таких как фетальная бычья сыворотка и мышиные фидерные клетки 3 T3, тем самым снижая риск трансмиссивных губчатых энцефалопатий, и подходят для трансляционных клинических приложений.⁷⁸ Еще одним преимуществом использования SFM является то, что неизвестные факторы из сыворотки и фидерных клеток 3 T3 можно контролировать в исследованиях. Кроме того, более низкая концентрация кальция (~0,06 мМ) в SFM предположительно благоприятна для пролиферации кератиноцитов и предотвращения дифференцировки клеток.^{79, 80} Однако существуют противоречивые мнения о безфидерной культуре для сохранения KSC's . Исследования показали, что KSC's, растущие в безфидерной культуре, могут потерять свои свойства стволовых клеток, такие как ограниченная способность к пролиферации и повышенная склонность к дифференцировке и старению.^{81, 82} В испытании терапии эпидермального листового трансплантата при RDEB использовалась система SFM и безфидерная система, и результаты показали относительно краткосрочную экспрессию трансгена.¹⁸ Это может быть связано с тем, что система SFM и безфидерной культуры была селективной или благоприятной для переходных усиливающих клеток, но не для KSC's , но это предположение остается неподтвержденным, так как в испытании RDEB не оценивалась популяция KSC's после трансдукции и культуры листа. Тем не менее, из этих исследований можно извлечь определенные уроки, например, важно проверять долю KSC's перед трансплантацией клеток или эпидермального листа пациентам, и это должно быть одним из критериев выпуска исследуемого лекарственного препарата.

Внутрикожное введение генетически модифицированных дермальных фибробластов является еще одним подходом к генной терапии ex vivo для лечения генодерматозов, таких как RDEB. Дермальные фибробласты легко выделяются из кожи, требуют менее сложного процесса культивирования по сравнению с кератиноцитами и могут быть широко распространены in vitro.^{83, 84} Поскольку фибробласты выделяют белок С7, основной компонент дермальных якорных фибрилл, внутрикожное введение фибробластов, таким образом, является относительно простым подходом генотерапии для пациентов с RDEB, у которых отсутствует экспрессия С7.5 . В клиническом исследовании I/II фазы для лечения RDEB с использованием внутрикожного введения ген-модифицированных аутологичных фибробластов была показана функциональная экспрессия C7 и образование новых якорных фибрилл.⁸⁵ Еще одна внутрикожная инъекция аутологичных ген-модифицированных фибробластов для лечения RDEB также показала значительное увеличение экспрессии С7 в месте инъекции в течение как минимум 12 месяцев, хотя функционального образования якорных фибрилл не наблюдалось.³² Однако следует понимать, что данная терапия не способна обеспечить долгосрочное терапевтическое решение, и для поддержания стойкого терапевтического эффекта потребуется несколько внутрикожных инъекций генетически модифицированных фибробластов.

С тех пор как в 2012 году было установлено, что CRISPR/CAS9 может использоваться для редактирования генома⁸⁶ , в технологию CRISPR/Cas9 было внесено большое количество изменений для повышения ее точности и эффективности, и в настоящее время технология CRISPR/Cas9 стала мощным инструментом для редактирования геномов. Традиционное редактирование CRISPR/Cas9 оказалось незаменимым для редактирования генома, но основной недостаток, связанный с вне-целевым эффектом из-за введения двухцепочечного разрыва ДНК, ограничивает его клиническое применение. Программируемое редактирование оснований и редактирование праймеров имеют очевидные преимущества по сравнению с обычным CRISPR/Cas9. Оба редактора не требуют создания двухцепочечных разрывов, поскольку вместо них используется каталитически неактивный вариант Cas9. Это изменение значительно снижает частоту вне-целевой активности в обеих системах редактирования. Ряд исследований показал преимущества редактирования оснований в точном редактировании генома и низком эффекте off-target по сравнению с обычным CRISPR/Cas9. Тем не менее, технологии редактирования оснований еще не являются идеальным инструментом для редактирования генома, поскольку они исправляют только миссенс-мутации и не могут быть нацелены на все гены из-за предпочтений к последовательности протоспейсерного смежного мотива (PAM). Более того, сообщалось, что редактирование оснований вызывает в масштабах всего генома вне-целевое дезаминирование как ДНК, так и РНК, а также неожиданные превращения нуклеотидов.^{87, 88} Прайм-редактирование преодолевает эти ограничения, наблюдаемые в обычных CRISPR/Cas9 и редактировании оснований, путем сильной модификации белка Cas9 и направляющей РНК, обеспечивая большую гибкость нацеливания и большую точность редактирования. Было подсчитано, что прайм-редактирование способно исправить почти 89% генетических вариантов, связанных с заболеваниями человека. Похоже, что прайм-редактирование имеет большие перспективы для клинического применения, но поскольку технология была разработана совсем недавно (в 2019 году), предстоит еще многое сделать, чтобы доказать, что она является такой же универсальной и надежной, как и другие редакторы генома. Кроме того, мы должны знать, что существуют потенциальные проблемы и риски, связанные с редактированием генома, такие как эффекты вне мишени. Важно приложить усилия, чтобы минимизировать или смягчить эти проблемы редакторов генома до клинического применения.⁸⁹ Например, редакторы оснований могут поставляться в виде рибонуклеопротеина (РНП) или мРНК, что может уменьшить возможность редактирования вне мишени, поскольку и РНП, и мРНК быстро разрушаются в цитоплазме клетки.

Несмотря на последние достижения в области платформ для редактирования генома, экспериментальные исследования на клетках или тканях человека, например, на моделях клеток пациента in vitro и химерных кожных трансплантатов мыши-человека in vivo, необходимы. Эффективность коррекции генов, геноцитотоксичность, вне-целевой эффект и эффективность терапии должны быть оценены в этих моделях перед трансляционной разработкой стратегий генотерапии. Помимо коррекции генов, процедуры, вовлеченные в ген-модифицированную терапию ex vivo, также нуждаются в полной оценке, включая токсичность электропорации для переноса редакторов генома в клетки, систему культивирования для эффективного расширения и сохранения KSC's и их стволовости, а также подход и критерии для оценки популяции KSC's.

В целом, нет сомнений в том, что коррекция мутаций с помощью недавно разработанной технологии редактирования генома является будущим направлением генотерапии генодерматозов. В настоящее время ген-модифицированная терапия генодерматозов ex vivo все еще находится на ранней стадии, но она имеет потенциал для лечения этих разрушительных генетических заболеваний кожи в ближайшем будущем.