Для внесения направленных изменений в геном успешно использовались такие инструменты, как нуклеазы с цинковыми пальчиками¹⁰ , нуклеазы с эффективным эффектором, подобным активатору транскрипции,^11,12 мегануклеазы,¹³ аденовирусы¹⁴ и адено-ассоциированные вирусы (AAVs)¹⁵ . В последние несколько лет системы CRISPR-Cas9, разработанные на основе естественных механизмов адаптивного иммунитета различных видов бактерий, таких как Streptococcus pyogenes (S. pyogenes) и Staphylococcus aureus (S. aureus), широко применяются в клетках и организмах млекопитающих и, по общему признанию, являются технологией, меняющей мир^16-23. Системы CRISPR-Cas9 состоят из нуклеазы Cas9 и 100-нуклеотидной синтетической направляющей РНК, которые соединяются вместе для нацеливания и связывания определенного участка генома. Синтетическая РНК направляющая включает около 20 нуклеотидов, которые могут гибридизироваться с комплементарной последовательностью на одной из нитей геномной ДНК, называемой протоспейсером, которая непосредственно граничит с мотивом примыкания протоспейсера. При гибридизации направляющей РНК с геномной ДНК Cas9 вызывает двунитевой разрыв в геномной ДНК.

При появлении двухцепочечного разрыва клетка начинает либо негомологичное соединение концов (NHEJ), либо гомологично-направленную репарацию (HDR) (рис.). Двухцепочечные разрывы чаще всего восстанавливаются посредством NHEJ без использования ремонтного шаблона, но NHEJ может привести к полу-случайной вставке или делеции (или к обоим) пар оснований ДНК (indels) в месте восстановления, что может вызвать мутации со сдвигом рамки считывания, это, вероятно, сделает белковый продукт целевого гена нефункциональным. Таким образом, этот подверженный ошибкам процесс клеточной репарации оказался полезным для преднамеренного разрушения гена в клеточных и животных моделях. С помощью менее часто используемого пути HDR можно добиться точного введения конкретной мутации с помощью синтетического, изготовленного на заказ ремонтного шаблона, имеющего гомологию с целевым сайтом, либо одноцепочечного ДНК-олигонуклеотида, либо двухцепочечного ДНК-вектора. В отличие от NHEJ, который активен во всех клетках в любое время, HDR ограничен пролиферирующими клетками в фазах S и G2 клеточного цикла. Из-за этого точное редактирование генома с помощью HDR обычно гораздо менее эффективно, чем разрушение генов с помощью NHEJ, особенно у живых животных.



Figure. Schematic of possible outcomes of genome editing that are relevant to the prevention and treatment of atherosclerosis. On the left, standard CRISPR-Cas9 is directed to a genomic site by the protospacer-adjacent motif (PAM) in the DNA and protospacer sequence in the guide RNA, whereupon it generates a double-strand break (location indicated by arrows pointing to DNA strands). The break is repaired by either nonhomologous end-joining (NHEJ) or homology-directed repair (HDR), which yield different outcomes. On the right, the base editor does not generate a double-strand break but rather converts a cytosine base (or bases) into a uracil base, which is ultimately replaced with a thymine base (with a complementary change of guanine-to-adenine on the opposite strand).

Недавно CRISPR-Cas9 система была адаптирована таким образом, что она не могла напрямую генерировать двунитевые разрывы в ДНК, но, тем не менее, может изменять конкретные нуклеотиды в последовательности ДНК - явление, известное как редактирование оснований (рисунок). ^24-28 Добавление домена цитозиндеаминазы, адаптированного от фермента, редактирующего РНК или ДНК, к каталитически неполноценному белку Cas9 предоставляет способность преобразовывать цитозиновые основания вблизи целевого сайта CRISPR-Cas9 (как определено направляющей РНК) в урациловые основания, которые затем могут быть преобразованы в тиминовые основания с помощью эндогенного механизма репарации ДНК (например, перерезание противоположной нити с помощью Cas9, что приводит к размещению аденинового основания напротив урацилового основания во время репарации перерезания, а затем позволяет эксцизионной репарации оснований заменить урациловое основание на тиминовое). В принципе, редактирование оснований позволяет вносить специфические изменения - например, исправлять мутации, вызывающие заболевания, - с высокой эффективностью и без ограничений, присущих HDR-редактированию генома (ограничение пролиферирующими клетками, необходимость в шаблоне для восстановления). В настоящее время редактирование оснований ограничено изменениями цитозина на тимин или (если редактор оснований нацелен на противоположную нить) изменениями гуанина на аденин. Тем не менее, редактирование оснований может быть полезным, если любое из следующих действий имеет желаемый терапевтический эффект: (1) изменение кодона дикого типа на стоп-кодон (нонсенс-мутация); (2) изменение кодона дикого типа так, что кодируемая аминокислота нарушает функцию белка (миссенс-мутация); (3) прямая отмена патогенной мутации тимин-цитозин или аденин-гуанин; или (4) из-за колебаний в генетическом коде изменение патогенного мутантного кодона с изменением цитозина на тимин или гуанина на аденин таким образом, что отредактированный кодон кодирует аминокислоту дикого типа, даже если исходная мутация не обращается напрямую (редактирование кодона).

В отношении простоты использования CRISPR-Cas9 и производные от него базовые редакторы не имеют себе равных по сравнению с другими технологиями редактирования генома; при изменении только 20-нуклеотидной последовательности протоспейсера в направляющей РНК, Cas9 может быть перенаправлен в любой геномный участок, в отличие от других технологий, где необходимо заново конструировать целые белки или вирусные векторы. Однако системы CRISPR-Cas9 имеют несколько важных ограничений (Таблица).

Во-первых, желаемый целевой геномный участок должен быть близок к естественно встречающейся последовательности мотивов, примыкающих к протоспейсеру. Иногда это может быть устранено использованием различных белков Cas9, которые предлагают расширенный набор последовательностей мотивов, примыкающих к протоспейсеру.^20,21,29,30 Во-вторых, восстановление двунитевых разрывов ДНК в желаемом целевом сайте может иметь непредвиденные последствия, такие как вставка нежелательных последовательностей, большие делеции, которые нежелательным образом влияют на целевой ген или на соседние гены, и даже хромосомные перестройки. Эта проблема может быть решена путем использования редакторов оснований, которые не требуют введения двунитевых разрывов ДНК для осуществления желаемых изменений, хотя сами редакторы оснований ограничены их направленностью на определенные виды изменений пар оснований и необходимостью наличия соответствующих сопряженных последовательностей мотивов протоспейсеров.^24-28 В-третьих, CRISPR-Cas9 может вызвать вне-целевой мутагенез в непредусмотренных местах генома, что потенциально может привести к нежелательному нарушению работы генов, изменению выживаемости или пролиферации клеток или стимулированию онкогенеза. Это ограничение было рассмотрено в значительном количестве литературы с момента появления CRISPR-Cas9, включая, помимо прочего, использование усеченных направляющих РНК или мутировавших нуклеаз Cas9 для уменьшения вне-целевого мутагенеза.^31-37 В-четвертых, с терапевтической точки зрения, редактирование генома CRISPR-Cas9 вызовет стойкие изменения, которые при нынешнем состоянии технологии не могут быть легко отменены, в отличие от большинства лекарств (хотя это предполагает, что технология редактирования генома не будет значительно усовершенствована в ближайшие годы). Это может оказаться проблематичным, если позже в жизни появятся непредвиденные негативные последствия терапевтического вмешательства.

Table. Current Limitations of CRISPR-Cas9 for Therapeutic Use

Precise genome editing with HDR is inefficient, especially in nonproliferating cells.

Restricted to genomic sites with a PAM.

Potential for unintended consequences at the target site, eg, insertion of undesired sequences, large deletions, and chromosomal rearrangements.

Off-target mutagenesis can occur at unintended sites in the genome but is difficult to detect with current technology.

Durable changes to the genome that are currently prohibitive to reverse.

Too large to easily accommodate in AAV vector-the preferred viral vector for human therapeutics.

Requires testing in human or humanized models to accurately assess efficacy and safety.

Immunologic responses against Cas9-expressing cells, especially if AAV is used.

AAV indicates adeno-associated virus; HDR, homology-directed repair; and PAM, protospacer-adjacent motif.

Естественно возникающие мутации с потерей функции, которые защищают от атеросклеротического заболевания сосудов, и не вызывают серьезных негативных последствий для здоровья, даже в гомозиготном или сложном гетерозиготном состоянии (т.е. полный нокаут функции гена), были описаны в нескольких генах, в частности, PCSK9, ANGPTL3 и APOC3.^38-44 Каждый из этих генов преимущественно экспрессируется в гепатоцитах, а белковый продукт секретируется в кровь. Эти результаты показывают, что данные гены являются весьма перспективными терапевтическими мишенями. PCSK9 привлек к себе большое внимание с момента его открытия в 2003 году как регулятор уровня LDL холестерина в крови. Для нарушения регуляция белка PCSK9 посредством мутаций с усилением функции нарушает выведение LDL из-за антагонизм рецепторов LDL и приводит к аутосомно-доминантной гиперхолестеринемии.^45-47 И наоборот, нарушение активности PCSK9 посредством естественных мутаций с потерей функции, терапевтического ингибирования белка PCSK9 с помощью антител или подавление гена siRNA может существенно снизить уровень циркулирующего LDL-C и даже уменьшить риск ишемической болезни сердца.^4,38,48,49.

Редактирование генома с целью внесения в любой из этих генов в гепатоцитах пациента потерявших функцию из-за мутаций со сдвигом рамки через NHEJ, в принципе, должно имитировать атеропротекторный эффект естественно встречающихся вариантов потери функции в гене. О постоянном нарушении PCSK9 с помощью редактирования генома in vivo недавно сообщалось в нескольких экспериментальных исследованиях на мышах. В первом таком исследовании аденовирусный вектор, содержащий S. pyogenes Cas9 и направляющую РНК, нацеленную на первый экзон Pcsk9, был введен мышам, что привело к высокой частоте NHEJ-опосредованного indels-мутагенеза - большинство аллелей Pcsk9 в печени - что снизило уровень циркулирующего белка PCSK9 на более чем 90% и снизило уровень общего холестерина на ~ 40 %.⁵⁰ Важным ограничением системы CRISPR-Cas9 S. pyogenes является то, что она слишком велика, чтобы поместиться в вектор AAV - предпочтительный вирусный вектор для применения генотерапии из-за его благоприятного профиля безопасности по сравнению с аденовирусными векторами. В последующем исследовании AAV использовался для доставки меньшего Cas9 из S.aureus и направляющей РНК, нацеленной на Pcsk9, в печень мыши; это исследование также продемонстрировало эффективное разрушение аллелей Pcsk9 в печени, снижение уровня циркулирующего белка PCSK9 на более чем 90% и снижение уровня общего холестерина на ~40%. В двух исследованиях изучалась возможность воздействия на Apob у мышей для снижения выработки и секреции липопротеиновых частиц в кровоток, тем самым снижая уровень холестерина в крови по другому механизму, чем ингибирование PCSK9^20,51; однако в обоих исследованиях был зафиксирован значительный печеночный стеатоз, что соответствует наблюдениям у людей с естественной потерей функции при мутации в APOB.⁵²

Хотя эти исследования обнадеживают, полученная в них информация не имеет прямого отношения к терапевтическим препаратам для человека. Ортологи генов мыши и человека существенно различаются по первичным нуклеотидным последовательностям (что имеет значение для эффективности, т.е. целевому мутагенезу), а также по геномам мыши и человека (что имеет значение для безопасности, т.е. вне-целевому мутагенезу. В последующем исследовании способность CRISPR-Cas9 разрушать ген PCSK9 человека в гепатоцитах человека in vivo была оценена с использованием модели гуманизированной печени мыши (основанной на Fah-/-Rag2-/-Il2rg-/- мыши, которая позволяет осуществлять контролируемую абляцию эндогенных гепатоцитов мыши), в которую были пересажены первичные гепатоциты человека и приживались в печени в больших пропорциях. S. pyogenes CRISPR-Cas9, доставленный аденовирусным вектором, эффективно нарушил ген PCSK9 человека и значительно снизил циркулирующие уровни белка PCSK9 человека.⁵³ Примечательно, что S.aureus CRISPR-Cas9 не проявил заметной активности против гена PCSK9 человека в гепатоцитах человека в той же модели с гуманизированной печенью (неопубликованные наблюдения), в отличие от вышеупомянутого исследования, в котором наблюдалась эффективная активность S.aureus CRISPR-Cas9 у мышей дикого типа.²⁰. Это говорит о том, что различные системы CRISPR-Cas9 могут иметь разную степень активности у разных видов, и подчеркивает важность тестирования терапевтических средств на основе CRISPR-Cas9 непосредственно в аутентичных клетках человека, а не экстраполировать их полностью на основе наблюдений в не-человеческих модельных системах.

Как уже упоминалось выше, непреднамеренный целевой и вне-целевой мутагенез вызывает наибольшую озабоченность в отношении безопасности редактирования генома с помощью CRISPR-Cas9. В вышеупомянутых исследованиях Pcsk9/PCSK9 и Apob не наблюдалось внецелевого мутагенеза в ограниченном количестве геномных участков, в которых, по прогнозам, наиболее вероятно возникновение мутаций, с оговоркой, что секвенирование ДНК нового поколения недостаточно чувствительно, чтобы распознать мутагенез, происходящий с частотой мнее 0,1%. Однако в одном из исследований Apob интеграция последовательностей вектора AAV в целевой сайт Apob наблюдалась с частотой 26%.⁵¹ Это наблюдение подчеркивает тот факт, что репарация NHEJ непредсказуема по своей природе, что потенциально может привести к непредвиденным последствиям даже в желаемом целевом сайте.

В принципе, редакторы оснований являются более безопасной альтернативой стандартному CRISPR-Cas9, поскольку отсутствие необходимости в разрывах двухцепочечной ДНК означает, что будет значительно снижен indels-мутагенез в мишени, а любой вне-целевой мутагенез будет в основном ограничен заменами цитозина на тимин. В целом, изменения цитозина на тимин будут более доброкачественными, чем indels или хромосомные перестройки, возникающие в результате двунитевых разрывов. Это справедливо даже для кодирующих последовательностей, поскольку из-за колебаний в генетическом коде многие изменения цитозина на тимин превращаются в синонимичные варианты, в то время как большинство сдвигов рамки считывания и внутрикадровых вставок или делеций являются пагубными. Кроме того, indels могут достигать размеров в килобазы и затрагивать множество генов.

Менее ясно, могут ли редакторы оснований сравниться со стандартным CRISPR-Cas9 по эффективности, хотя исследования in vitro показывают, что это действительно так⁵⁴. В недавнем исследовании, доказавшем свою эффективность, аденовирусный вектор, содержащий редактор оснований BE3 и направляющую РНК, нацеленную на Pcsk9, был введен мышам, что привело к введению сайт-специфических нонсенс-мутаций (изменение одного или обоих гуаниновых оснований в кодоне триптофана TGG (тимин-гуанин-гуанин) на адениновые основания, дающие стоп-кодоны) в 31% аллелей Pcsk9 в печени⁵⁵. Редактирование оснований снизило уровень циркулирующего белка PCSK9 на более чем 50% и снизило уровень общего холестерина на ~30%, утвердив редактирование оснований в качестве жизнеспособного терапевтического подхода. Не было обнаружено никаких признаков вне-целевого мутагенеза, ни indels, ни редактирования оснований. Основным ограничением данной работы является то, что редакторы оснований крупнее стандартных белков Cas9, что делает их еще более сложными для доставки с помощью AAV.

У некоторых пациентов преждевременный атеросклероз в значительной степени обусловлен одной мутацией, нарушающей функцию белка, например, аутосомно-доминантная гиперхолестеринемия, вызванная мутацией в LDLR, APOB или PCSK9. ^45,56,57 В принципе, редактирование генома может устранить такую мутацию с помощью нескольких различных стратегий: (1) использование HDR с синтетическим шаблоном восстановления или, если мутация представляет собой изменение тимина на цитозин или аденина на гуанин, посредством редактирования оснований, при котором исправляется мутантный аллель, (2) ослабление доминантного эффекта мутации путем NHEJ-опосредованного разрушения мутантного аллеля (при этом щадя аллель дикого типа), или (3) HDR-опосредованная вставка дополнительных копий дикого типа пораженного гена для ослабления эффекта мутантного аллеля.

В зависимости от используемой стратегии, эффективность редактирования по мишени имеющейся в настоящее время технологии CRISPR-Cas9 может оказаться недостаточной для достижения желаемой цели. Это особенно верно для использования HDR для исправления мутации или вставки копий генов дикого типа. Хотя последнее было успешно осуществлено в случае гемофилии на мышиной модели⁵⁸ , это заболевание можно лечить, если хотя бы небольшой процент клеток экспрессирует фактор свертывания крови, поскольку достижение только 5% от нормального уровня фактора достаточно для устранения наиболее серьезных аспектов заболевания. То же самое нельзя сказать о гиперхолестеринемии и сопутствующем ей риске атеросклеротического заболевания сосудов. На сегодняшний день наиболее успешное выполнение HDR в мышиной модели (дефицит орнитин-транскарбамилазы) привело к коррекции 10%-20% аллелей; примечательно, что такой уровень коррекции наблюдался у новорожденных мышей с быстро пролиферирующими гепатоцитами, но не у взрослых мышей с относительно статичными гепатоцитами, у которых наблюдалась коррекция только 1%-2% аллелей.⁵⁹ По этим причинам NHEJ и редактирование оснований являются более вероятными путями к успеху в профилактике атеросклероза в обозримом будущем.

В целом, следующие шаги по внедрению анти-атерогенных подходов к редактированию генома в клинике будут связаны с оптимизацией их эффективности и безопасности. В обоих случаях важным моментом является способ доставки. Поскольку аденовирусные векторы не рекомендуется использовать для людей из-за проблем безопасности, предпочтительным средством доставки вирусов являются AAV.^60,61 У AAV есть два недостатка, которые необходимо устранить. Во-первых, ограничение по размеру, присущее векторам AAV, не позволяет доставлять S. pyogenes Cas9 или базовые редакторы. Необходимо исследовать меньшие белки Cas9 из других видов бактерий, чтобы определить те, которые эффективны в гепатоцитах человека, но достаточно малы, чтобы их можно было разместить в AAV. Во-вторых, векторы AAV приводят к длительной экспрессии (т.е. от нескольких недель до нескольких месяцев) доставленных генов. Хотя это может быть выгодно для применения в генотерапии, длительная экспрессия Cas9 может быть контрпродуктивной, поскольку она может увеличить бремя вне-целевого мутагенеза и вызвать иммунологические реакции против Cas9-экспрессирующих клеток, тех самых клеток, в которых произошло желаемое редактирование генома. Действительно, развитие антител против Cas9 было зафиксировано у мышей, обработанных AAV.⁶² Одним из возможных решений является включение в вектор дополнительной направляющей РНК, нацеленной на сам ген Cas9, что приводит к расщеплению вектора и самоограничению продолжительности экспрессии.⁶³ Совершенно другим решением является использование липидных наночастиц для доставки мРНК Cas9 в гепатоциты, что снимает ограничение на размер, накладываемое AAV, а также обеспечивает Cas9 в форме, которая быстро разрушается в клетках.^64,65.

Хотя доклинические исследования, которые были проведены до настоящего времени, предоставили мало доказательств вне-целевого мутагенеза, ограниченная чувствительность секвенирования ДНК нового поколения не позволяет исключить редкие мутации. В контексте миллиардов клеток печени человека, на которые необходимо будет направить редактирование генома, редкие мутации все еще могут быть проблематичными. Кроме того, секвенирование ДНК следующего поколения может применяться только на отдельных участках генома, а не в масштабах всего генома, поэтому исследователям необходимо заранее определить участки, на которых, по их мнению, наиболее вероятно возникновение нецелевых мутаций вне мишени. Существуют методы эмпирического беспристрастного определения наиболее вероятных внецелевых участков генома, но на сегодняшний день эти методы ограничены экспериментами in vitro.^20,66-69 Для более точной оценки безопасности потенциальных терапий редактирования генома необходимы беспристрастные подходы, которые можно применять in vivo.

Хотя еще многое предстоит сделать на доклинических моделях животных, в конечном итоге терапию редактирования генома необходимо будет испытать на людях. Что касается атеросклеротических заболеваний сосудов, то лучшими кандидатами для первых исследований на людях будут пациенты, для которых потенциальные преимущества значительно перевешивают риски. К ним можно отнести (1) пациентов с аутосомно-доминантной гиперхолестеринемией, которые не могут повлиять на липиды с помощью существующих методов лечения, и (2) пожилых пациентов с высоким риском будущих коронарных событий (например, пациентов вторичной профилактики), которые имеют максимальные показания к липидоснижающей терапии. Что касается последних, то продолжительность их жизни будет достаточно ограниченной, чтобы наиболее опасное осложнение редактирования генома - развитие рака со временем - не стало серьезным фактором. После демонстрации эффективности и приемлемого профиля безопасности у этих отобранных пациентов, геном-редактирующая терапия может быть применена к более широкому кругу пациентов.