Боковой амиотрофический склероз (ALS , также известный как болезнь Лу Герига) и фронтотемпоральная деменция (FTD) - это два смертельных нейродегенеративных заболевания, которые относятся к спектру болезней, имеющих общие клинические, генетические и патологические проявления. ALS поражает верхние двигательные нейроны (UMNs) в моторной коре и нижние двигательные нейроны (LMNs) в стволе головного и спинного мозга [1]. Характерные клинические проявления включают очаговую слабость, распространяющуюся на все 4 конечности и бульбарные мышцы, и гипер-рефлексию. Спектр заболевания варьируется от болезни с преобладанием UMN (первичный боковой склероз [PLS]) до болезни с преобладанием LMN (прогрессирующая мышечная атрофия [PMA]). Около 50% пациентов с ALS могут иметь различные степени когнитивной дисфункции, и примерно у 15% пациентов с FTD может развиться фенотип ALS [2,3]. Более 97% пациентов с ALS и около 50% пациентов с FTD имеют гистопатологические находки агрегации TAR ДНК-связывающего белка 43 (TDP-43) как в пораженных нейронах, так и в глиальных клетках [4-8]. Результаты аутопсии также показали, что дегенерация моторных нейронов кортикоспинального тракта и спинного/бульбарного (продолговатого) мозга сопровождается активацией иммунных клеток (т.е. микроглии, астроцитов и олигодендроглии) в центральной нервной системе (ЦНС) [9,10].

Хотя подавляющее большинство случаев ALSs являются спорадическими (sALS), около 10% случаев являются семейными (fALS) [3] с преимущественно аутосомно-доминантным и редко Х-сцепленным или рецессивным наследованием [11,12]. В 1993 году мутации в гене цитозольной супероксиддисмутазы Cu/Zn (SOD1) были идентифицированы как первая генетическая аномалия при ALS [13]. С тех пор огромные усилия по выявлению мутировавших генов, вовлеченных в патологию ALS, позволили определить более 50 генов и 120 генетических вариантов, которые повышают риск или изменяют фенотип ALS [1,3,11,14]. Анализ молекулярных путей, лежащих в основе этих мутантных генов ALS, значительно расширил наши знания о патогенезе как fALS, так и sALS, тем самым давая новое представление о потенциальных мишенях для терапии. В целом, было установлено, что мутации в генах SOD1, в гене открытой рамки считывания 72 хромосомы 9 (C9orf72) [15-17], в TAR DNA binding protein 43 (TARDBP или TDP-43) [18] и fused in sarcoma (FUS) [19,20] являются четырьмя наиболее распространенными, вовлеченными в более чем 70% случаев fALS [3]. Соответственно, создание трансгенных моделей животных и воздействие на аномальные гены (т.е. генотерапия) изучается во всем мире с целью перевода экспериментальной генотерапии в клинические условия. Хотя доклинические исследования на различных видах животных могут быть сложными, поскольку они могут не отражать точные фенотипы человека, результаты этих исследований были многообещающими и привели к началу применения некоторых из этих стратегий в клинических испытаниях ALS. В этой статье мы рассмотрим достижения в генотерапии ALS и ALS/FTD с упором на гены SOD1, C9orf72, TARDBP и FUS.

10-15% случаев приходится на доминантные варианты генов с высокой частотой встречаемости [14]. В целом, существует четыре подхода к подавлению токсического действия этиологических генов (рис. 1):



Figure 1. Schematic representation of potential strategies in gene therapy for amyotrophic lateral sclerosis. Antisense oligonucleotide (ASO) are short synthetic oligonucleotides (~20 nucleotides). They bind to the targeted mRNA and either (i) induce the mRNA degradation by endogenous RNase H or (ii) block the mRNA translation. This ultimately decreases the expression of certain proteins. In ALS, this strategy has been utilized to reduce the protein level of TDP-43, SOD1 of FUS protein level or to target C9orf72 RNA foci. SiRNAs are double-stranded RNAs that can bind argonaute proteins as part of the RNA-induced silencing complex (RISC), which ultimately leads to the mRNA cleavage. Gene (i.e., either mRNA or cDNA) delivery through viruses (e.g., adeno-associated viral vectors [AAV]) is another option for functional replacement of a missing gene. This approach was utilized in spinal muscular atrophy but needs more investigation in ALS.

МикроРНК или антисмысловые олигонуклеотиды (ASOs; комплементарные последовательности ДНК или РНК, разработанные для спаривания с целевой последовательностью и активации деградации РНК) для абляции РНК, транскрибируемой с гена мишени: Применение ASOs, которые представляют собой синтетические нуклеиновые кислоты, нацеленные на/изменяющие мРНК, показало многообещающие результаты в лечении других нервно-мышечных заболеваний у детей, таких как спинальная мышечная атрофия (SMA) и мышечная дистрофия Дюшенна (DMD). Это полностью изменило первоначальную траекторию развития болезни, что привело к одобрению FDA двух ASO, нусинерсина (Spinraza) и этеплирсена (Exondys51), для соответствующего лечения SMA) 1 и 2 типа и подгруппы DMD; однако они не были испытаны на SMA) 3 и 4 типа у взрослых, и их полезность при взрослом заболевании пока неизвестна. В целом, ASO либо избирательно разрушают мРНК путем привлечения эндонуклеазы RNase H, либо предотвращают взаимодействие РНК с РНК-связывающими белками (RBPs), тем самым модулируя их сплайсинг/процессинг без деградации [21].

Уменьшение избытка мутантного белка (например, иммуно-опосредованное уменьшение).

Вмешательство в транскрипционный процесс с помощью малых молекул.

Соматический клеточный мутагенез, обратная мутация гена обратно к форме дикого типа.

В нескольких отчетах было зафиксировано, что первые три из этих методов осуществимы. Большим преимуществом последнего подхода является то, что исправление мутантной ДНК устраняет последующие аномалии и, по крайней мере теоретически, является одноразовым вмешательством.

SOD1 является общей генной мишенью при ALS. Впервые обнаруженные в 1993 году [22], мутации SOD1 составляют приблизительно 12-20 процентов наследственных случаев ALS во всем мире; в Азии мутация SOD1 является наиболее распространенной причиной семейного ALS [3,23]. Ген SOD1 расположен на хромосоме 21 и кодирует фермент Cu, Zn, супероксиддисмутазу. Нормальная функция белка SOD1 устраняет реактивные виды кислорода в клеточном цитозоле и митохондриях и таким образом является нейропротекторной [24,25]. Поэтому мутация этого гена может привести к токсическому усилению или потере функции, что в свою очередь нарушает нормальный клеточный гомеостаз. При ALS нейродегенерация при мутации SOD1, согласно гипотезе, происходит через консорциум механизмов, таких как окислительный стресс, нарушение деградации белков, микроглиальное воспаление, агрегация токсичных белков, дисфункция митохондрий и олигодендроцитов [14].

В SOD1 описано более 170 различных мутаций [26]. Большинство из них представляют собой миссенс-патогенные варианты, которые передаются доминантным путем. Однако даже при одной и той же мутации клиническая картина непредсказуема, так как известны случаи фенотипической гетерогенности среди пациентов, унаследовавших одну и ту же мутацию SOD1 [27,28]. Поэтому другие факторы, такие как эпигенетика и экологический риск, могут быть важны для понимания проявления болезни при SOD1 ALS. Определенные мутации SOD1 также могут быть предикторами выживаемости при ALS, например, мутация A5V ассоциируется с выживаемостью в среднем 1 год [29], особенно быстро прогрессирующей подгруппой населения. Экспрессия генов имеет сложный характер, включая модуляцию со стороны вышележащих промоторных областей, эпигенетических изменений, стадии синтеза белка и клеточной упаковки, и с учетом этих сложных этапов это расширяет возможности SOD1 и других генов-мишеней для успешных терапевтических подходов при ALS.

ASOs - это небольшие молекулы, которые способствуют деградации как цитоплазматической мРНК, так и сохраненной в ядре РНК путем воздействия на РНКазу H1-зависимый путь деградации, что в свою очередь снижает синтез клеточного белка [30]. В исследованиях других нейродегенеративных заболеваний, таких как SMA, ASOs уже показали эффективность в снижении смертности от всех причин [31]. В первом испытании с использованием ASOs при ALS, нацеленном на SOD1, исследователи делали интратекальные инъекции ASOs крысам и макакам-резусам и продемонстрировали повсеместный охват в ЦНС и обнаружили замедление прогрессирования заболевания в модели ALS на крысах [32]. В испытаниях на людях I фазы исследования интратекального введения ASOs, направленного на SOD1 (ISIS 333611; различные дозы 0,15, 0,50, 1,50 и 3,00 мг вводились в течение 11,5 ч; (идентификатор Clinicaltrials.gov: NCT01041222) [33,34] были признаны безопасными и хорошо переносимыми. С ASOs второго поколения tofersen, BIIB067 (IONIS-SOD1Rx), завершена фаза I/II испытаний (идентификатор ClinicalTrials.gov: NCT02623699) и обнаружена дозо-зависимая эффективность, при этом самая высокая доза 100 мг показала наибольший эффект в снижении концентрации CSF SOD1, особенно при быстро прогрессирующей болезни [35] (табл. 1). Однако, поскольку количество участников в первоначальном исследовании было небольшим, BIIB067 был включен в фазу 3 клинических испытаний; однако первичные результаты измерения прогресса заболевания у быстро прогрессирующих больных ALS на 28 неделе лечения не достигли статистической значимости [36]. В настоящее время планируется проведение долгосрочного клинического испытания BIIB067 фазы 3 с последующим наблюдением в течение 7 лет (идентификатор Clinicaltrials.gov: NCT03070119). Проблемы с ASOs заключаются в том, что, поскольку молекулы действуют ниже по течению, останавливая синтез белка, если будет найдена успешная молекула, вероятно, потребуются повторные дозы для противодействия вновь транскрибируемой мРНК из активного гена у взрослых пациентов с ALS.

Table 1. Gene Therapy Clinical Trials in Amyotrophic Lateral Sclerosis.

Другим подходом для борьбы с токсическим усилением функции, связанным с РНК/белками, в патологии SOD1 ALS является использование стратегии РНК-интерференции (RNAi). Она отличается от ASOs, поскольку РНК представляет собой двухцепочечную структуру, которая, хотя и имеет больше шансов пережить доставку, требует этапов ферментативной обработки, прежде чем стать активной, по сравнению с ASOs, которые являются одноцепочечными и готовы напрямую связываться со своей мишенью. В процессе RNAi РНК разрушают мРНК в цитоплазме посредством RNA-induced silencing complex (RISC), тем самым подавляя экспрессию целевых генов [39]. Наиболее распространенные стратегии RNAi включают короткие интерферирующие РНК (siRNAs), короткие шпилечные РНК (shRNAs) и искусственные миРНК. Для доставки РНК в нейроны ЦНС можно использовать адено-ассоциированные вирусные векторы (AAV). В моделях мышей с SOD1G93A, AAV-опосредованная доставка siRNA привела к 39%-ному повышению выживаемости, при этом эффективность снижалась в зависимости от возраста мышей, что было ожидаемо, поскольку гомеостатическая дисфункция SOD1 уже произошла на поздней стадии заболевания. В нескольких исследованиях была показана эффективность РНК с мишенями, имеющими более низкую экспрессию SOD-1, и наблюдались результаты в виде задержки начала заболевания и продления выживания [40,41,42].

Эти многообещающие исследования на животных привели к проведению испытания на двух людях с семейной формой ALS с использованием однократной интратекальной инфузии AAV-miR-SOD1 [37]. У первого пациента развились побочные эффекты в виде менингорадикулита с преходящим улучшением силы нижних конечностей, а второй пациент прошел предварительное лечение иммуносупрессией и не имел никаких побочных эффектов. Хотя на вскрытии у первого пациента были обнаружены более низкие уровни SOD1, ни у одного из пациентов не наблюдалось снижения уровня SOD1 в CSF через две недели [37]. Пациент 2 также имел стабильные показатели по комплексному показателю функции ALS и стабильную жизненную емкость в течение 12 месяцев [37].

Нейротрофины - это сигнальные молекулы, которые регулируют функцию нейронов и могут определять скорость апоптоза и модулировать выживаемость нейронов [43]. Большинство исследований нейротрофинов при ALS были посвящены insulin growth factor (IGF) и фактору роста эндотелия сосудов (VEGF). Когда scAAV9-кодирующий IGF-1 вводили мышам с SOD1, это привело к заметному уменьшению разрушения двигательных нейронов в передних рогах спинного мозга и замедлило прогрессирование и начало заболевания [44]. В другом исследовании инъекция AAV9, экспрессирующего IGF-2, мышам SOD1-G93A показала увеличение продолжительности жизни на 10% и, следовательно, может быть защитным фактором для выживания нейронов [45]. Наконец, инъекция scAAV9-VEGF-165 мышам SOD1-G93A показала увеличение продолжительности жизни и двигательной силы [46]. Интересно, что когда IGF-1 и VEGF вводились одновременно, они не показали аддитивных преимуществ, предполагая, что эти молекулы могут действовать на схожие пути [47].

CRISPR/Cas, что расшифровывается как "clustered regularly interspaced short palindromic repeats and CRISPR-associated protein", первоначально была изучена на бактериях [48] и начинает появляться в исследованиях нейродегенеративных заболеваний. Эта стратегия направлена на исправление мутантной ДНК с целью устранения аномальных нисходящих путей; таким образом, теоретически ее можно рассматривать как одноразовое вмешательство. В настоящее время в области ALS было проведено ограниченное количество исследований. В исследовании 2017 года рассматривался CRISPR, нацеленный на ген SOD1, где модифицированный AAV9 доставлял полученные из Staphylococcus aureus Cas9 (SaCas9) и single-guide RNA (sgRNA), нацеленную на ген SOD1, через лицевую вену новорожденным мышам SOD1G93A. Были получены доказательства снижения экспрессии SOD1 в спинном мозге этих трансгенных мышей, увеличения числа двигательных нейронов, задержки начала заболевания и повышения выживаемости [49]. За этим исследованием последовали два исследования в 2020 году, которые показали аналогичное снижение экспрессии SOD1 в спинном мозге и увеличение выживаемости [50,51]. Основным ограничением этих исследований является тот факт, что лечение назначалось мышам в молодом возрасте до появления симптомов ALS. Поэтому неясно, насколько эффективным будет лечение у более взрослых мышей, у которых уже начали проявляться симптомы ALS, поскольку для постановки диагноза ALS по пересмотренным критериям Эль-Эскориала необходимы симптомы по крайней мере в одной анатомической области [52].

На сегодняшний день C9orf72 является самым значительным открытием гена ALS [15-17]; мутация в открытой рамке считывания 72 хромосомы 9 приводит к расширению гексануклеотидных повторов GGGGCC (G₄C₂) [15-17]. На долю этого гена приходится до 35-45% семейного ALS [53], он вызывает расширение последовательности повторов, расположенных в первом интроне C9orf72. Следовательно, это приводит к нарушению промоторной области этого гена, ответственной за контроль транскрипции нисходящего потока. Многочисленные исследования предположили, что это может привести либо к усилению, либо к потере функции и повлиять на последующий синтез белка [54]. Считается, что избыток белка C9orf72 играет важную роль при ALS, поскольку это может привести к токсическому накоплению РНК, агрегации дипептидных белков, нарушению цитоплазматического транспорта и нуклеолярной дисфункции [54]. В нормальной популяции гексануклеотидные повторы в C9orf72 встречаются в количестве порядка 20-30 s и считались непатогенными [55]; при ALS эти повторы обычно встречаются в количестве сотен [15-17]. Однако, по последним данным, считается, что экспансии из всего лишь 24 повторов вносят свой вклад в патогенез [56]. Связь между размером экспансии повторов и фенотипом до сих пор недостаточно хорошо изучена и может быть обусловлена вариабельностью соматического мозаицизма [3]. Средний возраст начала заболевания у пациентов с C9orf72 ALS составляет 57 лет, а медиана выживаемости - 30-37 месяцев [57]. FTD также более распространен при C9orf72 ALS с более быстрым прогрессированием заболевания и ухудшением клинических когнитивных и поведенческих изменений [58,59]. Остается неясным, чаще ли у пациентов с C9orf72 ALS встречается бульбарная форма [58,60,61] или поражение конечностей [57], что может дать нам подсказку и потенциальную мишень для патогенеза. Хотя лекарств от ALS не существует, открытие C9orf72 ALS/FTD положило начало прогрессу в разработке целевых терапевтических средств и прояснению нашего понимания этого фатального нейродегенеративного заболевания.

Увеличение числа повторов C9orf72 за счет токсического усиления и потери функций, таких как нарушение клиренса дипептидных белков и excitotoxicity из-за накопления глутаматных рецепторов, может привести к преждевременной гибели нейронов [62,63]. Поэтому ингибирование транскрипции ДНК или уменьшение избытка мРНК являются потенциально перспективными мишенями для остановки прогрессирования заболевания ALS/FTD, вызванного C9orf72.

ASOs. ASOs, нацеленные на РНК C9orf72, могут подавлять специфические для C9orf72 патологии [64-67] (например, дефицит ядерно-цитоплазматического транспорта [68] и агрегацию TDP-43 [68]) и улучшать выживаемость нейронов или фибробластов, полученных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSC) C9orf72 [68]. Они также ослабляют нейродегенерацию в C9orf72 Drosophila melanogaster [68] и уменьшают очаги смысловых РНК и белки дипептидных повторов (DPRs) у моделях мышей C9orf72 [66,69]. Эти терапевтические эффекты были продемонстрированы в исследовании не на людях с использованием одной дозы, вводимой внутрь желудочков головного мозга, с BAC (бактериальные искусственные хромосомы) трансгенным мышам (G4C2)450, показавшем устойчивое снижение РНК-очагов и DPRs с обратным развитием поведенческого дефицита [69]. Важно отметить, что ASOs воздействовали только на варианты 1 и 3 C9orf72 (несущие мутацию расширения повтора), не влияя на экспрессию варианта 2 [69]; таким образом, количество C9orf72 после лечения оставалось довольно сходным между трансгенными животными и животными дикого типа. Более того, другое исследование предоставило доказательство концепции на одном человеке, где интратекальный Afinersen (ASO5-2) был эффективен для безопасного подавления транскриптов C9orf72 и на 80% снизил уровень поли(GP) дипептидов с функциональной стабильностью у этого человека в течение 18 месяцев [70]. Примечательно, что в январе 2022 года компания Ionis Pharmaceutical и Biogen Inc. завершили I фазу клинического испытания ASOs, направленных на варианты 1 и 3 C9orf72 (BIIB078), и хотя они хорошо переносились, не показали клинической пользы (идентификатор ClinicalTrials.gov: NCT03626012) [71].

РНК-интерференция (RNAi). В одном исследовании было показано, что siRNA сильно снижает уровень мРНК C9orf72 в фибробластах пациентов, но не влияет на очаги ядерной РНК [65]. Однако другое исследование показало, что одноцепочечные сайленсинговые РНК уменьшали очаги как смысловой, так и анти-смысловой РНК за счет снижения транскрипта мутантных РНК посредством RNAi и блокирования связывания RBP с РНК [72]. Hu et al. (2015) показали, что сконструированные дуплексные РНК позволяют идентифицировать сложные C/G мишени и в конечном итоге ингибируют очаги как смысловой, так и анти-смысловой РНК [73]. Хотя введение синтетических siRNAs и ASOs является многообещающим, они требуют повторного введения, поскольку расходуются при связывании с избытком мРНК, что требует многократного посещения клиники и потенциально создает нагрузку на пациента и лиц, ухаживающих за ним. В некоторых исследованиях сообщалось, что доставленные вектором AAV siRNA, полученные на основе shRNA или miRNA, обеспечивают более длительный терапевтический эффект при других нейрогенетических заболеваниях, таких как болезнь Хантингтона [74,75]. Используя эту стратегию, более поздние исследования показали, что однократное введение искусственных миРНК, полученных с помощью AAV5, приглушает C9orf72 и уменьшает ядерные и цитоплазматические очаги РНК как в iPSC-производных моторных нейронах, так и в мышиной модели ALS [76,77].

Small compounds or genetic modifications targeting repeat RNA secondary structures. Другой подход заключается в использовании малых соединений, которые могут быть нацелены на вторичные структуры повторяющихся (G₄C₂) РНК (например, G-квадруплекс, шпильки и R-петли) [68,78-82]. Эти малые молекулы могут связываться с вторичными структурами РНК для предотвращения трансляции RAN, а также для предотвращения секвестрации RBPs. Одной из таких молекул является катионный porphyrin (5,10,15,20-тетра(N-метил-4-пиридил) порфирин), также называемый TMPyP4, который может связывать некоторые G-квадруплекс-ообразующие последовательности, искажая G-квадруплекс, образованный r(G₄C₂)₈, и отменяя секвестрацию RBPs [79]. Он также может устранять дефекты ядерно-цитоплазматического транспорта и нейродегенерацию у дрозофилы (G₄C₂)₃₀ [68]. Недавние исследования также показали, что эти малые молекулы могут связываться с повторяющимися шпилечными структурами РНК и значительно уменьшать образование очагов РНК и накопление поли-GP в (G₄C₂)₆₆-культивируемых клетках, а также iPSC-произведенных моторных нейронах от пациентов с C9orf72 ALS [82]. Очевидно, что необходимы более детальные исследования, чтобы выяснить, могут ли эти небольшие соединения также влиять на производство более токсичных DPR (т.е. аргинин-содержащих дипептидов poly-PR и poly-GR) и оказывать терапевтический эффект in vivo. Кроме того, было обнаружено, что генетические изменения, такие как избыточная экспрессия гена SETX (кодирующего РНК/ДНК-геликаз сенатаксин), снижают уровень двухцепочечных разрывов ДНК за счет разрешения R-петель [83,84]. Примечательно, что аутосомно-доминантные мутации в гене SETX связаны с ювенильной формой ALS [85]. Было также показано, что избыточная экспрессия SETX снижает клеточную токсичность в клетках, вызывающих экспансию C9orf72 [86].

Targeting repeat RNA transcription. Снижение транскрипции (G₄C₂)_n-содержащих РНК может рассматриваться как еще одна терапевтическая стратегия при C9orf72 ALS. Spt4 (ортологом Spt4 у млекопитающих является Supt4h) и Spt5 являются высоко консервативными факторами элонгации транскрипции, которые контролируют processivity РНК-полимеразы II [87,88]. Терапевтический эффект ингибирования Spt4 или Supt4h при снижении транскрипции CAG-повторов при болезни Хантингтона [89], показал возможность того, что ингибирование Spt4 или Supt4h может быть полезным и при других заболеваниях с мутациями увеличения повторов. Интересное исследование Kramer et al. (2016) показало, что делеция Spt4 в дрожжах Saccharomyces cerevisiae, экспрессирующих повторы C9orf72, привела к значительному снижению экспрессии транскриптов (G₄C₂)₆₆ или (C₄G₂)₆₆, а также очагов РНК и уровня поли-GP [90]. Кроме того, нокдаун эндогенного Spt4 с помощью RNAi у (G₄C₂)₆₆ Caenorhabditis elegans снизил уровень РНК и поли-GP у (G₄C₂)₆₆, а также повысил выживаемость этих червей [90]. Кроме того, Spt4 RNAi частично подавлял дегенеративный фенотип внешней и внутренней частей глаза и улучшал выживаемость у (G₄C₂)₄₉ дрозофилы, и почти полностью подавлял истончение сетчатки, обычно наблюдаемое у (G₄C₂)₂₉ дрозофилы [90]. На следующем этапе Kramer et al. (2016) [90] обработали культивируемые фибробласты от трех пациентов с C9orf72 ALS siRNAs против Supt4h1 или Supt5h (siSupt4h1, siSupt5h, соответственно), снизив уровни мРНК и белка Supt4h1 и Supt5h, что привело к значительному снижению уровней мРНК C9orf72 варианта 3, poly-glycine-proline DPRs, а также очагов как смысловых, так и антисмысловых повторов РНК в фибробластах C9orf72, без признаков токсичности. С другой стороны, лечение фибробластов C9orf72 с помощью ASOs нацеленных на смысловой транскрипт C9orf72, дали аналогичные результаты, за тем исключением, что очаги, сформированные из анти-смысловых (C₄G₂)-содержащих транскриптов, остались незатронутыми. Таким образом, снижение количества продукта одного гена, Supt4h1 или Supt5h, уменьшало все три патологические характеристики C9orf72 ALS/FTD: очаги смысловой РНК, очаги анти-смысловой РНК и DPRs Примечательно, что уровни экспрессии мРНК Supt4h1 и Supt5h положительно коррелировали с уровнями мРНК варианта 3 C9orf72 или поли-GP DPRs в мозжечке пациентов с C9orf72 ALS/FTD [90]. Более поздние исследования также показали, что транскрипционный регулятор РНК-полимеразы II, комплекс CDC73/PAF1 (PAF1C) и его компоненты Leo1 и Paf1, повышены в трансгенной (C₄G₂)₄₉ дрозофиле, (C₄G₂)₁₄₉ мышах, iPS клетках от пациентов с C9orf72 ALS и лобной коре от пациентов с C9orf72 ALS/FTD или C9orf72 FTD [91]. Использование RNAi для снижения уровня компонентов PAF1C также селективно подавляло токсичность (G₄C₂)₄₉ в различных тканях мух, что сопровождалось значительным снижением продукции РНК и поли-GR DPRs, и снижало как смысловую (G₄C₂)₆₆, так и анти-смысловую (C₄G₂)₆₆ РНК в дрожжевой модели [91]. Лишение Paf1 и Leo1 в нервной системе мухи избирательно снижало экспрессию длинных, токсичных (G₄C₂)₄₉ повторов [91]. Вышеупомянутые исследования дали интригующее представление о новом подходе к лечению C9orf72 ALS/FTD путем подавления специфических транскрипционных регуляторов (например, PAF1C, Supt4h1 или Supt5h). Однако, прежде чем этот подход будет использован в клинических испытаниях, необходимо провести дополнительные исследования, чтобы тщательно изучить возможные пагубные последствия глобальной обработки РНК помимо экспансии повторов C9orf72.

Genome editing with CRISPR/Cas. В исследовании Gaj et al. (2017) векторы AAV9, содержащие CRISPR/Cas9, вводились в лицевые вены однодневных трансгенных мышей G93A-SOD1 ALS, чтобы нарушить экспрессию мутантного SOD1 [49]. Они получили потрясающие результаты, показавшие более чем 2,5-кратное снижение уровня мутантного белка SOD1 в грудном отделе позвоночника, на 50% больше двигательных нейронов на конечной стадии, 37% задержку начала ALS и 25% увеличение выживаемости [49]. В том же году два отдельных исследования также сообщили о полезности CRISPR/Cas9 для воздействия на ДНК (G₄C₂) повторов [92] или РНК (G₄C₂) повторов [93] с целью снижения транскрипции РНК повторов или уровней РНК-очагов/DPRs, соответственно. Один важный вопрос, который необходимо учитывать при интерпретации этих данных, заключается в том, что лечение проводилось трансгенным мышам с рождения до того, как у них проявился фенотип ALS (что обычно происходит через 90 дней после рождения у этих трансгенных мышей); таким образом, пока неясно, обеспечит ли этот подход такой же результат у более старых мышей, когда болезнь будет активной. Клиническая диагностика ALS является трудной задачей, занимающей в среднем 11,5 месяцев, из-за задержек с момента появления первых симптомов до презентации заболевания и необходимости проведения дополнительных исследований для исключения других заболеваний [94]. В результате лечение, которое может быть эффективным на ранних стадиях развития заболевания, может стать менее эффективным при любой задержке диагностики. До сих пор не существует единого мнения относительно рекомендаций по генетическому обследованию бессимптомных членов семей больных ALS или населения в целом, поэтому потенциальные профилактические методы лечения, требующие применения до появления симптомов, труднее подвергать клиническим испытаниям. Поэтому по мере того, как генетическое тестирование становится более экономичным, генетические мишени могут быть расширены в будущих клинических испытаниях. Эти результаты, хотя и ограниченные, открыли новый путь в трансляционных исследованиях, направленных на борьбу с аномальной ДНК/РНК при C9orf72 ALS/FTD с помощью CRISPR/Cas9. Необходимо решить важные проблемы, включая этические вопросы, безопасные методы доставки лекарств и потенциальные неблагоприятные исходы, прежде чем этот подход найдет свое применение в клинической практике.

Хотя стратегии, направленные на ДНК или РНК с экспансией повторов C9orf72 в качестве предшествующих патологических путей, являются многообещающими и могут помочь скорректировать соответствующие последующие пути, такие как токсичность DPRs или дефицит ядерно-цитоплазматического транспорта, в настоящее время изучаются другие терапевтические подходы, направленные непосредственно на последующие пути (такие как DPRs). На сегодняшний день было предложено три подхода для прямого снижения патологических аспектов DPRs при C9orf72 ALS/FTD. Antibody immunization against DPRs and their cell-to-cell transmission. Эта стратегия аналогична другим нейродегенеративным заболеваниям, при которых аномальные белки, такие как амилоид-, tau и синуклеин [95,96], являются мишенью для антител. В исследовании Zhou et al. (2017) обработка либо (GA)₁₇₅-GFP-трансфицированных клеток HEK293, либо первичных нейронов крысы антителом против GA снижала агрегацию (GA)₁₇₅-GFP в обеих клеточных культурах по сравнению с изотипным контролем [97]. Более того, предварительная инкубация с анти-GA антителом ингибировала поглощение (GA)₈₀ из экстрактов мозга C9orf72 в клетки HEK293, что является доказательством ингибирующего влияния этих антител на посевную активность экстрактов мозга от C9orf72 больных ALS [97].

Removal/clearance of toxic DPRs. Этот подход был опробован в недавнем исследовании, где было показано, что избыточна экспрессия малого белка теплового шока B8 (HSPB8) способствовала аутофагическому удалению всех пяти DPR в иммортализованных клеточных линиях двигательных нейронов NSC34, экспрессирующих каждый отдельный DPR [98]. Другая потенциальная мишень, ингибитор протеинкиназы А (PKA) H89, как было показано, снижает уровень DPK в полученных от двигательных нейронах iPSC пациентов [99]. В другом исследовании [100] также сообщалось, что дефицитная по анти-коагуляции форма активированного протеина С, называемая 3K3A-APC, устраняет дефекты нейронов как в C9orf72, так и в спорадических моторных нейронах, индуцированных ALS (iMNs), путем устранения дефектной аутофагосомы, тем самым снижая уровень DPRs в C9orf72, восстанавливая ядерную локализацию TDP-43 и улучшая выживаемость как C9orf72, так и спорадических ALS iMNs [100].

Ингибирование выработки DPR. Благодаря проведению геномного CRISPR/Cas9 скрининга для выявления модификаторов продукции белка DPR в клетках человека, недавно было обнаружено, что DDX3X (DEAD-Box Helicase 3 X-Linked), РНК-геликаза, подавляет ассоциированную с повторами не-AUG трансляцию повторов G₄C₂ путем прямого связывания с повторяющимися РНК [101]. Увеличение экспрессии DDX3X привело к снижению уровня DPR, устранению дефектов ядерно-цитоплазматического транспорта и улучшению выживаемости нейронов, дифференцированных из iPSC, полученных из больных ALS [101]. Было также показано, что соединения, ингибирующие 10-фосфорный сигнал EIF2 (например, ISRIB (integrated stress response inhibitor) и GSK2606414), подавляют трансляцию RAN, тем самым подавляя продукцию DPR и предотвращая соответствующую клеточную токсичность [102].

Целенаправленное воздействие на ядерный транспорт - еще один подход, исследуемый в последние годы, который включает три основные стратегии:

Genetic modification. Снижение экспрессии exportin с помощью стратегии RNAi или избыточная экспрессия importin α , двух важных белков, участвующих в активном транспорте крупных (более 40 kD) белков, у дрозофилы (G₄C₂)₃₀ продемонстрировали спасение от нейродегенерации в глазах мух [68]. Отдельное исследование также показало, что нокдаун RBP SRSF1, который действует как адаптерный белок ядерного экспорта, запускающий ядерный экспорт РНК, с помощью стратегии RNAi у дрозофилы (G₄C₂)₃₆ восстановил двигательную функцию, снизил производство как смысловых, так и анти-смысловых поли-GP DPRs и смягчил нейротоксичность, опосредованную астроцитами, у этих мух (G₄C₂)₃₆ [103]. Нокдаун SRSF1 в происходящих из iPSC моторных нейронах от пациентов с C9orf72 ALS обеспечил нейропротекторный эффект против гибели клеток нейронов [103]. Эти данные позволяют предположить, что нокдаун определенных белков ядерного экспорта (например, экспортина и SRSF1) может потенциально предотвратить экспорт токсичных повторов РНК в цитоплазму, тем самым ингибируя пути, связанные с их токсичностью (например, производство DPRs).

Indirect effect using ASOs targeting Ataxin-2. Интересное исследование Zhang et al. (2018) показало, что Атаксин-2 может вносить вклад в ядерно-цитоплазматические дефекты при C9orf72 ALS/FTD через нарушение сборки стрессовых гранул [104]. Нокдаун экспрессии Ataxin-2 с помощью ASOs подавлял дефекты ядеро-цитоплазматического транспорта, патологию TDP-43 и нейродегенерацию как у дрозофилы (G₄C₂)₃₀, так и у из iPS моторных нейронов, полученных от пациентов с C9orf72 ALS [104]. Аналогичные результаты были получены при использовании ингибиторов стресс-гранул [104].

TDP-43 - это ДНК/РНК-связывающий белок, кодируемый геном TARDBP. В 2006 году TDP-43 был обнаружен как основной компонент патологических цитоплазматических включений при ALS и FTD [105,106]. Впоследствии мутации в гене TARDBP были обнаружены как причинные факторы ALS [18,107-109]. К настоящему времени выявлено более 50 мутаций в гене TARDBP [110]. В то время как мутации в гене TARDBP вызывают до 5% семейного ALS и до 1% спорадического ALS, белок TDP-43 обнаруживается в цитоплазматических агрегатах в большинстве случаев ALS и FTD [111-114]. Известно, что TDP-43 регулирует процессинг РНК, включая сплайсинг РНК, транспорт мРНК, трансляцию, а также регуляцию не-кодирующих РНК [115,116]. Обычно он локализован в ядре, но содержит сигналы ядерной локализации и экспорта, благодаря чему может перемещаться между ядром и цитоплазмой [117].

Считается, что цитоплазматические агрегаты TDP-43 связаны с потерей функции TDP-43 в ядре и приобретением токсичной функции TDP-43 в цитоплазме, или с тем и другим. Исследования с использованием различных моделей животных с нокаутом/подавлением и сверхэкспрессией TARDBP показали что потеря TDP-43, так и сверхэкспрессия TDP-3 выступают в качестве причинных элементов ALS [118-121], это подчеркивает важность жесткой регуляции TDP-43. Кроме того, было обнаружено, что с патологическим TDP-43 связано несколько пост-трансляционных модификаций, включая убиквитинирование, фосфорилирование и протеолитическое расщепление [18,122,123].

Уровень TDP-43 и его локализация в клетке должны жестко регулироваться. Поэтому генотерапия, контролирующая экспрессию и/или локализацию TDP-43, может стать хорошим вариантом лечения пациентов с TARDBP ALS/FTD.

ASOs. В настоящее время нет клинических разработок ASO, направленных непосредственно на TARDBP. Однако ASO, направленные на Ataxin-2, были протестированы на животных моделях TDP-43, что привело к уменьшению агрегации TDP-43 и патологии [124]. Кроме того, ASOs, нацеленные на нокдаун CHMP 7, улучшили выживаемость нейронов в из iPSC-произведенных спинальных нейронах и на посмертных тканях человека [125].

RNAi. iPSC , происходящие от пациентов с ALS с известными генетическими мутациями, могут быть использованы для тестирования генотерапии. Предыдущее исследование показало уменьшение уровней ядерного и цитоплазматического TDP-43 после введения siRNA, нацеленной на M337V, в TDP-43M^337V-iPSCs [126]. Необходимы дальнейшие исследования, но этот подход с использованием siRNA, специфически нацеленный на известные мутации TDP-43, может стать потенциальным вариантом лечения семейного ALS с мутациями TDP-43.

Genome editing with CRISPR/Cas. TDP-43 регулирует сплайсинг мРНК, включая мРНК Sort1, кодирующую белок Sortilin. Известна его роль в регуляции нейротрофического фактора мозга (BDNF), который необходим для синаптической пластичности, выживания нейронов, а также дифференциации [127]. Tann et al. (2019) успешно исправили мутацию M337V в TDP-43M337V-iPSCs с помощью CRISPR/Cas9 и доказали, что мутация M337V нарушает секрецию BDNF и синаптическую пластичность через изменение сплайсинга Sortilin [128]. Редактирование генов с помощью CRISPR/Cas9 открыло новый путь терапевтического подхода к лечению ALS. Однако для применения этой терапии в клинической практике потребуется значительный объем дальнейшей работы по ее оптимизации.

TDP-43 имеет сигнал ядерного экспорта. Поскольку цитоплазматическое накопление TDP-43, связанное с потерей функции TDP-43 в ядре и приобретением токсической функции TDP-43 в цитоплазме, считается причиной ALS, были разработаны новые соединения, которые селективно ингибируют ядерный экспорт [129]. Эти соединения показали скромное улучшение выживаемости моторных нейронов и частичное восстановление моторного фенотипа в модели животных, избыточно экспрессирующих TDP-43. Однако они не показали снижения ядерного экспорта TDP-43 [129].

В 2009 году были обнаружены мутации в гене FUS в хромосоме 16 как причинный фактор ALS [19,20]. Было выявлено более 50 различных мутаций в гене FUS, которые вызывают до 4% семейного и 1% спорадического ALS [130,131] а, более конкретно, ALS с ювенильным началом [132,133]. Преобладают признаки LMN с более ранним началом и агрессивным течением заболевания, причем бульбарный и спинальный типы начала заболевания чаще встречаются в случаях FUS ALS [77, 100]. Однако когнитивные симптомы и FTD при мутациях в FUS встречаются редко [110,134,135].

FUS в основном локализуется в ядре. Хотя точная физиологическая функция FUS не совсем понятна, известно, что он регулирует сплайсинг РНК, трафик мРНК и репарацию ДНК [130,136]. Кроме того, FUS играет роль в формировании paraspeckle, которые обеспечивают клеточную защиту от различных видов клеточного стресса [137].

Большинство описанных мутаций в FUS являются миссенс-мутациями, сгруппированными в пределах 3' аргинин/глицин-богатой области и сигнального домена локализации ядра. Эти мутации в основном вызывают цитоплазматическую неправильную локализацию FUS, что приводит к FUS-иммунореактивным включениям, объясняющим дегенерацию нейронов при ALS [138]. Считается, что в патогенезе FUS ALS играют роль как потеря функции в ядре, так и усиление токсической функции в цитоплазме FUS [139,140].

Поскольку ALS, связанный с мутациями FUS, встречается редко, подходы генjтерапии, направленные на FUS, не так хорошо стимулированы, как другие более распространенные гены, такие как SOD1 и C9orf72.

ASOs. Недавно Eleanor and Lou Gehrig ALS Center at Columbia University Irving Medical Center начал многоцентровое исследование 1-3 фазы ASO, направленных на ген FUS, под названием Jacifusen, и это первое клиническое исследование, направленное на FUS (таблица 1).

Genome editing with CRISPR/Cas. Другие исследования использовали CRISPR/Cas9 для изучения патогенеза FUS с помощью iPSCs, полученных от пациентов с ALS с мутациями FUS [141-145]. Первая CRISPR/Cas-9-опосредованная коррекция FUS G1566A была продемонстрирована Wang и другими [141]. После этого исследования CRISPR/Cas-9-опосредованная коррекция мутации FUS H517Q показала, что аномальная активация митоген-активированной протеинкиназы (MAPK) связана с нейродегенеративным процессом при ALS, опосредованным мутацией FUS [142]. Другое исследование с CRISPR/Cas9-опосредованной коррекцией FUS R521H показало, что патологические фенотипы, наблюдаемые в моторных нейронах с мутацией FUS, могут быть спасены путем коррекции гена [145]. Кроме того, исправление мутаций FUS P525L и R521H с помощью CRISPR/Cas9 позволило устранить дефекты лигирования ДНК, которые были снижены в моторных нейронах, полученных от пациентов с FUS ALS [143]. Несмотря на то, что для применения редактирования генов с помощью CRISPR/Cas9 в клинической практике необходимы дальнейшие исследования, оно может способствовать разработке новых методов лечения ALS.

До 10% случаев ALS связаны с генами, это означает, что существует множество отдельных мишеней для молекулярной терапии. Существует несколько клеточных и животных моделей, специфичных для генов, связанных с ALS, и продолжается разработка новых моделей, что позволило нам улучшить наше механистическое понимание болезни и исследовать новые генетические мишени, интересные методы лечения и новые векторы для направленного введения молекулярных терапий. Некоторые генные методы лечения показали значительный эффект на животных и клеточных моделях в улучшении функциональных результатов заболевания, а некоторые также продемонстрировали эффективность в небольших групповых исследованиях на людях, расчищая путь для более крупных клинических испытаний.

Поскольку ALS является лишь одним из многочисленных нейродегенеративных заболеваний, связанных с генами, сравнение с другими подобными заболеваниями, такими как спинальная мышечная атрофия, показывает, что генетическое лечение ALS возможно. При SMA I и II типа, детском нейродегенеративном заболевании, ASO, нусинерсин (Spinraza), и генотерапия AVXS-101 (zolgensma) с помощью вектора AAV9 в настоящее время являются золотыми стандартами терапии, причем zolgensma эффективна в одной внутривенной дозе, если лечение проводится до двухлетнего возраста, что обеспечивает нормальную жизнь для этих пациентов. Однако при ALS менее вероятно, что терапия одной дозой будет достаточной для остановки болезни, поскольку ASO не влияют на транскрипцию новых РНК, а нацелить больные нейроны с помощью генной терапии будет сложно из-за большого количества уже пораженных нейронов. Кроме того, внутривенное и интратекальное введение препаратов будет затруднено, поскольку для современных лекарств от ALS, требующих внутривенного введения, таких как edaravone (Radicava), пациентам приходится либо многократно посещать инфузионные центры, либо, если позволяет страховка, проводить терапию на дому через порт-катетер. По мере прогрессирования заболевания ALS пациенты могут столкнуться с трудностями, связанными с транспортом и временем, необходимым для того, чтобы добраться до инфузионных центров, что снижает общее качество их жизни.

Кроме того, множество генов, вовлеченных в ALS, еще больше усложняет потенциальные методы лечения, поскольку лечение должно моделировать индивидуальный генетический состав. Это стало более осуществимым благодаря усовершенствованию технологии секвенирования генома, и теперь стало доступным заказывать через Интернет персонализированные отчеты ДНК и входить в онлайновые базы данных генетических предков. Благодаря этому в будущем возможно проведение стандартизированных панелей генов ALS в клиниках, или это даже может быть предложено членам семьи, которые могут быть носителями этого заболевания, что в настоящее время в основном ограничено клиническими испытаниями или теми, кто может заплатить из своего кармана. Из-за такой недоступности клинические испытания, описывающие ведение носителей генов, связанных с ALS, ограничены. Существует только одно текущее клиническое исследование (исследование ATLAS), в котором используется ASOs второго поколения tofersen (или BIIB067) (мишенью которого является SOD1) у носителей вариантов SOD1, связанных с высокой или полной пенетрантностью и быстрым прогрессированием болезни, у которых еще нет клинических проявлений болезни, но повышен уровень нейрофиламента (ClinicalTrials.gov Identifier: NCT04856982) [146]. Идея возникла в связи с тем, что в подгруппе участников исследования Pre-Symptomatic Familial ALS (продольное естественное исследование ALS), которое проводилось в рамках проекта Pre-Symptomatic Familial ALS. history/biomarker study of asymptomatic people at high genetic risk for ALS [ClinicalTrials.gov Identifier: NCT00317616] since 2007) [147], было обнаружено, что у лиц с вариантом SOD1, ассоциированным с быстрым прогрессированием заболевания (напр, p.Ala5Val [A5V; A4V]) и у phenoconverters (лиц из группы риска, наблюдаемых как до, так и после появления клинически выраженного заболевания) во время наблюдения, повышенные уровни нейрофиламентов в сыворотке крови (особенно легкой цепи нейрофиламентов, NfL) наблюдались за 6-12 месяцев до феноконверсии [148,149]. Учитывая эти наблюдения и недавние потенциальные положительные эффекты тоферсена в отношении снижения общего белка SOD1 в CSF и NfL в плазме крови у симптоматических пациентов с SOD1-ALS [35], результаты исследования ATLAS позволят нам узнать, может ли начало приема тоферсена отсрочить начало или замедлить прогрессирование ALS в этой популяции высокого риска пре-симптоматических носителей SOD1 [146]. Это также подчеркивает тот факт, что улучшение скрининга заболевания может привести к более широким клиническим испытаниям для выявления и включения пре-симптоматических пациентов и носителей с предрасположенностью к ALS, улучшению понимания прогрессирования заболевания и к потенциальной разработке профилактических методов лечения.

Учитывая тот факт, что у до-симптоматических пациентов с ALS (независимо от того, являются ли они носителями патогенного варианта гена или нет) клинические симптомы отсутствуют или слабо выражены, биомаркеры могут играть важную роль в оценке этой стадии заболевания. Несмотря на значительный прогресс в этой области (например, исследования нейрофиламентов как перспективных биомаркеров), поиск уникального и надежного биомаркера все еще остается сложной задачей, что в основном связано с гетерогенностью заболевания ALS и вариабельностью начала/течения болезни. Тем не менее, оценка и продольный мониторинг потенциальных биомаркеров у до-симптоматических пациентов представляется крайне важным, поскольку они могут служить для определения временной линии начала заболевания до клинических проявлений и служить в качестве критических предикторов прогрессирования заболевания.

В настоящее время изучаются пути генотерапии ALS, клеточные и животные модели с мутациями C9orf72, SOD1, TARDP-43 и FUS, позволяющие изучать болезнь на воспроизводимой человеческой модели заболевания. Достижения в этих моделях улучшили понимание патогенетических механизмов (рис. 1) и заложили основу для клинических испытаний ALS на людях (табл. 1). Тоферсен (BIIB067) ASO для гена SOD1 в исследовании фазы 1 показал безопасность, переносимость и привел к снижению уровня белка SOD1 в CSF у быстро прогрессирующих больных ALS. Хотя первоначальные клинические испытания фазы 3 на быстро прогрессирующих больных ALS не показали статистически значимого снижения уровня белка CSF SOD1, более длительное последующее исследование, находящееся в процессе, может действительно показать нам эффект лечения как быстро, так и медленно прогрессирующих больных ALS в течение 7-летнего периода наблюдения, поскольку этот срок охватывает течение болезни у большинства больных ALS. Интересно, что исследования на людях с интратекальным введением AAV-miR-SOD1 выявили преходящее улучшение мышечной силы, поэтому повторные исследования с большим числом пациентов и, возможно, с использованием других доз, если они будут переносимы, могут существенно изменить будущее лечение SOD1 ALS. Это лишь некоторые из многих текущих клинических испытаний ALS, и в сочетании с улучшением доступности генетического тестирования, улучшением моделей на животных и постоянно расширяющейся системой лечения, поиск генетических решений ALS становится все более активным.