В последние годы быстро развивается с chimeric antigen receptor (CAR)-Т-клеточная терапия, которая обнаруживает большой потенциал в лечении рака^1-7. Тем не менее, некоторые ограничения все еще остаются, включая сложный процесс производства, высокую стоимость производства, длительное время подготовки и потенциальные проблемы безопасности существующих методов лечения. Использование вирусов для производства CAR-T клеток является одной из проблемных областей, поскольку недостатки этого подхода включают повышенный риск развития опухолей в результате инсерционного мутагенеза^8,9. Кроме того, специфические реакции на ДНК, получаемой с помощью вирусов, препятствуют экспрессии CAR^10,11, а производство вирусов часто требует больших затрат¹². Хотя некоторые стратегии, такие как использование систем транспозонов ^13-16 и трансдукция мРНК^17-19, используются для создания CAR-T клеток без помощи вируса, низкая однородность конечных продуктов, вызванная случайной интеграцией, и прекращение экспрессии CAR становятся дополнительными проблемами. Недавно несколько исследований показали, что технологии редактирования генома могут быть применены для создания локус-специфических интегрированных CAR-T клеток с использованием вектора адено-ассоциированного вируса (AAV) в качестве шаблона^20-22. Кроме того, была предложена одна преимущественная невирусная стратегия для получения Т-клеточных продуктов с коррекцией точечных мутаций и точной вставкой элемента Т-клеточного рецептора (TCR)²³. Таким образом, чтобы одновременно решить недостатки использования вирусов и случайной интеграции, мы разработали невирусные, ген-специфические целевые CAR-T клетки с помощью CRISPR-Cas9 и продемонстрировали их высокую безопасность и эффективность в лечении пациентов с relapsed/refractory B cell non-Hodgkin lymphoma (r/r B-NHLL).

Во-первых, мы стремились оптимизировать протокол для получения невирусных, ген-специфических интегрированных Т-клеток. Было установлено, что шаблон для гомологичной направленной репарации (HDR) в виде линейной двухцепочечной ДНК (dsDNA) обеспечивает высокую эффективность гомологичной рекомбинации и жизнеспособность клеток (рис. 1a и расширенные данные рис. 1a-c). Больше жизнеспособных клеток, несущих интегрированный целевой ген, было получено при электропорации стимулированных Т-клеток с использованием в 800-bp гомологичных плеч (рис. 1b,c и расширенные данные рис. 1d-k). После подтверждения оптимальности протокола, для доказательства концепции, мы сначала решили нацелить CAR-экспрессирующую кассету на безопасную гавань AAVS1, чтобы оценить, повлияет ли этот подход на свойства CAR-T клеток. Была сконструирована анти-CD19 CAR-последовательность, содержащая 4-1BB и CD3ζ (названная 19bbz). Эффективность интеграции 19bbz в AAVS1 составила около 10% (до 19,8%), а процент indels варьировал от 67% до 87% (рис. 1d,e и расширенные данные рис. 2a,m,n,q). Далее мы всесторонне сравнили AAVS1-интегрированные (AAVS1-19bbz) и произведенные лентивирусом (LV-19bbz) анти-CD19 CAR-T клетки. Хотя сама процедура электропорации приводила к некоторому повреждению клеток, экспансия Т-клеток не нарушалась, и после тщательного восстановления была обнаружена высокая жизнеспособность клеток (расширенные данные рис. 2b-d). Хотя заражение лентивирусом приводило к более высокому проценту CAR+ клеток среди CD4+ клеток, чем среди CD8+ клеток, интеграция между CD4+ и CD8+ клетками была несмещенной благодаря стратегии электропорации (расширенные данные рис. 2j). Примечательно, что электропорация увеличивала соотношение CD8+ и CD4+ Т-клеток по сравнению с лентивирусной трансдукцией (расширенные данные рис. 2k и 8d-f), что согласуется с результатами предыдущего исследования23. Мы наблюдали, что клетки AAVS1-19bbz реагировали на опухолевые клетки так же, как и клетки LV-19bbz (рис. 1f-h и расширенные данные рис. 2e). Напротив, были обнаружены некоторые различия в экспрессии клеточных маркеров и секреции цитокинов. Примечательно, что, как и клетки LV-19bbz, клетки AAVS1-19bbz энергично уничтожали опухолевые клетки in vitro и in vivo (рис. 1i,j и расширенные данные рис. 2f-i). В совокупности эти результаты демонстрируют, что стратегия получения невирусных, ген-специфических целевых CAR-T клеток вполне осуществима.

...

На основе наших доклинических экспериментальных данных мы провели клиническое исследование 1 фазы для оценки безопасности и эффективности клеток PD1-19bbz в лечении пациентов с r/r B-NHL (ClinicalTrials.gov, NCT04213469). В исследование были включены восемь пациентов, которые ранее не получали терапию CAR-T-клетками. В конечных вводимых продуктах средний процент интеграции CAR и indels PD1 составлял около 20% и 60%, соответственно (расширенные данные рис. 5a-e и дополнительная таблица 1). Вводимые продукты обуславливали жизнеспособность клеток более 90%, реагировали на опухолевые клетки-мишени и уничтожали их in vitro (расширенные данные рис. 5f-h). Низкочастотные события вне мишени на одном сайте в PHACTR1 (регулятор фосфатазы и актина 1), выявленные с помощью iGUIDE31, усовершенствованного метода несмещенного GUIDE-seq³², были подтверждены глубоким секвенированием (расширенные данные рис. 6 и дополнительные таблицы 2-4 и 8). Ожидалось, что истощение PHACTR1 не приведет к негативным последствиям, поскольку PHACTR1, по имеющимся данным, не экспрессируется в Т-клетках. Пациенты получали схему лимфодеплеции химиотерапии с использованием комбинированного циклофосфамида и флударабина, а затем одно введение клеток PD1-19bbz в дозе от 0,56 х 10⁶ до 2,35 х 10⁶ клеток на кг массы тела (расширенные данные рис. 7a,b, расширенная таблица 1 и дополнительные таблицы 5 и 6). Хотя у всех пациентов наблюдались преходящие и обратимые гематологические токсические явления, в основном связанные с предварительной химиотерапией, других нежелательных явлений высокого класса (≥3) обнаружено не было (Дополнительная таблица 7). У некоторых пациентов наблюдался легкий синдром высвобождения цитокинов (CRS), в то время как синдром нейротоксичности, связанный с иммунными эффекторными клетками (ICANS), не возникал (рис. 3a и расширенные данные рис. 7e-l). Клетки PD1-19bbz пролиферировали и сохранялись in vivo (рис. 3b,c и расширенные данные рис. 7m). В течение среднего периода наблюдения 12 месяцев полная ремиссия была достигнута у семи из восьми пациентов (87,5%), о чем свидетельствуют результаты позитронно-эмиссионной томографии и компьютерной томографии (PET-CT). Стойкие ответы были обнаружены у пяти пациентов на момент последнего наблюдения, в то время как рецидив заболевания был выявлен у двух пациентов через 6 месяцев (рис. 3d,e, расширенные данные рис. 7c,d и расширенные данные табл. 1). Частичная ремиссия наблюдалась у оставшегося пациента (1/8); таким образом, наилучшая достигнутая частота объективного ответа составила 100% у всех пациентов. Следует отметить, что клетки PD1-19bbz были эффективны даже при введении низкой дозы и низком проценте CAR+ клеток, что свидетельствует о высокой эффективности этих PD1-интегрированных CAR-T клеток. В совокупности эти данные демонстрируют, что невирусные, PD1-интегрированные CAR-T клетки обладают высокой безопасностью и эффективностью для пациентов с r/r?B-NHL...

CRISPR-Cas9-опосредованная HDR становится обычным методом для облегчения точной интеграции целевых последовательностей^36-38. Здесь мы создали специфическим геном интегрированные CAR-T клетки без использования вируса и продемонстрировали возможность их формального крупномасштабного производства для клинического применения. Насколько нам известно, мы первыми продемонстрировали безопасность и эффективность невирусных, специфическим геном целенаправленно интегрированных CAR-T клеток в клиническом испытании. При использовании невирусных, PD1-интегрированных анти-CD19 CAR-T клеток у пациентов с r/r B-NHL была обнаружена превосходная безопасность, при этом наблюдалась очень низкая частота легкого CRS и не было неврологической токсичности. Наши результаты также согласуются с двумя недавно проведенными клиническими испытаниями^39,40 и, соответственно, еще раз демонстрируют безопасность применения CRISPR-Cas9 при Т-клеточной терапии. С другой стороны, мы наблюдали высокую скорость и стойкость CR. В частности, ответы были обнаружены у двух пациентов с высокой экспрессией PD-L1, хотя позже у одного из них произошел CD19-рецидив, что подтверждает преимущество вмешательства PD1 в клетках PD1-19bbz. Удивительно, но несмотря на неожиданно низкую начальную дозу или одновременно низкий процент CAR+ клеток, вызванный ранним и еще преждевременным процессом производства, CR был достигнут у всех трех этих пациентов, что указывает на то, что невирусные, PD1-таргетированные CAR-T клетки обладают большей способностью убивать опухолевые клетки.

Наши доклинические и клинические данные показывают, что клетки PD1-19bbz обладают высокой эффективностью против опухолевых клеток, что можно объяснить двумя особенностями. Во-первых, данные scRNA-seq показали, что среди клеток PD1-19bbz имеется высокий процент Т-клеток памяти. Интересно, что эта характеристика существовала в обоих типах невирусных, ген-специфических интегрированных клеток, независимо от того, куда была вставлена последовательность CAR, предполагая, что метод электропорации с использованием экзогенной линейной двухцепочечной ДНК может в конечном итоге производить больше Т-клеток памяти в инфузионных продуктах. Это превосходство было подтверждено доклиническими экспериментами, показавшими, что клетки AAVS1-19bbz более эффективно уничтожали клетки Raji при низкой дозе инфузии, чем клетки LV-19bbz, а клетки PD1-19bbz продемонстрировали более высокую способность уничтожать опухолевые клетки с высокой экспрессией PD-L1, чем клетки LV-19bbz_PD1-KO, хотя нокаут PD1 был достигнут в обоих типах клеток. Во-вторых, результаты GSEA показывают, что нарушение PD1 наделяет клетки PD1-19bbz усиленными противоопухолевыми иммунными функциями. Это преимущество было подтверждено тем, что клетки PD1-19bbz более энергично уничтожали опухолевые клетки по сравнению с клетками AAVS1-19bbz в мышиных моделях. Примечательно, что это превосходство наблюдалось даже в опухолевых клетках с низкой экспрессией PD-L1. Одно из возможных объяснений этого заключается в том, что потеря PD1 может ослабить иммунную супрессию, вызванную включением PD-L1 на Т-клетках, о чем недавно сообщалось⁴¹. Другое объяснение заключается в том, что другие пути противоопухолевого иммунитета, не зависящие от PD-L1, ослабляются при снижении уровня PD1^42-44. Более того, учитывая, что ингибирующие рецепторы, параллельные функции PD1, такие как LAG3, TIM3 и TIGIT, все еще высоко экспрессируются в клетках PD1-19bbz после клинического введения, одновременное вмешательство в несколько путей обещает еще больше усилить функцию CAR-T клеток.

В этом исследовании мы описываем новую стратегию создания невирусных, ген-специфических целевых CAR-T клеток с помощью CRISPR-Cas9. Эта технология является передовой благодаря сочетанию преимуществ невирусных производственных процессов и точного редактирования генома. Благодаря подходу "два в одном" без использования вирусов упрощается процедура производства, сокращается время подготовки, снижаются производственные расходы, повышается безопасность и эффективность продуктов CAR-T клеток. Эти преимущества важны, особенно для генерации ген-модифицированных CAR-T клеток, где обычно требуется и подготовка вируса, и процесс редактирования генома. Кроме того, локус-специфическая интеграция повышает однородность CAR-T клеток и делает возможным использование универсальных клеточных продуктов. Важно отметить, что мы показываем возможность применения этой технологии от стенда до кровати и демонстрируем ее высокую безопасность и эффективность в клинических испытаниях. Таким образом, мы предлагаем инновационную технологию CAR-T для преодоления существующих барьеров и демонстрируем значительный потенциал невирусной, генно-специфической таргетной технологии CRISPR-Cas9 в клеточной терапии.