Поскольку трансгены, введенные в случайные геномные места, могут взаимодействовать с геномом непредсказуемым образом, последние подходы к доставке генов направлены на геномные локусы-убежища (harbor), которые были оценены на предмет предсказуемой экспрессии трансгенов при минимизации нежелательных взаимодействий (16). Johnson и др. (17) вставили акцептор сплайсинга и флуоресцентный репортерный ген в место разреза CRISPR-Cas в локусе S1 адено-ассоциированного вируса (AAV) для экспрессии с использованием эндогенных промоторов В-клеток человека. Hung et al. (18) вставляли трансгены терапевтических белков под контролем экзогенных промоторов в локус безопасного убежища CCR5, поскольку этот локус не является транскрипционно активным в В-клетках человека, он не требуется для дифференцировки плазматических клеток, а нулевые мутации безвредны для человека. В рамках уникального подхода к редактированию BCR, Pesch и др. (19) модифицировали мышиные В-клетки для экспрессии нового химерного BCR (CBCR) в локусе безопасного убежища (гавани) Rosa26. Одноцепочечный вариабельный фрагмент, действующий как внеклеточный Ag-связывающий домен, был присоединен к трансмембранному домену CD28, а цитоплазматический домен эндогенного мышиного BCR был слит с внутриклеточным сигнальным доменом CD79 через спейсер, кодирующий метку Strep. CBCR потенциально могут предложить способ активации сконструированных В-клеток Ag-контролируемым образом (путем вакцинации), независимо от эндогенного BCR (19). Luo и др. (20) нацелили кассету с анти-PD-1 Ab на локус GAPDH в первичных В-клетках мыши для коэкспрессии трансгена вместе с ферментом GAPDH.

Искусственная вставка Ab-трансгенов в локусы Ig, где они могут экспрессироваться с использованием экзонов константного гена H-цепи эндогенных В-клеток, позволяет им функционировать как BCRs и впоследствии как секретируемые терапевтические Abs из долгоживущих плазматических клеток (рис. 1). Voss и др. (21) заменили весь локус VH между удаленными (1 МБ) сайтами разреза CRISPR-Cas9 шаблоном гомологической репарации, содержащим последовательность VDJ из кодирующего H-цепь ВИЧ bnAb, в В-клетках человека. Сконструированная Н-цепь может экспрессироваться с использованием эндогенных для клеток промоторов V-гена, экзонов константного гена Н-цепи и L-цепи. Эти антитела могут широко распознавать ВИЧ, а сконструированные клеточные линии могут быть аффинно созревшими in vitro; однако низкая эффективность преобразовании в первичных клетках ограничивает клиническое применение (21). Greiner и др. (22) продемонстрировали, что шаблоны гомологической репарации могут заменять или вставляться в обычно рекомбинируемые области VDJ и VJ в зрелых первичных В-клетках человека. Трансгены экспрессировались в первичных В-клетках человека с использованием этих эндогенных промоторов генов V (22). Несколько групп пришли к высокоэффективному инженерному решению, которое заключается в том, что шаблон гомологической репарации Ab, кодирующий промотор V-гена IgH, L-цепь (включая константный ген), вариабельную область H-цепи (VDJ) и сайт донора сплайсинга, вводится в локус H-цепи между самым 3-м J-геном и расположенным ниже по течению усилителем V-гена и областью константного гена. Таким образом, Ab L и H цепи экспрессируются с одного транскрипта, сплайсированного с эндогенными для клетки константными генами H цепи. Гибкий линкер или само-расщепляющийся пептид P2A помещаются между L- и H-цепями, чтобы позволить им соединиться для секреции в качестве функциональных BCR или Ab (рис. 1). Hartweger и др. (23) включили акцептор сплайсинга, стоп-кодон и терминаторную последовательность перед промотором V-гена донорской ДНК, чтобы остановить транскрипцию эндогенных перестроенных последовательностей VDJ, расположенных выше по течению, и само-расщепляющийся пептид P2A между L- и H-цепями. Они использовали белок CRISPR-Cas9 в комплексе с gRNA (рибонуклеопротеин [RNP]) для нацеливания indels в эндогенную L-цепь κ константного гена, чтобы минимизировать неправильное сопряжение с эндогенными L-цепями. Они показали, что созданные ex vivo-инженерные мышиные В-клетки могут выделять ВИЧ bnAb 3BNC60 с переключением класса в течение нескольких дней после адоптивного переноса сородичам иммунокомпетентных мышей (23). Moffett и др. (24) использовали 54-аа линкер для соединения L и H цепей, чтобы предотвратить неправильное сопряжение с эндогенными L цепями. Они смогли добиться высокоэффективной инсерции, когда до 60 или 24% клеток-мишеней экспрессировали сконструированный BCR в первичных В-клетках человека и мыши, активированных ex vivo-активацией, соответственно. Две донорские ДНК для Ab могут быть нацелены на оба аллеля H-цепи в 6% В-клеток с двойной нацеленностью. Они также показали, что защитные уровни антител патоген-специфического респираторно-синцитиального вируса (RSV) могут выделяться из сконструированных клеток в течение нескольких дней после адоптивного переноса конгенным иммунокомпетентным мышам или в течение нескольких недель в виде плазматических клеток, трансплантированных в костный мозг иммуно-скомпрометированных мышей (24). Nahmad и др. (25) показали, что первичные мышиные В-клетки, созданные для экспрессии ВИЧ bnAb 3BNC117 в качестве рецептора Ag, могут созревать в GCs после адоптивного переноса и вакцинации врожденных иммунокомпетентных мышей, что приводит к переключенному по классу и соматически мутированному ответу клеток памяти и плазматических клеток (25). Huang и др. (26) показали аналогичные результаты на мышах, используя В-клетки, созданные на основе ВИЧ bnAb VRC01, и что такие ответы могут быть долговечными и многократно усиливаться. Они также показали, что ex vivo-активированные первичные клетки мыши в дальнейшем экспрессируют маркеры памяти и остаются подверженными механизмам периферической толерантности, которые удаляют аутореактивные клетки после адоптивного переноса иммунокомпетентным животным. Кроме того, они разработали альтернативную стратегию преобразований, при которой области VH и VL в отдельных донорских ДНК были направлены на их эндогенные локусы для экспрессии с помощью клеточно-нативных константных генов. Однако клетки, созданные таким образом, не отвечали на иммунизацию после адоптивного переноса иммунокомпетентным мышам (26).



FIGURE 1. CRISPR-Cas9 Ig locus editing. Schematic representation of the targeting strategies used to engineer the Ig loci of primary B cells. The human ? and ? L chain loci lie on chromosomes 2 and 22, respectively, and both mouse L chain loci lie on chromosome 6. The L chain loci comprises V, J, and C regions. The H chain locus lies on the human chromosome 14 and the mouse chromosome 12. The H chain locus comprises V, D, J, and C regions. Cutting sites used by different groups for transgene insertion are indicated by dashed arrows, and cutting sites for L chain ablation are indicated by an "x." Depictions of the expression cassettes for each group are depicted in circles of dashed lines [purple (25), blue (29), red (26), green (27), orange (28), and yellow (30)].

В-клетки обладают рядом иммунных эффекторных функций, которые делают их интригующими мишенями для генетической модификации, включая: 1) их способность к клональному росту и дифференцировке в долгоживущие клетки памяти и плазматические клетки, способные секретировать большое количество высокоспецифичных Abs, 2) их способность функционировать в качестве APCs, поддерживая эффекторные T-клеточные и фолликулярные хелперные реакции, и 3) выработка ими воспалительных или иммуносупрессивных цитокинов (27). Эти характеристики делают их перспективными клетками для лечения генетических заболеваний (18, 19, 28), инфекционных заболеваний (20-24, 26, 29, 30), рака (20, 22, 31, 32) и аутоиммунных заболеваний (22).

В-клетки являются естественными секреторными клетками для Abs и цитокинов, что делает их идеальной клеткой-мишенью для генотерапии, выбранной для секреции терапевтических белков, имеющих клиническое значение для моногенных заболеваний (18, 24, 33, 34). Основной проблемой заместительной белковой терапии является способность поддерживать эффективную сывороточную концентрацию желаемого экзогенного белка в течение длительного времени, не вызывая при этом противолекарственных иммунных реакций, которые могут снизить или нейтрализовать терапевтический эффект (35). Поскольку плазматические клетки могут сохраняться в течение всей жизни, одна инъекция сконструированных плазматических клеток, секретирующих высокие дозы терапевтических белков, может служить пожизненным лекарством. В качестве альтернативы, сконструированные В-клетки, экспрессирующие как секретируемый терапевтический белок, так и Ag-специфический BCR, можно регулировать in vivo для экспрессии трансгена путем вакцинации, как продемонстрировали Takacs и др. (33), используя адоптивный перенос и иммунизацию Ig knock-in мышиных В-клеток, экспрессирующих терапевтические трансгены. Более того, презентация Ag В-клетками часто приводит к толерантности Т-клеток (36-38), что повышает вероятность того, что экспрессия трансгенов В-клетками может вызвать менее нейтрализующий анти-лекарственный иммунный ответ по сравнению с инъекционной белковой или генной терапией, которая приводит к выделению экзогенного белка из других тканей, таких как печень или мышцы (39). Большинство иммунокомпетентных моделей мышей, использованных для изучения in vivo преобразованных В-клеток, до настоящего времени использовали штамм Black 6 (C57BL/6 или B6), поскольку эта инбредная модель является наиболее надежной для экспериментов по врожденному адоптивному переносу клеток, в которых донорские клетки не воспринимаются иммунной системой животных-реципиентов. Было показано, что этот штамм также переносит чужеродные трансгенные белки, такие как человеческий фактор IX, α-1 трипсин и человеческий эритропоэтин (40-42), и поэтому он не может быть идеальным выбором для экспериментов, направленных на изучение толерогенных свойств В-клеток. Гуманизированные мышиные модели часто используются для оценки искусственно преобразованных Т-клеточных терапий, в которых иммунодефицитным мышам вводят человеческие HSCs, способные восстанавливать иммунную систему человека. Хотя стволовые клетки способны дифференцироваться в основном в переходные или незрелые В-клетки в этих моделях, вызванное Ag созревание В-клеток с памятью и дифференцировкой плазматических клеток остается сложным (43). Адоптивный перенос CD19+ В-клеток человека, модифицированных ex vivo для экспрессии трансгена, вместе с аутологичными CD4+ Т-клетками человека иммунодефицитным мышам NOD scid γ (NSG), позволил разработанным В-клеткам поселиться в селезенке и костном мозге, генерируя плазматические клетки через 4-5 недель. Считается, что приживление (homing) обусловлен экспрессией важнейших homing рецепторов CD62L, CXCR4 и LFA1 на отдельных трансдуцированных плазматических клетках. Levy и др. (28) использовали эту модель для трансдукции В-клеток для секреции человеческого FIX, фактора свертывания крови, дефицит которого наблюдается у пациентов с гемофилией В, на терапевтическом уровне. Hung et al. (18) показали, что BAFF может быть доставлен в первичные В-клетки человека, и эти клетки показали улучшенное приживление и секрецию Ab у мышей NSG после дифференцировки ex vivo в плазматические клетки.

Вакцины предназначены для обеспечения защиты от инфекционных заболеваний, часто путем выработки специфических для патогена нейтрализующих антител. Однако традиционные вакцины не смогли создать bnAbs, способные обеспечить универсальную защиту от патогенов с разнообразными и быстро развивающимися иммунодоминантными регионами, таких как ВИЧ, грипп и гепатит С (44, 45). Важность этой проблемы подчеркивается частым распространением антигенно отличающихся патогенных коронавирусов среди людей, что привело к текущей пандемии COVID-19 (46), и антигенным дрейфом пандемического штамма SARS-CoV-2, который поставил под угрозу эффективность нейтрализующих Ab-ответов, генерируемых утвержденными вакцинами (47). Способность вызывать bnAbs из сконструированных В-клеток может произвести революцию в разработке вакцин против таких изменчивых патогенов, когда традиционные подходы не работают. Программирование созданных изотипов Ab также может быть полезным. Cheong и др. (48) разработали метод индукции переключения изотипов, имитируя расщепление AID (активацией-индуцированная цитидиндеаминаза) с помощью CRISPR-Cas. Например, было установлено, что IgA способствует нейтрализации SARS-CoV-2 в большей степени по сравнению с другими изотипами (49) и может быть запрограммирован в bnAb-инженерных клетках. Инфузия мАб была изучена для лечения нескольких заболеваний, включая COVID-19 (50), но этот подход не является идеальным для терапии в случае хронических вирусных инфекций или в качестве стратегии профилактики, поскольку короткий период полураспада моноклональных антител (mAb)(1-3 недели) требует повторного введения, что создает практические и финансовые проблемы (51). Иммуногенность терапевтического mAb для некоторых пациентов (~7%) также является проблемой (52, 53). Для получения Ab in vivo из популяций не-B-клеток использовались традиционные подходы генотерапии. Векторная доставка генов Ab в мышечные клетки была разработана как стратегия для создания долгосрочной экспрессии защитных Abs (39, 54, 55). Недостатком этого подхода является фиксированное количество продуцируемых Ab, которое не реагирует на динамичную инфекцию. Кроме того, такой подход не способен стимулировать естественный иммунный ответ для развития клеточной и гуморальной памяти, необходимой для успешной и долгосрочной вакцинации. Как было наглядно продемонстрировано в одном из исследований с использованием макак-резусов, которым вводили вектор, кодирующий анти-ВИЧ bnAbs, также существует проблема разработки Abs, нейтрализующих трансгенные bnAbs (39). Кроме того, уже существующий иммунитет к вирусным векторам может вызвать низкий уровень экспрессии трансгенных Ab (56, 57).

Само-обновляющиеся HSCs также были нацелены на производство анти-патогенных Ab, поскольку стволовые клетки способны дифференцироваться в В-клетки и плазматические . Этот подход имеет потенциальное преимущество, заключающееся в замыкании рекомбинации V(D)J для предотвращения генерации эндогенных Igs во время развития В-клеток и непрерывной генерации трансген-экспрессирующих В-клеток in vivo. Несколько групп использовали векторы LV, кодирующие секретируемые bnAbs против ВИЧ, для редактирования HSCs (8, 29). Такая доставка bnAbs через HSCs была способна к постоянной секреции, проникновению в соответствующие ткани вирусного резервуара и стимулированию защитного иммунного ответа у гуманизированных мышей (30). Однако современная генотерапия HSCs включает в себя забор HSCs у пациента, генную инженерию ex vivo и обратное введение после миелоаблативного кондиционирования. Эта процедура практически не подходит для целей вакцинации из-за сопутствующих токсических эффектов и риска низкого приживления.

До недавнего времени генная инженерия В-клеток была ограничена техническими проблемами, включая доставку реагентов для редактирования генома, сложность разработки нативных Ab, а также культуру и дифференцировку HSCs и первичных В-клеток. Недавно CRISPR-Cas позволил использовать методы перепрограммирования новых специфичностей Ag-рецепторов в В-клетках, что может помочь преодолеть трудности, связанные с вызовом защитного ответа против антигенно изменчивых патогенов (58). Система CRISPR-Cas9 была использована для создания BCR, специфичных для ВИЧ (21, 23-26), RSV, вируса гриппа и EBV (24) в В-клетках, и эти клетки могут быть вакцинированы in vivo для генерации сконструированных Ab memory responses у мышей (25, 26). В целом, потенциальные преимущества экспрессии Ab-трансгенов из BCR-инженерных В-клеток для применения при инфекционных заболеваниях заключаются в следующем: 1) титры могут быть повышены при вакцинации или в ответ на инфекцию, 2) созданный Ab ответ может созревать по сродству против быстро эволюционирующих патогенов, 3) созданные Ab могут быть экспрессированы как все эффекторные изотипы, и 4) созданные Ab должны переноситься иммунной системой и уничтожаться в случае само-реактивности.

Хотя для этого не требуется редактирование генома В-клеток, функцию представления Ag В-клетками потенциально можно использовать для инициирования Т-клеточного ответа, направленного на раковые неоантигены. Действительно, на ранней стадии было проведено несколько клинических испытаний вакцин против рака на основе В-клеток, во многих из которых использовался путь CD40 для активации В-клеток для презентации раковых Ag (59). В-клетки были нагружены Ag посредством BCR-опосредованного поглощения (60), нацеливания на рецептор CD19 (61) или посредством микрофлюидической загрузки (62). Выделение и обогащение В-клеток с определенной противоопухолевой специфичностью из места опухоли или окружающих лимфатических узлов - еще один подход, который показал определенные перспективы (63).

mAbs также используются для усиления иммунного ответа. В качестве примера можно привести терапию блокадой контрольных точек, в которой используются Abs, нацеленные на PD-1, PD-L1 или CTLA-4, для активации противораковых эффекторных функций Т-клеток (64). Кроме того, химерные с Ag рецептором (CAR), Т-клетки, отредактированные для воздействия на опухоль-ассоциированные Ags, достигли больших клинических результатов в лечении множественной миеломы (65). CAR-T-клетки даже были модифицированы для конститутивного выделения ингибирующих контрольно-пропускных пунктов Abs, таких как анти-PD-1 (66) и анти-PD-L1 (67). Luo и др. (20) отредактировали для экспрессии анти-PD-1 Ab в локусе GAPDH с помощью дефектных по интегразе векторов LV, содержащих либо CRISPR-Cas9 и gRNA, либо шаблон гомологической репарации. Сконструированные В-клетки продемонстрировали противоопухолевую активность, сопоставимую с существующими анти-PD-1 моноклональными Ab в мышиной модели опухолевого ксенотрансплантата (20). Недостатком этого подхода является то, что сконструированные клетки, экспрессирующие Abs, нацеленные на само-антигены, должны будут обойти деактивацию периферической толерантностью (26), а постоянная секреция Ab на КПП (checkpoint) может вызвать чрезмерную активацию иммунной системы и усилить аутоиммунитет Т-клеток против пациента (68). Одним из возможных решений может быть редактирование этих клеток для экспрессии стабильного маркера селекции или гена самоубийства, который может быть использован для уничтожения сконструированных клеток и предотвращения неблагоприятных побочных эффектов. Дополнительным применением редактирования В-клеток является индукция хромосомных транслокаций для создания новых моделей для изучения злокачественных В-клеточных опухолей. Johnson и др. (17) смоделировали транслокацию t(8;14), характерную для лимфомы Burkitt, используя РНК, нацеленные на c-Myc и локус IgH.

Аутоиммунные заболевания развиваются при нарушении механизмов самотолерантности, в результате чего иммунная система атакует собственные клетки организма. Известно, что В-клетки играют посредническую роль в аутоиммунитете посредством выработки аутоантител, презентации "собственных протеинов" Т-клеткам и секреции цитокинов (69, 70). Было проведено несколько исследований по редактированию активированных первичных В-клеток ex vivo для индукции толерантности к само-антигенам посредством ретровирусной доставки трансгенов, кодирующих Ags, слитых с толерогенной Fc-областью цепи Ig H (71). Было показано, что адоптивный перенос таких генетически модифицированных В-клеток вызывает толерантность в животных моделях заболеваний, включая диабет (72), рассеянный склероз (73), ревматоидный артрит (74), задний увеит (75), гемофилию (76) и экспериментальный аллергический энцефаломиелит (77). Еще одно потенциальное применение редактирования В-клеток для лечения аутоиммунных заболеваний заключается в секреции Abs, направленных против воспалительных цитокинов (например, TNF-α и IL-6) (22, 77). Однако использование in vivo сконструированных В-клеток, которые постоянно выделяют Abs, специфичные к самоантигенам, может быть проблематичным, как описано ранее. Вмешательство в аутоиммунное заболевание без чрезмерного нарушения нормального иммунного ответа остается сложной задачей.

Delivery methods