Чтобы определить осуществимость системного редактирования генов в качестве терапевтического подхода к лечению CF, мы использовали мышиную модель CF, гомозиготную по мутации F508del в экзоне 11. На основе нашей предыдущей работы по локальной интраназальной доставке PNA NPs этим мышам (16), мы разработали tail-clamp молекулы PNAs, которые присоединяются вблизи сайта мутации с гомопуриновыми/гомопиримидиновыми участками (рис. 1A). Здесь мы использовали модифицированные мономеры PNA с мини-полиэтиленгликолевой (PEG) группой в γ-положении, включенной в последовательность PNA в домене Hoogsteen. Модифицированные PNAs обладают усиленным связыванием с ДНК (29); ранее мы продемонстрировали соответствующее усиление коррекции генов ex vivo и in vivo с использованием этих модифицированных PNAs у мыши с β-талассемией (21), а также в эпителиальных клетках бронхов человека CF (CFBEs), гомозиготных по мутации F508del (30). Мы также разработали одноцепочечный корректирующий шаблон донорской ДНК для введения 3 нуклеотидов (нт), соответствующих геномной последовательности дикого типа. Молекулы PNA и донорной ДНК были загружены в полимерные NPs в молярном соотношении 2:1 (рис. 1В), состоящие из PLGA, созданного с использованием метода двухэмульсионного испарения растворителя, как описано ранее (17, 21). Полученные NPs были сферическими и ~250 нм в диаметре, что было охарактеризовано с помощью динамического рассеяния света (DLS) (таблица S1) и сканирующей электронной микроскопии (SEM) (рис. S1). Эти NPs были введены как in vitro в культурах ALI первичных эпителиальных клеток дыхательных путей, так и in vivo путем системной внутривенной инъекции мышам F508del-CFTR.



Fig. 1. PNA-based gene editing agents can be encapsulated into PLGA NPs, which exhibit accumulation in the lung and GI tract following systemic intravenous administration.

(A) Schematic of PNA design to correct F508del-CFTR, indicating the incorporation of ?PNA monomers and the formation of the PNA/DNA/PNA triplex. (B) PNA and donor DNA in vitro and in vivo delivery strategy: Encapsulation into polymeric PLGA NPs. (C) Representative IVIS images indicating biodistribution of Cy5-conjugated PLGA NPs at 3, 6, 24, and 48 hours after intravenous administration in vivo compared to an untreated control animal (CTL). (D) Flow cytometry mean fluorescence intensity values normalized to untreated control animals (nMFI) for homogenized bulk lung and specific cell types (CD45+ macrophages, CD31+endothelial cells, EpCAM+ epithelial cells, and NGFR+ basal cells) at 3, 6, 24, and 48 hours after intravenous administration of Cy5-conjugated PLGA NPs in vivo. Each dot represents data from one mouse. (E) Flow cytometry mean fluorescence intensity values normalized to untreated control animals (nMFI) for homogenized bulk liver, spleen, and kidney at 3, 6, 24, and 48 hours after intravenous administration of Cy5-conjugated PLGA NPs in vivo. Each dot represents data from one mouse. (F) Flow cytometry mean fluorescence intensity values normalized to untreated control animals (nMFI) for homogenized bulk brain, heart, pancreas, stomach, duodenum, jejunum, ileum, cecum, colon, rectum, and ovaries/testes at 3, 6, 24, and 48 hours after intravenous administration of Cy5-conjugated PLGA NPs in vivo. Each dot represents data from one mouse. a.u., arbitrary units.

...

Описанный здесь терапевтический подход к CF сочетает в себе технологию редактирования генов с помощью PNAs на основе не-нуклеазной технологии с системной доставкой биосовместимых полимерных NPs для достижения коррекции генов в нескольких типах тканей in vitro и in vivo. Улучшенные молекулы PNAs, содержащие структурно-модифицирующие γ-замены, продемонстрировали фенотипическую коррекцию и редактирование генов без нежелательного образования indels при совместной доставке с донорской ДНК in vitro, в первичные NECs, выделенные из мышей, несущих F508del-ассоциированную мутацию CF, и in vivo в той же модели мыши. Усиленное редактирование генов с помощью модифицированных PNAs согласуется с результатами нашей предыдущей работы в контексте другого заболевания (21). Мы считаем, что это первое доказательство системной доставки in vivo агентов для редактирования генов с целью исправления мутации, вызывающей CF, в нескольких органах.

С точки зрения безопасности, как терапевтическая комбинация PNAs с донорской ДНК, так и полимерное средство доставки не проявили заметных побочных эффектов. Низкий уровень вне-целевых геномных мутаций и хорошо переносимая системная доставка имеют первостепенное значение для клинического применения терапевтических средств редактирования генов. Предполагаемая корректирующая вставка CTT (цитозин-тимин-тимин) длиной 3 п.н. была обнаружена в целевом сайте как с помощью ddPCR, так и с помощью глубокого секвенирования, при этом не было выявлено никаких непредвиденных последствий в виде отступов во фланкирующих последовательностях. Несмотря на значительный прогресс, достигнутый в области методов определения вне-целевых мутаций в масштабах генома для технологий редактирования на основе нуклеаз (49-52), наши возможности оценки потенциальных внецелевых эффектов технологии редактирования на основе PNAs по-прежнему ограничены гомологией последовательностей. Как и ожидалось для молекул PNAs со специфичностью последовательности, глубокое секвенирование множества сайтов с частичной гомологией с сайтом связывания PNA не выявило никаких вне-целевых эффектов, превышающих фоновые показатели мутаций/ошибок считывания in vitro в обработанных NECs и in vivo в легких и толстой кишке обработанных мышей. Дополнительные опасения при системной доставке терапевтических средств редактирования генов связаны с потенциальными неблагоприятными последствиями редакторов или средств доставки (53). PNA NPs не проявляли системной токсичности, о чем свидетельствуют результаты химического анализа сыворотки крови по сравнению с необработанными или пустыми контрольными NPs . И последнее, особенно для внутривенно вводимых терапевтических средств, риск попадания на цель или вне цели или активности в несоответствующих тканях подчеркивает необходимость обеспечения надлежащего тканевого тропизма. Хотя мы наблюдали широкое биораспределение NPs в различных тканях, кроме эпителия дыхательных путей и ЖКТ, мы не наблюдали никакой патологии в тканях с особенно высоким накоплением NPs, включая печень и селезенку.

Представленная здесь работа закладывает основу для системного редактирования генов in vivo для коррекции CFс помощью PNA NPs . На сегодняшний день существует мало исследований, описывающих системную внутривенную вне-печеночную доставку терапевтических агентов редактирования генов, особенно у животных моделей заболеваний. В одном из недавних исследований сообщалось о 5-7,3% indels, произведенных рибонуклеопротеинами Cas9, инкапсулированными в липидные NPs (LNPs), в печени после внутривенного введения мышам дикого типа для редактирования локуса PCSK9 (54). Другое исследование компании Intellia Therapeutics аналогичным образом показало впечатляющее редактирование печени с помощью CRISPR-Cas9 LNPs до ~60% в доклиническом исследовании транстиретинового амилоидоза (55); результаты клинических испытаний также были многообещающими (56). Rosenblum и др. (57) сообщают о ~80% редактировании в модели опухоли яичника, но при внутрибрюшинном введении LNPs, инкапсулирующих реагенты CRISPR-Cas9, нацеленные на PLK1. Важно отметить, однако, разницу между точной коррекцией, достигнутой нашими PNA/DNA NPs , и разрушением генов с помощью CRISPR-Cas9. В приведенных выше примерах нарушения генов с помощью CRISPR-Cas9 редактирование оценивается по сумме частот вставок, замен и делеций в целевом сайте, а не по частоте только вставки на 3 п.н., как в нашем исследовании. Мы не наблюдали никаких непреднамеренных indels и сообщаем только о легитимных исправлениях функционального генотипа. Хотя ответ на лечение PNA/DNA NPs в когорте исследованных мышей был различным, а частота отредактированных аллелей была скромной, мы наблюдали как фенотипическую, так и генотипическую коррекцию внепеченочных тканей in vivo. Вариабельность ответа на лечение, вероятно, частично объясняется вариабельностью исходных фенотипических проявлений заболевания. Кроме того, как показано на рис. 1, доставка NPs в органы-мишени также варьирует у разных животных. И наконец, чтобы провести параллель с данными по человеку, следует отметить, что у пациентов с CF, которые имеют право на высокоэффективную терапию модуляторами (Trikafta), даже пациенты с одинаковым генотипом CF демонстрируют различный ответ на лечение (58). Мы обнаружили, что повышенные уровни коррекции генов хорошо коррелируют с результатами фенотипических анализов. По оценкам ряда исследований, исправление CFTR в ~5-15% клеток эпителия должно восстановить трансэпителиальную секрецию хлоридов до уровня, близкого к дикому типу, что позволяет предположить, что in vivo исправление даже части клеток может принести терапевтический эффект (27, 59-63). Хотя мы не наблюдали редактирования в таком диапазоне в наших системных исследованиях in vivo, наши результаты позволяют предположить, что даже скромные уровни редактирования могут привести к частичному восстановлению транспорта хлоридов. По сравнению с системной доставкой, местная интраназальная доставка γPNA/DNA NPs привела к фенотипам, более устойчивым в диапазоне дикого типа. В свете этих результатов, местная доставка в эпителий дыхательных путей может быть объединена с системной доставкой для максимальной коррекции фенотипов во многих органах, пораженных CF. Системная доставка, в частности, может быть усовершенствована в качестве терапевтической стратегии. Например, для повышения эффективности могут быть использованы усовершенствования в конструкции транспортных средств, включая модификаторы поверхности для воздействия на конкретные типы клеток, а также использование различных полимерных материалов и методов составления рецептур для изменения размера, заряда поверхности и состава НП с конечной целью изменения эффективности инкапсуляции и тропизма к тканям, особенно к ЖКТ (64). Помимо инженерии NPs, более глубокое изучение параметров дозирования и частоты введения также позволило бы выяснить пределы этого подхода.

Длительность ответа на лечение также является важным фактором для применения терапевтических средств редактирования генов. Мы наблюдали ослабление реакции на лечение с течением времени, которая сменялась на противоположную при проведении дополнительных курсов лечения. Оптимизация доставки препарата к целевым стволовым клеткам будет ключом к получению одноразового излечения.