Легочный сурфактант представляет собой сложную смесь фосфолипидов и белков, которая секретируется в альвеолярное пространство, снижает поверхностное натяжение, предотвращает альвеолярный коллапс в конце экспираторного периода и необходим для газообмена. Сурфактант синтезируется в ламеллярных тельцах, специализированных внутриклеточных органеллах, происходящих из лизосом в альвеолярных эпителиальных клетках II типа (AEC2, они же клетки ATII или AT2). Фосфолипиды транспортируются в ламеллярные тельца с помощью ABCA3 и соединяются с сурфактантными белками B и C, образуя сурфактант. Ламеллярные тельца высвобождаются в просвет альвеол путем экзоцитоза. Патогенные варианты генов, кодирующих ключевые компоненты легочного сурфактанта, включают сурфактантный протеин B (SP-B, ген SFTPB), сурфактантный протеин C (SP-C, ген SFTPC) и АТФ-связывающий кассетный транспортер A3 (ABCA3, ген ABCA3) и являются основными наследственными причинами неонатального респираторного дистресс-синдрома (РДС) и детского интерстициального заболевания легких (ДИЗЛ) (Garmany et al., 2008). Лечение этих моногенных легочных заболеваний ограничено и неспецифично, и для многих пациентов трансплантация легких может быть единственным вариантом выживания после первых месяцев жизни (Wambach et al., 2014). Последние достижения открывают новые возможности для разработки генной терапии генетических нарушений дисфункции сурфактанта, обусловленных патогенными вариантами в SFTPB, SFTPC и ABCA3. Не существует универсального подхода к разработке векторов генной терапии для лечения дефицита SP-B, SP-C и ABCA3. Невирусные векторы (т.е. плазмидная ДНК, наночастицы и или транскрибированная in vitro мРНК) и плазмидная ДНК на основе вируса Эпштейна-Барр обладают важными качествами и расширили область переноса генов в легкие (Stribling et al., 1992; Tu et al., 2000). Наша цель в данном обзоре - представить потенциальные варианты генотерапии заболеваний сурфактанта, опосредованные вирусными векторами, и предоставить достаточно подробную информацию о каждом недостатке, чтобы подчеркнуть, почему генная терапия может быть особенно сложной для этого класса заболеваний.

Производство легочного сурфактанта - это высоко регулируемый процесс синтеза, секреции, деградации и рециркуляции. Сурфактант состоит на 90% из фосфолипидов, в частности фосфатидилхолина и фосфатидилглицерина, холестерина, и на 10% из сурфактантных белков A, B, C и D (Agassandian and Mallampalli, 2013). Эти компоненты синтезируются в эндоплазматическом ретикулуме в AEC2s, собираются и хранятся в ламеллярных телах (рис. 1). Сурфактантные белки B и C играют роль в снижении поверхностного натяжения, а сурфактантные белки A и D являются коллектинами и играют важную роль во врожденном иммунитете (Pastva et al., 2007). Сурфактант высвобождается из ламеллярных телец путем экзоцитоза в просвет альвеол. После высвобождения ламеллярные тельца разворачиваются, образуя трубчатый миелин - упорядоченную структуру, которая формирует пленку на границе раздела воздух-жидкость (Canadas et al., 2020).



FIGURE 1 Schematic of SP-B, SP-C, and ABCA3 protein localization in an alveolar type II cell. 1) ABCA3 transports phospholipids into lamellar bodies; SP-B and SP-C provide support during surfactant assembly. 2) Lamellar bodies undergo exocytosis from alveolar type II cell and unravel into tubular myelin. 3) Tubular myelin disassembles into a surfactant monolayer through adsorption into a film at an air-liquid interface.

SP-B, SP-C и ABCA3 играют различные роли в производстве и гомеостазе сурфактанта. SP-B - гидрофобный белок, необходимый для образования сурфактанта и являющийся ключевой структурной опорой, придающей молекулам фосфолипидов свойства, снижающие поверхностное натяжение, для улучшения распространения сурфактанта (Cochrane and Revak, 1991). SP-C усиливает адсорбцию на границе раздела воздух-жидкость для снижения поверхностного натяжения. SP-C также играет иммуномодулирующую роль в очищении легочных инфекций, так как у мышей с дефицитом SP-C наблюдается воспаление после потери SP-C (Glasser et al., 2009). ABCA3 участвует в формировании ламеллярных тел и транспорте фосфолипидов. Потеря ABCA3 приводит к тому, что в сурфактанте отсутствует фосфатидилхолин и повышается поверхностное натяжение (Garmany et al., 2006).

Новорожденные с дефицитом SP-B обычно заболевают RDS вскоре после рождения и умирают от прогрессирующей дыхательной недостаточности в первые несколько месяцев жизни без трансплантации легких. Сообщалось о нескольких детях с биаллельными вариантами SFTPB и хронической дыхательной недостаточностью (Dunbar et al., 2000). Дефицит SP-B является аутосомно-рецессивным заболеванием, а наиболее распространенный патогенный вариант p. Pro133Glnfs*95 (ранее известный как "121ins2") приводит к сдвигу рамки считывания и нонсенс-опосредованному распаду транскрипта мРНК. Лечение экзогенным сурфактантом, обогащенным белком SP-B, неэффективно (Thompson, 2001), а трансплантация легких по-прежнему проводится нечасто из-за отсутствия подходящих неонатальных донорских легких (Eldridge et al., 2017). Подходы к добавлению генов (Barnett et al., 2017; Leibel et al., 2019; Kang et al., 2020) и редактированию генов (Mahiny et al., 2015; Jacob et al., 2017) продемонстрировали, что добавление экспрессии SP-B в AEC2s восстанавливает фенотипический дефект in vitro и in vivo. Хотя подходы к редактированию генов могут быть успешными, разнообразие патогенных вариантов позволяет предположить, что подход к добавлению генов может быть более близкой целью для лечения дефицита SP-B.

SP-B играет важную роль в сборке и функционировании легочного сурфактанта и необходим для правильного биогенеза ламеллярных тел в AEC2s (рис. 1). Обычно он существует в виде гомодимера и представляет собой небольшой, 79 аминокислотный гидрофобный белок, который обеспечивает проницаемость, сшивает, смешивает и соединяет клеточные мембраны. Зрелый SP-B образуется в результате протеолитических модификаций с участием 381 аминокислотного пептида preproSP-B с последующим дополнительным гликозилированием и протеолитическими событиями в proSP-B (Guttentag, 2008) (Рисунок 2A). Были выявлены патогенные варианты SFTPB, которые нарушают гликозилирование или сайты протеолитического расщепления (Lin et al., 2000). Хотя как вирусные, так и невирусные стратегии доставки являются перспективными, здесь мы сосредоточимся на вирусных векторах.



FIGURE 2 (A) Top panel: Exon representation of SFTPB on chromosome 2. Middle panels: progression of protein processing. Glycosylation at residues 129-131 and 311-313 occurs in ER. Bottom panel: yellow circles indicate oligomer of at least 6 homo-dimers inserted into a lipid bilayer. (B) Top panel: Exon representation of SFTPC on chromosome 8. Middle panels: progression of protein processing. Palmitoylation occurs in the Golgi apparatus. Cleavage events resulting in shortened protein forms are the result of Cathepsin H and Pepsinogen C enzymatic activities. Bottom panel: yellow circles indicate mature membrane bound protein. (C) Top panel: Exon representation of ABCA3 on chromosome 16. Middle panel: N-linked glycosylation at positions N124 and N140 indicated by N-linked glycosylation symbol. Bottom panel: N-terminus is proteolytically cleaved by cathepsins L and B, as indicated by scissors icon in EL1. TM, transmembrane domain; EL, extracellular loop; NBD, nucleotide binding domain; aa, amino acid.

Векторы AAV вызывают все больший интерес в связи с расширением клинического применения после одобрения FDA препаратов Luxturna (Maguire et al., 2008), Zolgensma (Mendell et al., 2017) и перспективных исследований для лечения мышечной дистрофии Дюшена (Duan, 2018). Векторы AAV являются эписомными, имеют превосходные профили безопасности и длительно сохраняются в митотически покоящихся клетках. Кроме того, AAV можно производить в высоких титрах и масштабировать для получения векторов клинического класса (Selvaraj et al., 2021). Однако ограничение емкости упаковки в 4,7 кб является сложным для больших трансгенов. Относительно небольшая кодирующая последовательность SP-B (~1,2 кб) делает AAV подходящим кандидатом в векторы. Действительно, Kang и др. использовали AAV для доставки SFTPB и восстановили производство сурфактанта и улучшили выживаемость в условно летальной модели мыши с нокаутом SP-B (Kang et al., 2020). AAV6, несущий кДНК proSFTPB, был доставлен условно нулевым мышам SP-B, которые обычно умирают в течение 2 дней после рождения из-за дыхательной недостаточности. В данном исследовании выживаемость увеличилась до ~200 дней. Кроме того, было восстановлено формирование пластинчатых тел, улучшилась структура и функция легких. Другие подходы, такие как введение усеченных версий SP-B, продемонстрировали увеличение выживаемости у мышей с дефицитом SP-B. Эти исследования также показали, что С-концевая часть белка важна для образования сурфактанта (Akinbi et al., 1997).

При разработке вектора генотерапии важной задачей является эффективная доставка и устойчивая экспрессия трансгена в клетках-мишенях. Конечные точки, подлежащие количественной оценке, включают эффективность трансдукции, экспрессию трансгена (мРНК и белка) и функциональную коррекцию. Чтобы достичь этого с помощью AAV, для трансдукции AEC2s необходим отбор капсида. Капсиды AAV2, AAV6 и вариантов AAV6 трансдуцируют органоидные модели AEC2 (Meyer-Berg et al., 2020), а также эпителиальные клетки дыхательных путей и альвеол (Kang et al., 2020). Способ введения является важным фактором для успешной трансдукции интересующих клеток-мишеней. AAV9, введенный внутривенно, трансдуцирует сердце, скелетную мышцу и поджелудочную железу с большей эффективностью по сравнению с капсидом AAV8 (Inagaki et al., 2006). Является ли топическая доставка в легкие или системная доставка более эффективной для трансдукции AEC2, еще предстоит выяснить.

После эффективной трансдукции AEC2s для достижения стойкой экспрессии в легких, вероятно, потребуется интеграция в популяцию клеток-предшественников. AAV обычно считается неинтегрирующим, но его персистенция в AEC2s неизвестна. Включение интегрирующей системы, такой как транспозон piggyBac, в AAV является потенциальной стратегией для достижения постоянной экспрессии в альвеолах (Cooney et al., 2015; Brommel et al., 2020). AEC2s являются важными клетками-предшественниками в альвеолах (Olajuyin et al., 2019), и хотя они сохраняют секреторные функции для производства сурфактанта, они также важны для альвеолярного гомеостаза посредством самообновления или дифференцировки в альвеолярные клетки типа I (Mason and Williams, 1977; Fehrenbach, 2001). Наконец, важно учитывать выбор промотора и хвоста полиаденилирования (pA). Размер промотора - еще один ключевой фактор в принятии решения, а именно короткий промотор с достаточной активностью. Синтетические промоторы, такие как F5Tg83 и короткий полиА хвост, были созданы для максимального использования пространства в векторах AAV (Yan et al., 2015). Специфические для AEC2 промоторы для клеточно-специфической экспрессии SP-B и ABCA3 еще предстоит оценить. Промотор SP-C является кандидатом на направление экспрессии генов, специфичных для AEC2 (Degiulio et al., 2010).

Лентивирусные векторы продемонстрировали терапевтическую эффективность при переносе генов ex vivo в гемопоэтические стволовые клетки при ADA-SCID (Kohn et al., 2021), β-талассемии (Thompson et al., 2018) и синдроме Вискотта-Олдрича (Sereni et al., 2019). Инсерционный мутагенез является потенциальным риском для любого интегрирующего вектора. Функциональным последствиям интеграции лентивирусных векторов уделяется значительное внимание (обзор в (Schlimgen et al., 2016; Milone and O'Doherty, 2018)). Однако при использовании нынешнего поколения само-инактивирующихся векторов клональная экспансия исправленных клеток не наблюдалась после ex vivo или системной доставки лентивирусных векторов. При оценке использования интегрирующего вектора необходимо учитывать соотношение риска и пользы. Лентивирусные векторы признаны за их способность трансдуцировать как делящиеся, так и неделящиеся клетки, интегрироваться для долгосрочной экспрессии и допускать повторное введение без блокирования иммунного ответа (Sinn et al., 2008). Лентивирусные векторы, кодирующие SFTPB, доставленные в альвеолярные органоиды, обеспечили экспрессию SP-B и обратили вспять фенотип дефицита сурфактанта in vitro (Leibel et al., 2019; Munis et al., 2021). Ключевым моментом при разработке терапевтического лентивирусного вектора для лечения дефицита SP-B является выбор оболочки для трансдукции соответствующего типа клеток. Гликопротеин вируса везикулярного стоматита (VSV-G) является наиболее распространенной оболочкой, используемой для псевдотипирования ретровирусов, и, как сообщается, трансдуцирует AEC2s (Borok et al., 2001). Другие оболочки, такие как бакуловирус GP64 (Sinn et al., 2012) и вирус Сендай F/HN (Griesenbach et al., 2012), также трансдуцируют альвеолярный эпителий. Варианты выбора промотора включают клеточно-специфические или конститутивные элементы. Производство вектора клинического класса для нацеливания на соматические клетки in vivo представляет собой сложную задачу, но достижения в производстве лентивирусов (Valkama et al., 2018; Martinez-Molina et al., 2020; Soldi et al., 2020) делают этот метод перспективным для терапии дефицита SP-B.

SP-C - это 35-аминокислотный гидрофобный белок, который взаимодействует с SP-B для снижения поверхностного натяжения сурфактанта (рис. 1). Локус SFTPC охватывает 3500 п.н. и экспрессируется с шести экзонов на хромосоме 8. Сначала образуется 197-аминокислотный белок с N-концевым про-пептидным доменом и C-концевым BRICHOS-доменом (pro-SPC). По мере процессинга зрелого белка N-концевой домен расщепляется от формы pro-SPC до SP-C. Зрелый белок имеет укороченный N-концевой домен, линкер и С-концевой домен BRICHOS (рис. 2B).

Патогенные варианты в SFTPC могут возникать de novo (~50% случаев) или передаваться по наследству (~50% случаев) (Nogee et al., 2002). Патогенный вариант сплайсинга в SFTPC в пределах первого основания интрона 4 (c.460+1G > A) был впервые зарегистрирован в 2001 году у младенца и матери с интерстициальным пневмонитом (Nogee et al., 2001). Впоследствии были выявлены дополнительные патогенные варианты SFTPC, наиболее частым из которых является с. I73T (Cameron et al., 2005). У людей с патогенными вариантами SFTPC чаще всего наблюдается спорадическое или семейное интерстициальное заболевание легких в младенческом, детском или взрослом возрасте, реже - неонатальный RDS (Nogee et al., 2002). Течение болезни очень вариабельно: у некоторых младенцев наблюдается тяжелая дыхательная недостаточность, требующая пересадки легкого, у других - хроническое заболевание, управляемое длительной механической вентиляцией (Liptzin et al., 2015), у третьих - относительно бессимптомное (Thomas et al., 2002). Генотип сам по себе не предсказывает проявление, тяжесть и течение заболевания. Патогенные варианты SFTPC, расположенные в С-концевом домене BRICHOS, который действует как шаперон для повышения стабильности белка, приводят к увеличению стресса эндоплазматического ретикулума, воспалению и спонтанному фиброзу легких в мышиной модели (Katzen et al., 2019). Не-BRICHOS варианты, включающие p. I73T, приводят к дефекту макроаутофагии AEC2, воспалению, ремоделированию и фиброзу (Nureki et al., 2018).

SP-C-ассоциированная интерстициальная болезнь легких - это заболевание с усилением токсических функций, наследуемое по аутосомно-доминантному типу с вариабельной пенетрантностью (Thomas et al., 2002). Экспрессия мутантного аллеля SFTPC отвечает за фенотип дисфункции сурфактанта. В результате усиление токсической функции требует подавления мутантного аллеля. Поэтому метод добавления генов не подходит. Для разрушения и инактивации или уменьшения количества мутантного продукта SFTPC можно использовать метод нокаута или нокдауна аллель-специфического гена. Опосредованный нуклеазой CRISPR/Cas9 нокаут гена был подтвержден у мышей in utero, нацеленный на аллель p.173T, что привело к улучшению морфологии легких и повышению выживаемости потомства (Alapati et al., 2019). Также могут быть предусмотрены стратегии RNAi и анти-смысловых РНК.

Обычные подходы к редактированию генов, такие как CRISPR/Cas9, могут применяться с использованием гомологичной рекомбинации или негомологичного концевого соединения для восстановления или инактивации мутантного аллеля. В качестве альтернативы, появление редакторов оснований цитозина и аденина и редактирование праймеров может позволить вносить изменения одного основания, не вызывая indels (Levy et al., 2020). Для доставки инструментов редактирования генов обычно используется AAV, включая систему split-intein, позволяющую совместно доставлять кассеты большего размера, чем емкость упаковки AAV. В качестве альтернативы, более мелкий Staphylococcus aureus Cas9 может быть доставлен вместе с sgRNA с помощью одного вектора AAV (Lau and Suh, 2017). Как и при разработке метода редактирования генов для лечения любого заболевания, для массива патогенных вариантов SFTPC, вызывающих интерстициальное заболевание легких, может потребоваться индивидуальный подход.

Дефицит ABCA3 - аутосомно-рецессивное заболевание, вызываемое патогенными вариантами в ABCA3. Биаллельные варианты ABCA3 вызывают тяжелый неонатальный RDS, chILD и фиброз легких у взрослых (Shulenin et al., 2004; Klay et al., 2020; Tomer et al., 2021). У младенцев с биаллельными вариантами ABCA3 со сдвигом рамки или нонсенс при рождении наблюдается неонатальный RDS и они умирают в течение первого года жизни без трансплантации легких (Wambach et al., 2014). Респираторные фенотипы и течение болезни у людей с миссенс-вариантом ABCA3 разнообразны и включают неонатальный РДС и интерстициальную болезнь легких.

ABCA3 - это транспортер фосфолипидов, расположенный на лизосомальной мембране, ограничивающей ламеллярное тело, и играющий критическую роль в сборке сурфактанта и формировании ламеллярного тела (рис. 1). кДНК ABCA3 кодирует полипептид из 1704 аминокислот. Зрелый белок ABCA3 сворачивается в эндоплазматическом ретикулуме и подвергается гликозилированию в системе Гольджи (Beers and Mulugeta, 2017). Вторая пост-трансляционная модификация включает N-концевое протеолитическое расщепление 190 кД белка, укорачивая его до 150 кД (Engelbrecht et al., 2010) (рис. 2C). Ламеллярные тельца у младенцев и детей с дефицитом ABCA3 маленькие с плотными тельцами и описываются как имеющие "вид жареного яйца" (Wert et al., 2009). Выявлены два механистических класса миссенс-вариантов ABCA3: нарушение внутриклеточного трафика и нарушение транспорта фосфолипидов (Matsumura et al., 2006; Denman et al., 2018; Wambach et al., 2020). Наиболее распространенным патогенным вариантом является p. E292V, миссенс-вариант, нарушающий транспорт фосфолипидов (Wambach et al., 2016). Этот вариант часто ассоциируется с chILD (Wambach et al., 2014) и присутствует у 0,4% людей в базе данных Genome Aggregation (gnomad.broadinstitute.org, accessed September 2021).

Общая цель генотерапии для лечения заболеваний с потерей функции - эффективная и постоянная (долгосрочная) экспрессия ABCA3 на физиологическом уровне в AEC2s. Стратегия добавления генов предполагает дополнение утраченной функции кДНК ABCA3 полной длины. Поскольку большинство вариантов ABCA3 являются редкими и частными, это представляет собой проблему для разработки специфичных для конкретного варианта подходов к редактированию генов или целевых лекарств. Ограничения по размеру некоторых вирусных векторов создают проблемы для трансгена такого размера, как ABCA3.

Добавление гена кДНК ABCA3 с помощью лентивирусных векторов является многообещающим терапевтическим подходом. Лентивирусные векторы имеют емкость упаковки не менее 7,5 кб и легко вмещают трансген и промотор ABCA3 размером 5,1 кб. Кроме того, лентивирусные векторы легко поддаются псевдо-типированию с различными оболочками для изменения тропизма. Как обсуждалось в лентивирусном разделе, посвященном дефициту SP-B, оболочка, промотор и сигнал полиаденилирования являются важными факторами при разработке вектора генотерапии дефицита ABCA3. Интегрирующие свойства лентивирусных векторов делают этот класс векторов привлекательным вариантом для лечения дефицита ABCA3.

Учитывая, что размер кДНК ABCA3 5,1 кб превышает предел упаковки векторов AAV в 4,7 кб, подход AAV для доставки ABCA3 полной длины является сложным при использовании существующих технологий. Подходы с использованием AAV для восстановления дефицита ABCA3 могут быть смоделированы на основе других заболеваний, включая вставку кДНК с частичным суперэкзоном, как описано для другого белка-транспортера ABC, трансмембранного регулятора проводимости муковисцидоза (CFTR, также известного как ABCC7) (Bednarski et al., 2016). Для доставки инструментов редактирования генов был использован двухвекторный подход с использованием расщепленных интегринов, в частности, расщепление трансгена Cas9 между двумя векторами AAV, которые соединены С-концевым и N-концевым интегринами (Tornabene et al., 2019); однако этот подход может оказаться невыполнимым для белков с несколькими трансмембранными доменами. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы выяснить, можно ли доставить ABCA3 с помощью таких двойных векторных платформ.

Аденовирусные (Ad)-векторы обеспечивают надежную экспрессию и относительно большую несущую способность (~10 kb). Дополнительными особенностями Ad-векторов являются: 1) они трансдуцируют как делящиеся, так и неделящиеся клетки, 2) они обладают широким тканевым тропизмом и 3) они масштабируемы для клинических платформ. Тем не менее, самым большим препятствием для них являются врожденные и адаптивные иммунные реакции, которые могут удалять трансдуцированные клетки. В попытках преодолеть ограничения, связанные с иммунными реакциями, были созданы хелпер-зависимые Ad (HDAd) векторы путем удаления всех вирусных генов, оставив только сигнал упаковки. Необходимые вирусные компоненты обеспечиваются хелперным вирусом в процессе производства вируса. Второе ограничение заключается в том, что Ad не является интегрирующим вектором. Однако доставка инструментов редактирования генов на основе Ad показала долгосрочную фенотипическую коррекцию гемофилии B в мышиной модели (Stephens et al., 2019). Более того, многочисленные исследования включали транспозонные системы, такие как Sleeping Beauty и piggyBac, для создания гибридных интегрирующих аденовирусных векторов (Cooney et al., 2015; Boehme et al., 2016). Векторы на основе Ad остаются платформой-кандидатом для разработки генотерапии и вакцин. Преимуществом для производства векторов на основе Ad является их способность быть выращенными до высоких титров и строго очищенными (Danthinne and Imperiale, 2000; Nadeau and Kamen, 2003).

Учитывая трансген ABCA3 размером 5,1 кб, векторы на основе Ad были широко использованы для изучения комплементации ABCA3 и влияния различных вариантов. Например, Ad-векторы, несущие варианты ABCA3, включая p. L101P (мутант туманного транспорта) и p. E292V (мутант нарушенного транспорта фосфолипидов), использовались для функциональной характеристики эффектов мутантов в линии клеток легочного эпителия (клетки A549) (Wambach et al., 2016; Hu et al., 2020; Wambach et al., 2020). Эти исследования помогли установить, как белки из каждого механистического класса мутантов перемещаются по клетке, влияют на формирование ламеллярных тел и транспортируют фосфатидилхолин. Выявление специфических для каждого варианта механицизмов может помочь в определении течения заболевания или терапевтического подхода.

Иммортализованные линии легочных эпителиальных клеток с характеристиками AEC2s, такие как клетки A549, являются модельной системой первой линии, поскольку их легко выращивать и поддерживать, они образуют пластинчатые структуры, похожие на тела, которые можно визуализировать с помощью электронной микроскопии, и легко трансдуцируются вирусными векторами. Клетки A549 ABCA3 -/- являются устоявшимися и не имеют хорошо развитых пластинчатых тело-подобных структур (Wambach et al., 2020). Однако основным ограничением для опухолевых клеточных линий, таких как A549, является то, что они не производят сурфактант. Альвеолярные клетки должны дифференцироваться, чтобы производить сурфактант и экспрессировать SP-C - общий маркер, используемый для идентификации AEC2.

Органоиды альвеолярных эпителиальных клеток, полученные из эмбриональных или плюрипотентных стволовых клеток человека, генерируют в культуре альвеолосферы, которые проявляют функциональные свойства AEC2s. Эти клетки могут пролиферировать, дифференцироваться и модифицироваться, чтобы охватить аномальные фенотипы дисфункции сурфактанта (Jacob et al., 2017; Jacob et al., 2019). Органоиды iPSC, полученные от пациента с дефицитом SP-B, отражают фенотип заболевания, включая снижение выработки сурфактанта. Этот дефект был восстановлен при трансдукции лентивирусным вектором, несущим SFTPB, включая правильное формирование ламеллярных тел (Leibel et al., 2019). В целом, органоиды AEC2 являются полезной моделью для оценки стратегий восстановления функции компонентов сурфактанта.

Измерение восстановления функции сурфактанта является сложной задачей. Для подтверждения присутствия сурфактантных белков в клеточных лизатах или секретах обычно проводят количественное определение сурфактантных белков B и C. Измерение транспорта фосфолипидов с помощью высвобождения дипальмитилфосфатидилхолина (ДПФХ) является одним из методов оценки производства сурфактанта (Jacob et al., 2017). Такие приборы, как пульсирующий пузырьковый сурфактометр, могут быть использованы для измерения свойств снижения поверхностного натяжения клеточных секретов.

Были созданы мышиные модели каждого из этих генетических заболеваний на основе сурфактанта. У мышей с нокаутом SP-B развивается тяжелый респираторный дистресс, они умирают через несколько часов после рождения и демонстрируют плотные, аномальные пластинчатые тела, похожие на органеллы (Clark et al., 1995; Stahlman et al., 2000). Восстановление SP-B с помощью вектора AAV повысило выживаемость условно нокаутных мышей SP-B (Kang et al., 2020). Альтернативно, мыши с нокаутом SP-C жизнеспособны и могут дожить до взрослого возраста. Они продуцируют ламеллярные тельца и сурфактантные белки A, B и D. Фенотипические реакции включают снижение стабильности сурфактанта при малых объемах, пневмонит и эмфизему (Glasser et al., 2001; Whitsett and Weaver, 2002). Мыши с нокаутом ABCA3 имеют такой же исход, как и мыши с нокаутом SP-B, и не выживают (Ban et al., 2007; Fitzgerald et al., 2007). Также были получены условно нулевые мыши с ABCA3 (Besnard et al., 2010).

Генотерапия нарушений функции сурфактанта, вызванных патогенными вариантами в SFTPB, SFTPC и ABCA3, теперь вполне осуществима. Создание вектора доставки для добавления генов или редактирования генов требует тщательного рассмотрения дизайна вектора, кассеты экспрессии трансгена, используемых доклинических моделей и анализов для оценки коррекции выработки и функции сурфактанта.