Благодаря открытиям в области молекулярной биологии и геномики, исследователи, работающие bench-to-bedside, теперь располагают ресурсами для разработки эффективных методов генотерапии широкого спектра наследственных заболеваний. Огромный прогресс был достигнут в лечении аутосомно-рецессивных расстройств, поскольку эти состояния могут использовать уникальный терапевтический подход добавлнения гена, когда доставка экзогенных генов может восстановить здоровую биологическую функцию. Эта тенденция подчеркивается недавним бумом клинических испытаний генотерапии, включая одобренный FDA voretigene neparvovec (Luxturna), первый одобренный препарат для лечения RPE65-связанной дистрофии сетчатки (1-6). К сожалению, аутосомно-доминантные (AD) заболевания, при которых для развития болезни требуется только один мутантный аллель, не всегда отвечают на подобные стратегии, особенно когда мутантные белки неправильно функционируют, оказывая пагубное воздействие (негативное усиление функции) (7).

Несколько технологий были широко изучены на предмет их возможностей для лечения заболеваний AD, таких как малые интерферирующие РНК (siRNAs), короткие шпилечные РНК (shRNAs), анти-смысловые олигонуклеотиды (ASOs), нуклеазы с эффекторами, подобными активаторам транскрипции (TALENs), нуклеазы с цинковыми пальчиками (ZFNs) и стратегии, основанные на кластеризованных регулярно перемежающихся коротких палиндромных повторах (CRISPR) (Таблица 1). Эти стратегии, однако, имеют уникальные ситуационные ограничения. Например, patisiran, siRNA для лечения transthyretin (ATTR) amyloidosis, был одобрен FDA, но требует повторных доз каждые 3 недели (8). Между тем, ASO могут вызывать пропуск экзонов при мышечной дистрофии Дюшенна, но белок должен функционировать в укороченной форме, что ограничивает его применение (9, 10). Идеальные терапевтические средства для лечения заболеваний AD должны корректировать патологию на геномном уровне таким образом, чтобы быть одновременно мутационно-агностичными (способными устранять многочисленные мутации, связанные с заболеванием) и аллель-специфичными (способными различать больные и здоровые аллели). CRISPR-ассоциированное (Cas) эндонуклеазное редактирование быстро заняло лидирующие позиции в терапии благодаря своей универсальности, эффективности и устойчивому эффекту, что привело к применению CRISPR/Cas для лечения ATTR и бокового амиотрофического склероза (ALS) in vivo (11-13).

Table 1

Достижения в области точных инструментов геномной инженерии на основе CRISPR, таких как редакторы оснований и праймеров, сыграли решающую роль в повышении безопасности и эффективности. Аналогичным образом, варианты Cas освободили системы CRISPR от жесткой зависимости от протоспейсер-примыкающего мотива (PAM) и ограничений по упаковке, значительно расширив потенциал для трансляционных подходов. В данном обзоре подробно описываются последние достижения в области стратегий на основе CRISPR для коррекции широкого спектра нарушений AD и рассматриваются их потенциальные будущие направления. Кроме того, мы подчеркиваем влияние этих достижений на процесс принятия решений при разработке прецизионной терапии, предоставляя "дорожную карту" для выбора стратегии. (Figure 1).



Figure 1 CRISPR/Cas road map for the development of autosomal dominant therapeutics. Decision-making tree that allows researchers to determine the most appropriate therapeutic editing strategy based on responses to a series of questions. This decision tree is particularly for dividing cells and requires substantial amendments for adaptation to nondividing cells, including the removal of HDR and the inclusion of alternative approaches such as homology-independent targeted insertion (HITI) and precise integration into target chromosome (PITCH). It is also important to note that this tree is not exhaustive and parallel decisions must also be considered, such as off-targeting specificity and vector cargo limitations. Note: When deciding which CRISPR-based technology to use, it is important to evaluate each experimental design individually. Critical considerations include in vivo delivery strategies and delivery capacities, off-targeting rates, and editing efficiencies.

Стратегии редактирования CRISPR/Cas основаны на двух ключевых компонентах: эндонуклеазе Cas, сконструированной таким образом, чтобы вызывать двунитевые разрывы (DSB) или однонитевые разрывы (SSB) ДНК, и одной направляющей (гид) РНК (sgRNA) для направления фермента Cas к сайту мишени (14). Эти sgРНК предназначены для комплементарного связывания целевой последовательности ДНК - протоспейсера - и пространственно консервативны по отношению к PAM. Последовательность PAM, необходимая для ферментативной активности, зависит от типа используемого Cas: Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9) распознает 5'-NGG-3' PAM, где N представляет собой любую потенциальную пару оснований, а Staphylococcus aureus Cas9 (SaCas9) распознает 5'-NGRRT-3' PAM, где R - пурин (A или G) (15). Хотя ранние итерации систем CRISPR/Cas использовались как инструменты для фундаментальных исследований, признание терапевтического потенциала этой технологии быстро привело к появлению таких разработок, как HDR-опосредованное редактирование, редакторы оснований и праймеров, стратегии удаления и замены, редактирование SNP и Cas-опосредованная регуляция транскрипции.

HDR-опосредованное редактирование при дистрофии роговицы и буллезном эпидермолизе. В последние годы стратегии CRISPR, основанные на гомологически-направленной репарации (HDR), получили значительное распространение благодаря своему терапевтическому потенциалу. Эти системы направлены на прямое редактирование последовательности до здорового состояния WT путем совместной доставки системы CRISPR/Cas с шаблоном для HDR, включающим желаемую последовательность WT, фланкированную двумя рукавами, гомологичными нативной нити ДНК (16-18). Индуцируя CRISPR/Cas-опосредованные DSBs, эндогенные механизмы репарации ДНК могут распознать гомологичные регионы шаблона HDR как родные и смоделировать процесс репарации на этом здоровом шаблоне. Как одиночными CRISPR-, так и двойными CRISPR-индуцированные DSBs могут опосредовать этот процесс; последние, как было продемонстрировано, обеспечивают более высокую эффективность при использовании больших шаблонов HDR (19). По сравнению с негомологичным концевым соединением (NHEJ), путь репарации HDR является более точным и обеспечивает более низкую частоту indels, но остается менее эффективным в пост-митотических клетках, что потенциально ограничивает возможности трансляционного применения (20). Следовательно, терапия ex vivo, позволяющая проводить клональную селекцию и реинфузию, может получить наибольшую пользу от этой стратегии. Несмотря на эти недостатки, критические разработки в отношении конструкций CRISPR/Cas привели к проведению нескольких клинических испытаний, основанных на HDR для лечения различных заболеваний AD.

Гранулярная дистрофия роговицы (GCD) - это AD заболевание, характеризующееся неравномерным отложением гранулярных помутнений в строме роговицы. Для лечения GCD, связанной с TGF-β-индуцируемым геном (TGFBI), Taketani и др. применили in vitro одноцепочечную олигодезоксинуклеотидную (ssODN) систему шаблонов HDR, основанную на Cas9/sgRNA-опосредованных DSB, нацеленной на мутацию R124H в TGFBI (21). Благодаря включению мутации R124H в спейсерную последовательность sgRNA, эта разница в 1 пару оснований позволяет системе различать мутантный и WT аллели, направляя разрезание Cas9 на мутантный аллель. Аллельная специфичность несоответствия в 1 пару оснований была ранее продемонстрирована на эмбриональных фибробластах крысы, фибробластах человека и индуцированных плюрипотентных стволовых клетках (22-24). Кроме того, было показано, что ssODN обеспечивают лучшее редактирование, чем их двухцепочечные аналоги. Используя шаблон ssODN, Taketani и др. достигли 20,6% эффективности редактирования in vitro при гетерозиготных и 41,3% при гомозиготных мутациях без каких-либо внецелевых эффектов в участках, которые, по прогнозам, являются наиболее восприимчивыми на основе сходства последовательностей (21).

Описанная выше стратегия, также называемая "near the PAM", может быть очень полезной при конструировании аллель-специфических систем, но имеет несколько предостережений. Во-первых, мутантные пары оснований должны находиться в непосредственной близости от подходящего сайта PAM. Во-вторых, несовпадения одной пары оснований между мутантным и WT-аллелями может быть недостаточно для предотвращения расщепления WT-аллеля, что может вызвать нежелательные NHEJ и indels (25). Поэтому каждый потенциальный терапевтический препарат требует скрининга окружающего генома на наличие жизнеспособных сайтов PAM, а также аллельной специфичности, ни одно из которых не гарантировано. Аналогичный подход к конструированию аллель-специфичных систем заключается в том, что система CRISPR/Cas конструируется вокруг уникального PAM, создаваемого мутацией. Этот подход, называемый "in the PAM", был использован Courtney и др. для достижения аллель-специфического HDR-опосредованного редактирования с помощью нового PAM, созданного мутацией KRT12 (26). Однако, как и стратегия near-the-PAM, стратегия in-the-PAM зависит от вероятности того, что мутация генерирует уникальный PAM. Кроме того, PAM должен быть уникальным по сравнению с нативной последовательностью, чтобы предотвратить ферментативное расщепление WT-аллеля. Например, нативная последовательность NAG, преобразованная в NGG в результате точечной мутации, все равно может привести к расщеплению нативной нити NAG под действием SpCas9, как показали Kleinstiver и др. (27).

Хотя разработка ssODNs в качестве шаблонов в последние годы повысила эффективность HDR-редактирования, эффективность остается относительно низкой. Поскольку HDR происходит в G2 и S фазах клеточного цикла, этот подход наиболее применим для исследований ex vivo или in vivo в высоко-пролиферативных клеточных нишах. Кроме того, доставка шаблона in vivo остается серьезным препятствием для его применения. Вне-целевые эффекты остаются серьезной проблемой безопасности при использовании DSB-подходов, а высокие уровни интеграции адено-ассоциированного вируса (AAV) наблюдались при Cas9-индуцированных DSB (28, 29). Поэтому DSB-независимые последовательные шаги (итерации) технологии CRISPR/Cas, которые демонстрируют высокую эффективность редактирования и имеют лучшие показатели безопасности, должны быть широко оценены в качестве потенциальных терапевтических средств (30).

Редакторы для повышения точности при AD заболеваниях. Редактирование оснований и праймеров - это новые инструменты редактирования генома, не зависящие от DSB и клеточного цикла. Обе методологии обеспечивают более высокую эффективность редактирования по сравнению с HDR и имеют улучшенные профили безопасности, поскольку являются методологиями без DSB. Существует два известных класса редакторов оснований: редакторы оснований цитозина (CBEs) и редакторы оснований аденина (ABEs) (31, 32). CBE представляют собой слияние никазы Cas9 (модифицированный вариант, способный к SSBs) с деаминазой и ингибитором урациловой гликозилазы, что позволяет преобразовывать пары оснований C->T. ABEs - это слияние каталитически мертвой Cas9 или никазы Cas9 с двумя аденин-деаминазами тРНК (TadA), способными облегчить трансверсию A->G. Прайм-редактирование основано на использовании оптимизированной обратной транскриптазы вируса мышиной лейкемии Молони (MMLV), слитой с никазой SpCas9, H840A, управляемой prime editing guide RNA (pegRNA), как показано на рисунке 2. В отличие от редактирования оснований, прайм-редактирование может устанавливать все возможные переходы и трансверсии в дополнение к небольшим вставкам и делециям. Хотя редактирование праймеров может иметь несколько более высокую частоту indels, оно значительно повышает гибкость, не приводит к побочным мутациям и меньше зависит от идеального расположения PAM (33). Подробный обзор базового и праймового редактирования приведен в недавних обзорах (30, 34, 35).



Figure 2 Механизм прайм-редактирования. Схема, детализирующая критические этапы механизма действия редактирования праймера с разбивкой на активность Cas9, активацию и функцию RT, стохастические эндогенные механизмы репарации и потенциальные результаты редактирования. (i) Гибридизация протоспейсера между pegRNA и целевой последовательностью ДНК. (ii) Искусственно созданная SpCas9 создает однонитевой разрыв в нити, противоположной нити гибридизации pegRNA". (iii) Гибридизация между последовательностью связывания протоспейсера (PBS) pegRNA" и вновь образованным 3' лоскутом в результате активности никаза. (iv) Обратная транскриптаза добавляет нуклеотиды к новому 3' концу нити ДНК после действия никазы в соответствии с указаниями шаблона для обратной транскрипции (RTT), находящегося рядом с последовательностью PBS. (v) Достигается равновесие между неотредактированным и отредактированным участками, при котором только один из них вставляется обратно в ДНК с помощью эндогенных механизмов репарации ДНК. (vi) Вставка 3' лоскута обратно в ДНК и обрезка 5' лоскута экзонуклеазами приводит к образованию гетеродуплекса, где механизмы репарации несоответствий определяют, будет ли неотредактированная нить ремоделирована в ответ на правку, или же правка будет отменена с неотредактированной нити в качестве шаблона. Этот процесс может быть смещен в пользу включения правки путем введения sgRNA, которая вырезает неотредактированную нить, увеличивая репарацию несоответствий и повышая эффективность редактирования. Адаптировано из работы da Costa et al. (30).

Ранее редактирование оснований использовалось in vivo для улучшения состояния AD на модели синдрома Хатчинсона-Гилфорда-Прогерии (HGPS). Редкое генетическое заболевание, HGPS характеризуется ускоренным старением и короткой продолжительностью жизни. Лентивирусная доставка ABE эффективно корректировала фибробласты, полученные от пациентов, что привело к восстановлению нормального сплайсинга, снижению уровня белка прогерина и восстановлению ядерной морфологии (36). Кроме того, при использовании sgRNA, нацеленной на LMNA, и редактора ABE7.10max-VRQR не было обнаружено редактирования ДНК или РНК вне мишени. Чтобы продемонстрировать возможность переноса своей работы в клинику, Koblan и др. использовали двойную AAV9-опосредованную доставку split-intein base редактора и sgRNA, нацеленной на LMNA, в мышиную модель прогерии (36). Ретро-орбитальная инъекция терапевтического редактора оснований AAV на 14-й постнатальный день увеличила среднюю продолжительность жизни с 215 до 510 дней, а у обработанных прогерином мышей была устранена ошибка сплайсинга транскрипта LMNA, снижен уровень белка прогерина, улучшена патология аорты и повышена жизнеспособность (36). Между тем, Lim и др. также применили CBEs с помощью подхода с расщепленным белком для введения нонсенс-мутаций и выведения из строя гена SOD1 при ALS, добившись высокой эффективности редактирования в клетках спинного мозга, успешно трансдуцированных и экспрессирующих полный редактор (37). Поскольку прайм-редактирование все еще является зарождающейся технологией, возможности лечения нарушений AD in vivo ограничены. Однако прайм-редактирование уже применялось для разработки нескольких моделей заболеваний in vitro и in vivo, включая PPP2R5D-ассоциированную умственную отсталость и STAT1-ассоциированные иммунные нарушения (38, 39). Используя эту технологию, Lin с коллегами разработали мышиную модель доминантного заболевания катаракты, несущую патогенную делецию в экзоне 3 гена Crygc, и отредактировали клетки N2A, полученные из этой модели, до здорового состояния с помощью прайм-редактирования. Исследователи наблюдали эффективность до 33,3% и представили доказательства терапевтических возможностей прайм-редактирования (40).

Редакторы также применяются in vivo для редактирования РНК, что является привлекательной альтернативой редактированию ДНК благодаря меньшему количеству внецелевых событий и лучшему профилю безопасности (41). Разработанный Cox и др. метод редактирования РНК для программируемой замены A на I (REPAIR) основан на слиянии мертвой Cas13b (dCas13a) с доменом ADAR2 аденозиндезаминазы. В клетках, трансфицированных кДНК, кодирующей мутантный белок FANCC, связанный с аутосомно-доминантной анемией Фанкони, исследователи снизили уровень транскрипта мутанта на 23% (42). Аналогичным образом был разработан цитозиновый редактор РНК под названием RESCUE путем слияния dCas13 с эволюционировавшим ADAR2, способным к цитидиндеаминазной активности (43). Хотя оба метода требуют дальнейшей оптимизации для клинического применения, их преходящие и обратимые эффекты, которые делают их более безопасными кандидатами, также снижают их терапевтический потенциал, поскольку длительная экспрессия редактора необходима для поддержания терапевтического эффекта на транскриптомном уровне, что вызывает иммуногенные проблемы и требует повторного дозирования. Следовательно, оценки этой технологии in vivo, особенно для лечения AD заболеваний, значительно ограничены.

Хотя редакторы оснований и праймеров являются новыми последовательными шагами разработки систем CRISPR/Cas, прилагаются значительные усилия для их усовершенствования. Совсем недавно были разработаны редакторы оснований, которые могут устанавливать выбранные мутационные трансверсии (точечные мутации C->A и C->G), что расширяет их применение для лечения AD заболеваний (44-46). Кроме того, ряд групп разработали двух-функциональные редакторы оснований, которые объединили функции редакторов оснований аденина и цитозина, позволяя одновременно вводить мутации C->T и A->G (47-49). Несмотря на высокую эффективность редактирования с минимальными вне-целевыми эффектами, редакторы оснований и праймеров остаются ограниченными из-за их мутационно-специфического подхода. Однако мультиплексное или одновременное редактирование с помощью CRISPR/Cas9 безопасно и осуществимо и было применено в подходах, не зависящих от DSB (48, 50). Новое, но захватывающее технологическое достижение, редактирование twin prime, может вводить большие последовательности ДНК специфическим образом (51). Кроме того, было показано, что эффективность HDR снижается с увеличением размера шаблона, а доставка все более крупных шаблонов остается трансляционной проблемой (52).

Ablate-and-replace CRISPR/Cas при пигментном ретините. Для разработки более идеальной терапии, способной устранить все патогенные мутации независимо от их близости к PAM, исследователи начали применять стратегию "ablate and replace". В этом методе мутантный и WT аллели уничтожаются с помощью CRISPR/Cas9-индуцированного NHEJ и заменяются здоровой кДНК, устойчивой к CRISPR, для поддержания биологической функции (53). В отличие от предыдущих стратегий in-the-PAM и near-the-PAM, sgRNA для этой системы не должна быть аллель-специфичной, но она должна быть нацелена на экзон, чтобы обеспечить сдвиг и нарушение рамки считывания. Между тем, чтобы гарантировать, что удаление нативного гена происходит при сохранении здоровой кДНК, в кДНК обычно вводятся "молчащие" мутации. Добавление "молчащих" мутаций направлено на изменение либо сайта PAM, либо последовательности протоспейсера, на которую нацелена направляющая РНК (гид РНК), необходимая для устранение гена, что было продемонстрировано Paquet и др. на стволовых клетках человека (54). Важно отметить, что это соображение о дизайне "молчащей мутации" может быть применено и к стратегиям HDR и редактора для предотвращения последующего расщепления и образования нежелательных indels.

Одно из применений этой стратегии используется для лечения связанного с родопсином AD пигментного ретинита (RP). Родопсин, светочувствительный G-белок-связанный рецептор, критически важен для функции фоторецепторов и был связан с несколькими AD нарушениями (55-58). Для лечения мутаций в родопсине мутационно-диагностическим способом Tsai и др. разработали стратегию "удаления и замены", которая основана на двойной системе AAV для доставки устойчивой к CRISPR кДНК и двух направляющих РНК, нацеленных на экзон 1 гена родопсина, RHO (59). Для обеспечения максимальной безопасности один AAV доставляет последовательность Cas9, а другой AAV совместно доставляет две sgRNAs и гуманизированную кДНК родопсина, гарантируя, что абляция происходит только в случае добавления гена. Чтобы сделать кДНК устойчивой к CRISPR, в сайты PAM, на которые нацелены sgRNAs, были введены молчащие мутации, предотвращающие расщепление Cas (59). В мышиных моделях RP RHO^P23H/P23H, RHO^P23H/+ и RHO^D190N/+ исследователи продемонстрировали значительное сохранение наружной ядерной толщины в обработанных глазах и функциональное восстановление с помощью электроретинографии. Уровень эндогенной мРНК мыши был снижен только в результате абляции, что было определено с помощью количественной ПЦР, в то время как уровень мРНК RHO человека был повышен в результате доставки кДНК. Переходные уровни мРНК измерялись вместо белка, поскольку коммерческие антитела, специфичные для мышей и людей, недоступны. Недавно Wu и др. также провели лечение новой гуманизированной мышиной модели родопсин-связанного RP C110R методом ablate-and-replace, что позволило доказать концепцию и подчеркнуть способность этой стратегии лечить несколько патогенных мутаций одним терапевтическим методом (60). d

Как и в случае с редакторами и HDR, стратегия ablate-and-replace имеет ограничения и ситуационные недостатки. Во-первых, для ablate-and-replace требуется добавление генов, что не всегда возможно, учитывая размеры различных генов и ограничения упаковки распространенных векторов, таких как AAVs и лентивирусы. Во-вторых, поскольку удаляется эндогенный здоровый аллель, необходима длительная экспрессия кДНК. Однако несколько исследований показали, что экспрессия кДНК может снижаться со временем, особенно в делящихся клетках (61, 62). Кроме того, избыточная экспрессия трансгена может оказаться токсичной и не позволяет получить несколько альтернативно сплайсированных вариантов. Наконец, эктопическая экспрессия дополненного белка может быть проблематичной, как это продемонстрировали Pellissier и др. при экспрессии белка hCRB1-A в AAV-трансдуцированных моделях мышей (63). В результате ablate-and-replace зарезервирована для генов, достаточно маленьких для дополнения и достаточно гибких для промотора, лучше всего применима к неделящимся клеткам и должна иметь компоненты кДНК, предназначенные на долгосрочную экспрессию. Хотя в случае с интегрирующими терапевтическими препаратами правила FDA более строгие, подходы по интеграции с геномом хозяина для обеспечения устойчивого геномного дополнения могут оказаться решающими в будущих клинических исследованиях, направленных на борьбу с заболеваниями в делящихся клетках.

SNP editing in Huntington's disease and severe congenital neutropenia. Хотя стратегия абляции и замены обладает большей универсальностью по сравнению с конструкциями CRISPR/Cas, разработанными на основе in- или near-the-PAM, трансляционный аспект этой терапии сильно сдерживается ограничениями по размеру доставки кДНК и проблемами долгосрочной экспрессии. Следовательно, селективное устранение мутантного аллеля при сохранении здорового аллеля остается привлекательным подходом. Естественно встречающиеся гетерозиготные однонуклеотидные полиморфизмы (SNPs) недавно стали приоритетными мишенями для разработки стратегий, специфичных для аллелей. Хотя эти SNP могут не вызывать заболеваний, SNP, тесно связанные с мутациями, вызывающими заболевания, могут создавать аллель-специфические протоспейсерные последовательности и сайты PAM, подобные конструкциям in-the-PAM и near-the-PAM. Например, при кератин 12-ассоциированной (KRT12-ассоциированной) эпителиальной дистрофии роговицы Meesmann Кортни (Courtney) и др. нацеливали на уникальный PAM, созданный SNP, на селективное удаление мутантного аллеля, индуцируя NHEJ в 38,5% секвенированных клонов (26). Однако при разработке стратегий редактирования SNP важно отметить, что положение несоответствия в протоспейсере может существенно влиять на аллельную специфичность, поскольку несоответствия на 5' концах направляющих РНК могут хорошо переноситься и приводить к расщеплению здорового аллеля, как продемонстрировали Fu и др. (64).

Для повышения эффективности пара направляющих РНК, нацеленных на разные SNP, может вызвать целевую делецию гена путем NHEJ, которая делает мутантный аллель бесполезным, сохраняя его WT аналог (65). Подробная механистическая схема представлена на рисунке 3. Чтобы подчеркнуть потенциальное применение такого редактирования SNP при AD заболеваниях, Monteys и др. подробно описали систему двойных sgRNAs CRISPR/Cas9 для лечения болезни Хантингтона (66). Проведя скрининг почти пятидесяти 5' и 3' SNP, фланкирующих экзон 1 человеческого гена HTT, исследователи разработали пару sgRNA, которые продемонстрировали высокую аллельную специфичность, минимальные вне-целевые эффекты и надежную эффективность ^{in vitro}. Эта система была проверена на трансгенной мышиной модели болезни Хантингтона, несущей мутации в гене HTT; после локальной вирусной инъекции в правом полушарии мозга наблюдалось значительное снижение мРНК и белка HTT по сравнению с контралатеральным полушарием, не подвергавшимся лечению (67).



Figure 3 SNP editing for the mutation-agnostic, allele-specific treatment of autosomal dominant disorders. SNP editing has the potential to treat multiple mutations with a single therapeutic, relying on the selective ablation of the mutant allele by targeting CRISPR/Cas systems to allele-specific SNPs. Upstream and downstream SNPs flanking regions of high pathogenic mutations can be used to selectively create CRISPR/Cas systems and induce a targeted deletion that ablates allele expression.

Аналогичным образом, Christie и др. представили аллель-специфическую стратегию направленной делеции аутосомно-доминантной дистрофии роговицы TGFBI. Нацеливаясь на гетерозиготный 5' SNP для различения аллелей, они использовали общую интронную 3' sgRNAs, чтобы минимизировать размер целевой делеции и максимизировать скорость делеций. Поскольку область, на которую нацелена 3' sgRNA, является интронной, пагубное влияние NHEJ-индуцированных сдвигов рамки считывания в WT-аллеле смягчается и, как ожидается, будет хорошо переноситься (67). С помощью этой системы Christie и коллеги продемонстрировали аллельную специфичность своей 5' sgRNA (до 99% NHEJ сцеплены с правильным аллелем) и успешную направленную делецию в клеточных линиях лимфоцитов, полученных от пациентов, заложив основу для будущих терапевтических подходов к редактированию SNP. Редактирование SNP также было успешно применено in vitro для устранения мутаций в гене ELANE, связанных с тяжелой врожденной нейтропенией. Ранее было показано, что эти преимущественно AD нарушения вызывают дефекты выживания и созревания клеток в гемопоэтических стволовых клетках костного мозга, которые восстанавливаются при CRISPR/Cas9 нокауте ELANE, как продемонстрировали Makaryan и др. (68). Поскольку количество SNP, фланкирующих ELANE, ограничено, Sabo и др. решили использовать специфичную для 3'-UTR SNP sgRNAs (rs1683564) в сочетании с не-аллель-специфичной sgRNAs, нацеленной на интрон 4 (69). Здесь исследователи подтвердили, что аллель-специфическое редактирование устранило клеточные аномалии и увеличило пролиферацию на 41% в клетках CD34+, предоставив дополнительные доказательства терапевтического редактирования SNP.

Несмотря на огромный потенциал применения этих стратегий редактирования SNP в трансляционной терапии, редактирование SNP имеет свои ограничения. Как и стратегии in- и near-the-PAM, редактирование SNP также страдает своей универсальностью в результате случайной зависимости от близости к сайту PAM или создания нового PAM. Распространенность SNP в популяциях пациентов также повлияет на количество пациентов, подходящих для лечения. Также нет гарантии, что двойное расщепление будет постоянно приводить к целевой региональной делеции, и это должно проверяться для каждой пары кандидатов sgRNAs. Поскольку речь идет о стратегии селективной абляции, ген должен быть гаплонедостаточным, что позволит оставшемуся аллелю сохранять биологическую функцию. Наконец, важно отметить, что данная методология зависит от генетического секвенирования пациента, чтобы убедиться, что он или она несет целевой SNP(s), а определение связи SNPs и мутаций (цис или транс) может оказаться проблематичным.

dCas9 fusions for transcriptional regulation in early-onset obesity. Хотя рассмотренные до сих пор методики основаны на прямом редактировании ДНК или РНК, альтернативные подходы, регулирующие транскрипцию без внесения правок или разрывов генома, по своей сути имеют более безопасные профили. В результате, системы CRISPR/Cas были исследованы на предмет их способности регулировать экспрессию генов. Эти системы состоят из стандартной sgRNA и каталитически неактивной dCas9, слитой с транскрипционными или хроматиновыми эффекторными доменами, ответственными за регуляцию целевого гена (генов). Широко известны два основных подхода: использование эффекторов для модификации структуры хроматина с целью увеличения или уменьшения доступности и, таким образом, увеличения или уменьшения экспрессии, и использование активаторов или репрессоров транскрипции для соответствующей модуляции экспрессии.

При AD нарушениях, характеризующихся гаплонедостаточностью, активация CRISPR (CRISPRa) или повышение экспрессии генов предлагает уникальный терапевтический подход. Используя CRISPR-dCas9, соединенный с доменом транскрипционного активатора VP64, Maeder и др. продемонстрировали способность этой технологии одновременно и синергично регулировать несколько генов in vitro (70). В отличие от мутаций с усилением функции, мутации с потерей функции в гаплонедостаточных генах, ассоциированных с AD нарушениями, могут получить преимущества от не-аллель-специфической активации. Используя системы CRISPRa, нацеленные как на промотор, так и на энхансер SIM1 в мышиной модели AD ожирения, Matharu и др. наблюдали эффективное и специфическое повышение уровня мРНК SIM1, а также статистически значимое снижение веса мыши (71). В данном случае неспецифическое усиление имеет явный терапевтический эффект, а его свобода от аллель-специфических стратегий позволяет расширить потенциальное применение. Более того, эта система обладает потенциалом для лечения полигенных заболеваний и может быть использована для регулирования целых генных сетей, как было первоначально показано Maeder и др. и воспроизведено Bester и др. (70, 72). Между тем, CRISPR-интерференция (CRISPRi), разработанная Qi и др., или подавления экспрессии генов может быть эффективным инструментом для нарушения транскрипционной активации и подавления экспрессии генов (73). Подобно редактированию SNP или подходам in/near-the-PAM, дифференцируемый SNP или мутация могут быть направлены на достижение аллель-специфического вмешательства и подавления мутантного гена, как это было исследовано Mandegar и коллегами (74). Ранее было продемонстрировано, что CRISPRi обладает меньшей толерантностью к несоответствиям, чем нуклеаза Cas9, поэтому она может лучше различать здоровые и мутантные аллели, что необходимо для оценки AD заболеваний in vivo (75).

Ключевым преимуществом CRISPRa является способность повышать экспрессию генов, которые просто слишком велики для традиционных подходов по увеличению генов. Хотя для небольших гаплонедостаточных генов можно использовать любой из этих подходов, гены, которые превышают пределы упаковки для доставки кДНК, являются отличной мишенью для терапевтических исследований. Кроме того, CRISPRi имеет явное преимущество в обратимом подавлении по сравнению с каталитически активными CRISPR/Cas9 терапиями. Однако обе технологии имеют ряд ограничений. Хотя для AD заболеваний могут быть созданы аллель-специфичные конструкции, регуляция транскрипции также зависит от вероятности наличия подходящего сайта PAM или распространенности SNP. Кроме того, для устойчивого терапевтического эффекта необходима длительная экспрессия фермента Cas9, что может быть проблематичным, учитывая активно обсуждаемые вопросы относительно долгосрочной иммуногенности (76-79). Наконец, эффективность этих стратегий, как правило, ниже, чем у ферментативно активных нуклеаз Cas9, что требует значительной оптимизации (80, 81).

Хотя эти различные системы CRISPR/Cas отличаются своими ситуационными преимуществами, фермент Cas остается общим знаменателем. Недавние усовершенствования вариантов Cas произвели революцию в CRISPR/Cas-конструкциях при AD заболеваниях. Хотя эти ферменты часто применяются избирательно из-за их уникальных функциональных преимуществ, ограничения по размеру, обусловленные емкостью вектора, стали основным фактором в трансляционных системах. Следовательно, многие усилия направлены на повышение эффективности доставки и грузоподъемности векторов. Добиваясь большей эффективности CRISPR/Cas систем за счет новых компактных конструкций и инновационных векторов, исследователи также добились значительного прогресса в повышении безопасности этих систем за счет минимизации вне-целевых эффектов, само-завершающихся конструкций и др.

Cas variants and expansion beyond PAM restrictions. Хотя сегодня наиболее предпочтительным вариантом CRISPR/Cas широко считается SpCas9, в последние годы внимание привлекают различные ортологи благодаря своим потенциальным преимуществам. SaCas9, например, является компактным ортологом SpCas9, который нацелен на NNGGGT PAM, в отличие от NGG SpCas9 (82). Аналогично, NmCas9, полученный из Neisseria meningitidis, нацелен на 5'-NNNNNGATT-3', что, как считается, обеспечивает большую специфичность из-за дополнительной сложности последовательности PAM (83). Множество инженерных разработок, таких как направленная эволюция Cas9, также были нацелены на модификацию этих ферментов, в результате чего появились такие продукты, как eSpCas9 - улучшенная нуклеаза с заряженной канавкой для стабилизации нитей ДНК, обеспечивающая большую специфичность и меньшее количество внецелевых эффектов (84). Аналогичным образом, SpCas9-VQR, xCas9 и многие другие инновации являются прямыми продуктами направленной эволюции. Эти варианты и их характеристики обобщены в разделе Table 2.

Table 2

Хотя оптимизация эффективности и специфичности Cas всегда была одним из главных приоритетов, все эти инновации по-прежнему ограничены специфическими для Cas ограничениями PAM. Несмотря на растущий список PAM-мишеней, дающих исследователям большую универсальность и доступ к человеческому геному, регионы остаются недоступными для CRISPR. В связи с этим Walton и др. попытались вывести эти Cas-ферменты за пределы их PAM-ограничений, охарактеризовав почти лишенный PAM вариант Cas9. Используя структурно-направленную инженерию, исследователи разработали мощный вариант SpG Cas, способный нацеливаться на NG PAM с высокой точностью (85). Аналогичным образом, эта группа также создала еще более обобщенный вариант Cas - SpRY, который способен вызывать высокоэффективные разрывы, нацеленные на NRN (R представляет пурины A и G), с менее эффективным расщеплением на NYN PAM (Y представляет пиримидины C и T), приближаясь к практически безграничному варианту PAM (85). Из заранее определенного списка потенциальных сайтов, не являющихся мишенями, исследователи наблюдали скромное увеличение активности, которая соответствует историческим уровням нецелевого действия WT SpCas9. Хотя для анализа полногеномной вне-целевой активности необходимо провести последующие исследования, возможно, что специфичность, обеспечиваемая спейсером из 20 пар оснований, может смягчить дополнительные вне-целевые эффекты, ожидаемые при ослаблении PAM и увеличении числа потенциальных интерактивных сайтов.

При выборе вариантов Cas для терапевтического применения необходимо учитывать несколько ключевых моментов: скорость, последовательность PAM, специфичность и размер кДНК варианта. Оптимальным вариантом Cas для лечения AD нарушений и других заболеваний будет компактный, мощный, высокоспецифичный и неограниченный фермент, способный редактировать весь геном человека. Эти инновации расширяют универсальность CRISPR и устраняют разрыв между терапией и геномной инженерией.

Developments in vector technologies. Создавая более мощные ферменты и выходя за рамки традиционных ограничений PAM, исследователи также разработали векторы, способные эффективно доставлять все более крупные грузы для этих систем CRISPR/Cas с большей специфичностью. В то время как конструкции могут оказаться высокоэффективными in vitro, локализованная и эффективная доставка in vivo остается ограничением для многих систем. Следовательно, такие методологии, как направленная эволюция, стали широко применяться для разработки новых векторов, вирусных и невирусных, способных решать эти проблемы.

Используя направленную эволюцию на разных видах, Tabebordbar и др. синтезировали MyoAAV - новый AAV с мотивом RGD, способный осуществлять мощную доставку генов в мышцы (86). Сначала подготовив библиотеку вирусных капсидов, содержащую различные структурные мутации и мотивы с уникальной идентифицирующей полезной нагрузкой, исследователи провели последующие раунды инъекций in vivo (направленная эволюция) мышам и не-человекообразным приматам и собрали капсиды из тканей, усиливая геномные идентификаторы для определения субпопуляций капсидов с наилучшей трансдукцией. В результате этих усилий MyoAAV и несколько других кандидатов были определены с учетом их потенциала для доставки грузов редактирования генов, направленных на лечение таких заболеваний, как мышечная дистрофия. Эта методология была распространена на широкий спектр приложений, таких как повышение тропизма к сетчатке глаза, улучшение специфичности гепатоцитов и многое другое для вирусных и невирусных векторов (86-88). Новые AAV для улучшения специфичности и эффективности трансдукции, такие как EC71, MV50 и NHP#26, остаются критическими точками инноваций для перевода CRISPR-терапевтических препаратов в клинику (89-91).

Хотя варианты Cas могут потенциально уменьшить размер полезной нагрузки, некоторые системы и редакторы остаются слишком большими для векторов AAV, несмотря на усилия инженеров, которые по-прежнему ограничены примерно 4,5-5 кб. Тем не менее, стратегии двойных AAV с использованием сплит-интеиновой базы и прайм-редакторов показали хорошую эффективность in vivo (36, 37, 92-94). Кроме того, популярность не-интегрирующих лентивирусных векторов быстро возросла благодаря их большей грузовой емкости (около 8 кб), что лучше всего продемонстрировала разработка лентивирусного вектора, доставляющего белок ALD при Х-сцепленной адренолейкодистрофии (95-97). Более того, хотя опасения по поводу генотоксичности и онкогенеза в интегрирующих лентивирусных векторах добавляют уникальную проблему регулирования FDA, интегрирующие векторы имеют уникальное преимущество - длительную экспрессию, поддерживаемую во время деления клеток, что может быть очень привлекательным для лечения пролиферативных ниш. Однако редакторы могут находиться на пределе упаковки для этих векторов и поэтому могут ограничивать клиническую переносимость из-за снижения титров.

Следовательно, невирусные векторы, способные доставлять большую полезную нагрузку с высокой эффективностью и низкой токсичностью, стали привлекательными кандидатами, особенно для доставки рибонуклеопротеинов (РНП), которые, как было показано, имеют меньше вне-целевых эффектов (98, 99). Липидные наночастицы (ЛНП), способные доставлять белок Cas9 и направляющие РНК, необходимые для терапии, были продемонстрированы Finn и др. для достижения надежной доставки in vivo, уничтожения гена транстиретина в печени мыши и снижения уровня белка в сыворотке крови более чем на 97% в течение как минимум 12 месяцев (100). Несмотря на высокую эффективность, исследователи наблюдали обнаруживаемые уровни вне-целевого редактирования в периферических тканях - ключевая проблема для ЛНП, учитывая их широкий тропизм. Для решения этой проблемы были разработаны искусственно созданные вирусоподобные частицы (eVLPs), позволяющие преодолеть узкие места в специфичности и одновременно увеличить грузоподъемность. Banskota и др. недавно представили in vivo подход к редактированию оснований, опосредованный eVLP, для успешного снижения уровня белка PCSK9 и частичного восстановления зрения в двух отдельных моделях мышей (101).

Safety considerations in CRISPR/Cas systems. Как видно из проблем интеграции лентивирусов и ответов FDA, безопасность должна быть главным приоритетом CRISPR-терапии. Хотя несколько исследований показали безопасность краткосрочной экспрессии Cas, долгосрочная экспрессия и потенциальные иммунные реакции остаются предметом серьезных споров (76-79). Соответственно, для разрешения этих потребностей были разработаны безопасные конструкции CRISPR/Cas, включая такие концепции, как переходная доставка, опосредованная RNP, промоторы, специфичные для типа клеток, само-завершающиеся системы, защитные переключатели с временной задержкой и модифицированные варианты Cas.

Чтобы создать переходный профиль экспрессии Cas9, Li и др. вставили CRISPR-чувствительную область в основу AAV, на которую нацелены их sgRNA, доставляемые для редактирования генов in vivo. Исследователи продемонстрировали успешное разрушение генома AAV и снижение уровня SaCas9 у инъецированных мышей с системой само-удаления по сравнению с SaCas9-инъецированными мышами без системы само-удаления (102). Кроме того, исследователи продемонстрировали дозозависимое удаление SaCas9 в их ведущей мишени без наблюдаемого эффекта вне мишени, оценивая временной ход этих двух характеристик в течение 4 недель. В векторе AAV "все в одном" Ibraheim и др. также продемонстрировали использование само-инактивирующейся конструкции CRISPR/Cas in vivo для безопасного и эффективного лечения наследственной тирозинемии I типа и мукополисахаридоза I типа (103). Кинетика самоудаления, однако, имеет только один порядок и не поддается настройке. В результате биологи компьютерщики стремятся разработать количественные подходы к моделированию предохранительных выключателей с задержкой по времени, которые изменяют кинетику удаления Cas для обеспечения первоначального терапевтического всплеска с последующим быстрым удалением для смягчения любых вне-целевых или иммунологических эффектов. Один из распространенных подходов либо искусственно вызывает сверхчувствительную связь между стимулом и уровнем белка Cas9, либо использует внутренние временные задержки, уже присутствующие в биологических цепях. К сожалению, вычислительное моделирование этих систем отстает от других крупных достижений, что оставляет возможности для улучшения в ближайшие годы.

Другим элементом безопасности, применимым ко всем системам Cas, является использование модифицированной эндонуклеазы Cas, которая создает два отдельных SSB вместо одного DSB. Для демонстрации этой конструкции Kocher и др. исправили "горячую точку" мутации в экзоне 6 гена KRT14, связанного с генерализованным тяжелым эпидермолизом буллезной формы симплекс, с помощью системы двойных sgRNA, основанной на Cas9n - модифицированной Cas9, способной создавать парные ники (вырезки) на каждой нити целевой последовательности (104). Благодаря созданию двух SSB на расстоянии до 100 п.н. друг от друга, нацеленных на уникальные PAMs в противоположных нитях интрона 7, вероятность достижения вне-целевого редактирования значительно снижается. При обработке полученных от пациентов человеческих кератиноцитов, несущих эту мутацию экзона 6, исследователи наблюдали эффективность HDR до 32%, с частотой коррекции почти 20%, при этом не наблюдалось никаких внецелевых эффектов в заранее определенном наборе генов, наиболее вероятно подлежащих редактированию (104).

Несмотря на растущий арсенал инструментов для модуляции высокоэффективных и безопасных CRISPR-терапевтических препаратов для лечения AD заболеваний, многие регионы генома человека остаются недоступными. От HDR до редакторов оснований и праймеров, каждая крупная разработка направлена на повышение эффективности, универсальности, переносимости или безопасности. Здесь мы подробно описали основы CRISPR-терапии и ее последние разработки в контексте AD нарушений. Хотя были достигнуты значительные успехи в освобождении CRISPR/Cas от жесткой зависимости от PAM, улучшение доступности генома, возможностей доставки векторов и безопасности остаются важнейшими направлениями будущего. Определив эти улучшения, а также существующие пробелы и проблемы, мы надеемся, что предоставили важную справочную информацию, которую исследователи могут использовать для внедрения CRISPR/Cas в клиники и положительно влиять на качество здравоохранения.