Углерод занимает шестое место в периодической таблице, его средняя атомная масса равна 12 amu (atomic mass unit). Различные аллотропы углерода возникают из-за разницы в порядке расположения атомов углерода. Хотя существует аморфная форма углерода, ею в основном пренебрегают, поскольку эта структура не поддается легкому контролю, как кристаллические аллотропы [1].

Среди кристаллических аллотропов углерода алмаз - единственный, который образует прочные сигма-связи с другими атомами углерода, используя все (4) валентных электрона. Алмаз имеет нестабильную грань-центрированную кубическую кристаллическую структуру, как показано на рис. 1. Графит - еще один аллотроп углерода, представленный в виде слоев атомов углерода, соединенных слабыми силами Ван-дер-Ваальса. Кроме того, каждый слой графита состоит из плоской гексагональной формации атомов углерода (рис. 1) [1]. Кроме того, графен - это основная структура графита, состоящая из двумерного (2D) одного или нескольких слоев sp2-ранжированных атомов углерода [2]. Любая углеродная структура с полым, сферическим, трубчатым или эллипсоидным расположением атомов углерода называется фуллереном, название которого происходит от имени архитектора Buckminister Fuller , изготовившего в 1960-х годах геодезический купол из атомов углерода, напоминающий клетку [3]. Позже, в 1991 году, когда Ijima исследовал структуры фуллеренов, он обнаружил структуру углеродных нанотрубок. Углеродные нанотрубки (CNTs) имеют два основных класса: одностенные углеродные нанотрубки (SWCNTs) и многостенные углеродные нанотрубки (MWCNTs). SWCNT состоят из одного единственного слоя графенового листа, в то время как последние включают несколько концентрических графеновых слоев (рис. 1) [4]. Кроме того, углеродные квантовые точки (CDs) представляют собой нано-кристаллы углеродных материалов с размерами менее 10 нм [5]. Из-за несоответствия структуры, состава и размеров углеродных точек нет согласия в отношении полного представления этих систем. Например, четкое происхождение их фотолюминесценции является предметом споров [6]. Пока же лучше представлять эти наночастицы как нано-сферы со средним диаметром 10-20 нм.



Рис. 1. Иллюстрация различных структур на основе углерода (графитовые листы, графен, нанотрубки, фуллерен и нано-алмаз), которые часто используются в медицине и биомедицинских приложениях.

Генотерапия означает использование терапевтических нуклеиновых кислот в качестве лекарств для лечения заболеваний [7]. До сих пор химиотерапия является основной стратегией борьбы с раком как одной из главных причин смерти во всем мире. Однако химиопрепараты поражают не только раковые клетки, но и здоровые ткани. Поэтому неудивительно, что мы ищем безопасные альтернативные способы лечения рака и других заболеваний, таких как одногенные болезни, сердечно-сосудистые и инфекционные заболевания [8]. Существуют две основные стратегии доставки нуклеиновых кислот. Терапевтические нуклеиновые кислоты могут вводиться в клетки-мишени, пролиферировать in vitro и повторно вводиться пациенту, что называется стратегией ex vivo. С другой стороны, нуклеиновые кислоты могут инкапсулироваться в нано-носители и доставляться непосредственно в клетки пациента (стратегия in vivo) [9]. Если гены конъюгированы на векторах доставки, их трансфекция клеток будет выше, поскольку плазмиды с голой дезоксирибонуклеиновой кислотой (ДНК) подвержены деградации, а их период полураспада короток. Поэтому вектор должен (1) защищать нуклеиновую кислоту от нуклеаз, (2) доставлять нуклеиновую кислоту в цитоплазму или ядро клетки-мишени, (3) быть безопасным и (4) экономически выгодным [7].

Скорость трансфекции при вирусной доставке нуклеиновых кислот (обычно это адено-ассоциированные вирусы и ретровирусы) приемлемо высока, но невирусные векторы могут устранить основные недостатки вирусной доставки генетических материалов, включая иммуногенность и канцерогенность [10]. Невирусные векторы также контролируют затраты на подготовку и неблагоприятные побочные эффекты, связанные с использованием вирусных векторов. Кроме того, доставка комплексов белок/нуклеиновая кислота, таких как Cas9 (с положительным зарядом) - синтетическая однонаправленная РНК (sgRNA; с отрицательным зарядом), более проблематична, чем ДНК или мРНК, из-за их смешанных зарядов [9].

Не-вирусные векторы можно разделить на две большие группы - органические и неорганические наноматериалы. Органические материалы включают липосомы, полиэтиленимин (PEI) и его производные, катионные полипептиды, дендримеры и их производные, хитозан и его производные, полиуретан, циклодекстрин и его производные [11]. Примерами неорганических материалов являются наночастицы золота (AuNPs), наноструктуры на основе углерода, наночастицы на основе апконверсии и наночастицы кремнезема [9,12]. В целом, наночастицы на основе углерода с их биосовместимостью, большим отношением поверхности к объему, легкостью функционализации и подходящими оптическими свойствами могут многое предложить для генотерапии [13]. Углеродные наноструктуры, функционализированные должным образом, могут доставлять различные фрагменты ДНК, такие как большие молекулы ДНК (плазмидная ДНК), молекулы рибонуклеиновой кислоты (РНК) (например, малые интерферирующие РНК (siRNA), короткие шпилечные РНК (shRNA), микро РНК (miRNA), анти-смысловые мРНК), малые молекулы ДНК (ген самоубийства iC9, анти-смысловые олигонуклеотиды) к конкретной мишени. В данной работе мы рассматриваем различные углеродные структуры по отдельности. Было предложено несколько стратегий гибридизации углеродных структур для улучшения их растворимости в водных растворах, повышения скорости трансфекции и защиты генетических материалов от деградации. Затем мы попытаемся составить всеобъемлющее представление о применении углерода в генной терапии.

В настоящее время 33 препарата/продукта для генотерапии одобрены для клинического использования FDA, и более 3500 клинических испытаний продолжаются по генотерапии во всем мире [14]. Проблемы доставки генов с помощью невирусных векторов включают циркуляцию крови, опсонизацию, эндоцитоз мононуклеарной фагоцитарной системой, тканевое давление, выход из эндосом [9], эффективность переноса генов, специфичность, продолжительность экспрессии генов и безопасность [15]. Таким образом, нано-носитель нуклеиновой кислоты на основе углерода может разрушаться или захватываться, прежде чем у него появится шанс попасть в клетку-мишень. Одной из стратегий преодоления этих барьеров является функционализация поверхности. Другие проблемы включают размер наноматериалов, связанный с клеточным поглощением, и механизм клеточного поглощения. Еще одна проблема возникает после того, как нано-векторы попадают в клетки, разрушаясь в богатой ферментами кислой среде внутриклеточных эндосом и лизосом [9]. Теперь мы остановимся на каждой наноструктуре на основе углерода, чтобы более подробно обсудить процесс их производства, функционализацию поверхности, размер и поглощение клетками.

Как уже упоминалось, существуют два основных подкласса CNTs - MWCNTs и SWCNTs. SWCNT имеют диаметр 1 нм при длине от 50 нм до нескольких µм, в то время как MWCNT имеют диаметр от 1 до 100 нм при длине 1-10 µм [16]. CNTs показали многообещающие свойства, включая высокую площадь поверхности, иглоподобную структуру, приемлемую прочность, огромную загрузочную способность для доставки лекарств и генетических материалов, уникальные оптические и электрические свойства, высокую долговечность, биосовместимость и возможность применения в системах адресной доставки смарт-стимулов [17,18]. На рис. 2 показаны наиболее перспективные свойства наноматериалов на основе CNT, которые обусловили их разностороннее применение в различных областях медицины, экологии, энергетики и др.



Fig. 2. Some of the most promising features and properties of carbon nanotubes (CNTs) and graphene as two most extensively used carbon-based nanomaterials (CbNMs) in different field of research.

Существует три основных способа синтеза CNTs дуговой разряд [19], лазерная абляция [20] и химическое осаждение из паровой фазы [21]. Метод дугового разряда использует дуговой разряд между двумя графитовыми электродами, расположенными друг напротив друга, и повышает температуру до 6000^o C. В этом методе углерод переходит из твердого состояния в газообразное без перехода в жидкость. Атомы перемещаются к более холодным зонам внутри камеры, образуя нанотрубки на катоде [4]. Метод лазерной абляции испаряет графитовый слой с помощью лазера и использует CO и Ni в качестве катализаторов. Когда лазер нацелен на графитовый слой, испаренные углероды образуют сажу на охлажденном медном коллекторе [22]. Наконец, при химическом парообразовании углеводород используется в качестве источника углерода и катализатора для выращивания CNTs на его поверхности [23]. Помимо этих трех основных категорий, существует еще несколько методов производства CNTs, таких как сонохимический или гидротермальный, электролиз, пламенный синтез, раствор силана и механотермический синтез [24,25]. Рис. 3A иллюстрирует комплексный обзор методов, используемых для производства CNTs.



Fig. 3. A detailed flowchart of various techniques for the fabrication of (A) Carbon nanotubes (CNTs), and (B) graphene materials.

По сравнению с нетронутыми фрагментами ДНК функционализированные CNTs (fCNTs) имеют более эффективную скорость интернализации [26]. Существует два способа функционализации углеродных наноструктур, включая ковалентный и не-ковалентный подходы. При ковалентной функционализации по крайней мере одна пара электронов находится между наночастицей и химическим веществом, которое должно быть добавлено на ее поверхность [27].

Функционализация CNTs улучшает их дисперсность и делает возможным конъюгирование всех форм нуклеиновых кислот на их поверхности. CNTs , функционализированные аминогруппами, имеют положительно заряженную поверхность. В связи с этим нуклеиновые кислоты будут прикрепляться к CNTs при ионном взаимодействии между отрицательно заряженными фосфатными группами в нуклеиновых кислотах и положительно заряженными аммонием, функционализированным CNTs [15]. Кроме того, длина и химическая природа функциональных групп определяют эффективность и механизм трансфекции [16]. Однако ковалентное связывание может деформировать боковые стенки и концы CNTs , что приводит к изменению их фотолюминесценции, комбинационного рассеяния и оптического применения [8]. Хотя нетронутые CNTs могут осуществлять взаимодействия с ароматическими нуклеотидными основаниями, такими как одноцепочечная ДНК (ssDNA) и малая интерферирующая РНК (siRNA) с её боковой стенки, доставка двухцепочечной ДНК (dsDNA) требует наличия различных иммобилизованных групп на поверхности CNTs . Два наиболее распространенных подхода к ковалентной функционализации CNTs - это этерификация и амидирование окисленных CNTs . Окисление образует карбоксильные группы на поверхности CNTs (на концах cap и в местах дефектов), которые впоследствии могут давать производные путем этерификации или амидирования. [28]. Циклоприсоединение 1,3-диполярных азометиновых ylides было показано Pantarotto и др. для конъюгирования пирролидиновых колец на боковой стенке CNTs [26]. Аминофункционализированные CNTs могут быть далее модифицированы для добавления аминогрупп, этилендиамина, PEI и полиамидоамина (PAMAM).

С другой стороны, не-ковалентная функционализация использует соникацию (воздействие ультразвуком) нанотрубок с амфифильными молекулами в растворителе. Преимущество этого метода перед ковалентной модификацией заключается в том, что он не влияет на молекулярную структуру CNTs . Таким образом, их оптические и электрические свойства остаются нетронутыми. Сурфактанты взаимодействуют с полярными молекулами растворителя в своей гидрофильной части и добавляются на поверхность CNTs [28]. Однако сродство к связыванию ДНК является проблемой при этом методе функционализации, поскольку оно не такое сильное, как связь в ковалентных группах [8].

Основные соображения относительно механизмов клеточного поглощения CNTs включают в себя длину и химическую природу молекул. Диффузия CNTs через фосфолипидный бислой мембраны клетки требует небольшого размера и гидрофобного сродства. Поэтому укороченные CNTs и CNTs с фосфолипидным покрытием более склонны к диффузии через клеточную мембрану [16,29]. Например, исследователи изучали факторы, влияющие на сохранность CNTs in vivo, используя принципы явления, называемого фагоцитозом (рис. 4А). Они обнаружили, что когда CNTs с несоответствующими физическими свойствами (такими как отношение длины к диаметру, известное как отношение сторон и площадь), попадают в клетки человека-хозяина, иммунная система распознает эти CNTs как чужеродные элементы, и поэтому иммунная система пытается фагоцитировать их с помощью макрофагов (на рис. 4А показан процесс эффективного фагоцитоза макрофагами). Результаты этого исследования показали, что МВCNTs с низким аспектным отношением могут быть поглощены макрофагами до их очищения лимфатической системой, в то время как МВCNTs с высоким аспектным отношением не могут быть очищены и поэтому накапливаются в тканях и, следовательно, способствуют канцерогенезу (рис. 4B) [30]. Это особенно важно, поскольку CNTs могут накапливаться в различных тканях/органах организма, продуцировать реактивные формы кислорода (ROS), вызывать окислительный стресс, увеличивать повреждения ДНК, вызывать воспаление и в конечном итоге повреждать здоровые клетки путем апоптоза - запрограммированной гибели клеток. Другие факторы, такие как повышенная растворимость CNTs, могут влиять на безопасность CNTs in vivo, предотвращая агрегацию и облегчая их выведение из организма и, таким образом, уменьшая накопление в тканях/органах (рис. 4C). Поэтому можно предположить, что, изменяя физические свойства CNTs (например, нарезая длину SWCNTs или MWCNTs), исследователи могут эффективно предотвратить их накопление в тканях/органах.



Fig. 4. (A) The process of an effective phagocytosis by macrophages upon the exposure of the human host cells to CNTs, (B) The effect of CNTs structure on the efficiency of phagocytosis by macrophages and clearance from the tissue/organ. Low aspect ratio or shorter length CNTs can be engulfed by macrophages and therefore can be cleared through the process of endocytosis/exocyt low aspect ratio MWCNTs can be engulfed by macrophages before their clearance by lymphatic systemosis [30]. (C) Solubility and aggregation of CNTs can also significantly affect the safety profile of CNTs in vivo [30].

Механизм клеточного поглощения CNTs обычно подразделяется на два класса: прямое проникновение в клеточные мембраны (независимый энергетический путь) или поглощение через эндоцитоз (зависимый энергетический путь). Также может быть рассмотрена комбинация этих путей [17]. Обычно исследователи используют зеленый флуоресцентный белок (GFP), люциферазу и b-галактозидазу в качестве генов-репортеров для доказательства концепции скорости трансфекции.

В данном разделе рассмотрено несколько примеров, чтобы оценить, как эти методы были опробованы в лабораториях. Среди невирусных векторов были широко исследованы катионные полимеры, такие как PEI. В одном из докладов изучалась не-ковалентная функционализация SWCNTs с помощью PEI [31]. PEI является гидрофильной молекулой, которая может способствовать дисперсности CNTs . Для добавления PEI к боковой стенке CNTs применялись два основных подхода: конъюгирование PEI с фосфолипидом (1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфорилэтаноламином) с помощью polyethyleneglycol (PEG) и прямое конъюгирование PEI с углеводородными цепями. Другими словами, две гидрофобные молекулы с 10-углеродными и 18-углеродными длинными молекулами ковалентно присоединяются к PEI или фосфолипиду, присоединенному к PEI с помощью PEG-линкера. Затем эти гидрофобные производные PEI были связаны с SWCNTs посредством гидрофобных взаимодействий между боковой стенкой CNTs и гидрофобными доменами на PEIs. Эти PEI-функционализированные CNTs использовались в качестве вектора для доставки pDNA. Результаты показали, что экспрессия генов на функционализированных PEI CNTs in vitro в три раза выше, чем на свободной pDNA. Это исследование также подтвердило, что не-ковалентное присоединение производных PEI к CNTs отвечает за более высокую эффективность трансфекции в культурах мышиных клеток (клетки мышиной нейробластомы Neuro2A). Однако оценка in vivo показала, что группа CNT-PEG-PEI имела более высокий потенциал системного введения, несмотря на более низкую скорость трансфекции in vitro, по сравнению с CNT-10-PEI или CNT-18-PEI. Для объяснения разницы между результатами in vitro и in vivo требуются дальнейшие анализы [31].

CNTs также полезны для доставки генов и редактирования генома в растениях. Проникновение в растительные клетки сложнее, чем в клетки млекопитающих, поскольку клеточная стенка состоит из сшитых полисахаридов [32]. Например, Kwak и др. доказали, что система доставки на основе SWCNTs, функционализированных другим катионным полимером (хитозаном (CS)), использует механизм проникновения в оболочку липидного обмена (LEEP) для селективной доставки pDNA в хлоропласт зрелой Eruca sativa, Nasturtium officinale, Nicotiana tabacum и Spinacia oleracea. В механизме LEEP размер и заряд поверхности наночастиц играют ведущую роль в проникновении в оболочку хлоропласта. Этот подход может также предпослать биомолекулярные грузы в векторах TALEN и CRISPER-ассоциированного белка 9 (Cas9) для точного редактирования генома хлоропласта. Сравнение ковалентного и нековалентного связывания CS с CNTs показало, что ковалентное связывание CS-SWCNT имеет более высокий дзета-потенциал и безопаснее доставляет pDNA в хлоропласты [33]. Кроме того, Demirer и др. продемонстрировали, что CNTs с высоким аспектным отношением являются подходящими кандидатами для доставки pDNA в клетки рукколы, пшеницы и хлопка, а также был разработан протокол, который может быть полезен для использования функционализированных PEI SWCNT для переноса пДНК в растения, защищая полинуклеотиды от деградации нуклеазой [34].

В другом исследовании функционализированные аргинином SWCNT использовались в качестве транспортных средств для доставки разработанного пептида слияния в клетки корня табака. Функционализированные аргинином CNTs обладают более высокой растворимостью и могут повысить адсорбцию ДНК за счет электростатических взаимодействий. Когда группа использовала только химерные пептиды, не наблюдалось никаких изменений в экспрессии GFP с помощью RT-PCR и вестерн-блоттинга в трансфицированных и нетрансфицированных корнях. Это позволяет предположить, что диаметр SWCNTs, который меньше, чем поры клеточной стенки растений (3-5 нм), вероятно, отвечает за их более высокую эффективность трансфекции по сравнению со сферическими пептидно-плазмидными комплексами, диаметр которых больше, чем нормальные поры клеточной стенки [35].

В исследовании изучались физико-химические свойства CNTs , чтобы показать, как они влияют на скорость трансфекции для доставки генов. В данном исследовании анализировались жесткие (толстые) и гибкие (тонкие) CNTs и их укороченные образцы. Эти нанотрубки были функционализированы полиаллиламином (ppAA) с помощью усиленного химического осаждения из паровой фазы, а укороченная версия CNTs была получена после окисления с помощью KMNO₄. В среднем длина укороченных образцов сократилась до 60% от исходного размера. В целом, наноматериалы очищаются из кровообращения в организме системой мононуклеарных фагоцитов, но регулирование размера, формы и особенностей поверхности CNTs повысит их устойчивость в системе кровообращения. В данном исследовании был сделан вывод, что укороченные нанотрубки имеют более гидрофильную поверхность, чем длинные. Кроме того, жесткие (более толстые) нанотрубки продемонстрировали более высокую дисперсию и жизнеспособность клеток in vivo [36].

Учитывая острый инфаркт миокарда (AMI), являющийся основной причиной смерти во всем мире, апоптоз, по-видимому, играет решающую роль в окончательном размере инфаркта и функционировании сердца. Каспазы - это белки, связанные с апоптотическими путями, особенно Caspase3, основная протеаза каскада в расщеплении нескольких важных белков [37]. Одним из эффективных способов осуществления РНК-интерференции (RNAi) при AMI является доставка siRNA (siRNA - это 20-25-нуклеотидная двухцепочечная молекула, которая обеспечивает молчание специфических генов путем трансляционного ослабления или расщепления мРНК рецептор-мишень) непосредственно в целевую область. В этой связи Li и др. подтвердили, что функционализированные SWCNT (средний диаметр 1-3 нм и средняя длина 200 нм) с фосфолипид-полиэтиленгликолем успешно доставляют siRNA в область AMI. siRNA действовала как активатор зампалчивания гена Caspase3, подавляя апоптоз кардиомиоцитов и ремоделирование желудочков, и даже положительно влияла на функцию сердца лабораторных крыс Sprague-Dawley после перевязки коронарной артерии [38].

В другом исследовании была предпринята попытка разработать более сложную систему с комбинацией лекарств и генных материалов, направленную на гибель раковых клеток с помощью системы на основе SWCNT, включающей doxorubicin (DOX). SWCNT, функционализированные PEI через PEG линкер, использовались в качестве транспортного средства для доставки shRNA (еще один пример доставки RNAi). Затем SWCNT-PEG-PEI были присоединены к аптамеру AS1411. Этот аптамер действует как лиганд нуклеолина, который нацелен на раковые клетки с нуклеолином на их поверхности. На заключительном этапе подготовки к комплексу добавляли DOX (рис. 5) [39].



Fig. 5. A combinatory SWCNTs-based delivery system for co-delivery of shRNA and DOX to the targeted cancer cells. SWCNTs were functionalized with PEI through PEG linkers, then aptamer AS1411 was added to the complex as the biomarker to target tumor cells overexpressing nucleolin on their surface selectively. Finally, DOX was added to the complex to attack the cancer cells [39], reproduced with permission from Elsevier.

Интеллектуальные системы доставки, реагирующие на стимулы, используют внеклеточные сигналы для стимуляции сигнала, чтобы преодолеть барьеры. Внутренний стимул может изменять физиологические условия, такие как pH, активность ферментов, окислительно-восстановительный потенциал или температура. Внешние стимулы включают изменения, вызванные магнитным полем, ультразвуком или электрическим стимулом извне [40].

Эндосомы и лизосомы имеют более низкие значения pH, чем остальная цитоплазма. Таким образом, pH-чувствительные наноплексы имеют шанс перенести терапевтические нуклеиновые кислоты в целевые ткани, используя преимущества этой естественно разнообразной pH-среды. Обычно рН-стимулирующие наноструктуры синтезируются путем смешивания ионизируемых рН-чувствительных функциональных групп (например, аминов, карбоновых кислот) или кислотно-нестабильных химических связей (например, гидразонов, сложноэфирных связей) для запуска при определенном значении рН [9].

Например, Yue и др. разработали pH-реактивную систему доставки углеродных нанотрубок, в которой SWCNT были функционализированы полиэтиленимин бетаином для одновременной доставки сурвивин siRNA и DOX к месту действия. PEI ковалентно конъюгируется с бетаином; затем смесь синтезируется с окисленными SWCNTs, чтобы действовать как pH-реактивный комплекс, способный к лизосомному выходу. Комплекс был протестирован против опухолевых клеток A549 с успешными результатами при использовании синергетического эффекта DOX (как химиопрепарата) и siRNA (как фактора сайленсинга) для уменьшения их размера [41].

Температура может использоваться как наружно, так и внутренне, в зависимости от того, применяется ли источник нагрева извне или температура патологической области повышается естественным образом. Например, опухолевые ткани теплее, чем нормальные ткани. Поэтому, если на опухолевый участок подается энергия для повышения его температуры, местное кровоснабжение и проницаемость опухолевых тканей соответственно повышаются [42]. В исследовании, проведенном Yinnan et al., был использован синергетический эффект фототермальной терапии (PTT) и генной терапии на основе системы доставки углеродных нанотрубок, запускаемой температурой. SWCNTs и MWCNTs покрывались пептидным липидом и sucrose laurate, затем в комплекс добавлялась siRNA для достижения мультиплекса CNT/siRNA, который мог одновременно заглушать выжившую экспрессию и использовать PTT под воздействием ближнего инфракрасного (NIR) света (рис. 6) [43].



Fig. 6. schematic diagram of temperature-sensitive CNT-PS/siRNA nanomaterials utilizing dual effect of PTT and gene therapy against murine cancer cells [43].

Кроме того, MWCNT имеют меньшую площадь поверхности, чем SWCNT, что ограничивает их применение для доставки генов [8]. Первые попытки показали, что полиамидоамин-функционализированные MWCNT имеют потенциал для доставки генов, так как они имеют более высокую скорость трансфекции, чем PAA и PEI при нацеливании на клетки. [44]. Кроме того, оценка in vitro пиридиновых MWCNT для доставки гена самоубийства индуцибельной каспазы 9 (iC9) в MCF-7 (клеточная линия рака молочной железы) показала, что эти наночастицы эффективно атакуют раковые клетки. Кроме того, в данном исследовании оценивался синергетический эффект iC9 с двумя химиопрепаратами (актиномицином D и DOX). В то время как эти препараты могут предотвратить рост опухолевых клеток, iC9 может вызывать активный апоптоз в этих клетках [45]. В таблице 1 приведены результаты нескольких недавних попыток использования CNTs для доставки генов.



Table 1. Recent research on gene delivery with CNTs.

Графен - это двумерный материал, состоящий из одноатомного слоя гибридизированных sp2 атомов углерода, сформированных в виде сото-подобной решетки [50]. Наноструктуры семейства графена (GFN) включают в себя в несколько слоев графен (FLG), графеновые квантовые точки (GQDs), оксид графена (GO), восстановленный оксид графена (rGO), графеновые нанолисты (GNS), графеновые пены [51] и ультратонкий графит. Разница между этими структурами обусловлена количеством стенок, диаметром, длиной и характеристиками поверхности [52]. Точнее говоря, графен - это лист, состоящий из одновершинного слоя sp2-связанных атомов углерода. Состоящий из немногих слоев графен (или многослойный графен) также является двумерным материалом, который может быть либо в виде свободно лежащей чешуйки, либо в виде связанного с подложкой покрытия с ограниченным количеством (от 2 до 5) четко определенных уложенных графеновых слоев, вытянутых в боковом измерении. GNS представляет собой монослойный одноатомный лист, состоящий из sp2-связанных атомов углерода, но он не является составной частью какого-либо углеродного материала. Он может находиться в свободном подвешенном состоянии или быть приклеенным к внешней подложке с поперечным размером менее 100 нм. GQD - это другой термин для обозначения графеновых нанолистов с малым поперечным размером менее 10 нм, что особенно важно для исследований фотолюминесценции. GO - это химически модифицированная графеновая структура, состоящая из монослоя материала с высоким содержанием кислорода. В целом, соотношение C/O составляет менее 3,0 и, скорее всего, близко к 2,0. Если количество кислорода в GO может быть уменьшено с помощью восстановительного процесса, такого как химические, микроволновые, фотохимические, микробные/бактериальные методы, то конечный продукт называется rGO [53]. Высокая площадь поверхности в GFN, их высокая механическая прочность и оптические свойства, такие как фотолюминесценция, сделали эти наноструктуры еще одним благоприятным кандидатом для систем доставки лекарств/генов [54]. Наиболее перспективные свойства GFNs, которые привели к их разностороннему применению в различных областях медицины, экологии, энергетики и т.д., показаны на рис. 2.

GFN, когда они функционализованы, могут быть растворимы в водном растворе, как, например, PEGylated GO [55]. GO может быть украшен органическими молекулами (PEG, PLGA, полидопамин (PDA), поливинилпирролидон, PEI, PAMAM, полисахариды (хитозан, циклодекстрины, альгинат)) или неорганическими добавлениями (наночастицы металлов и оксидов металлов, наночастицы мезопористого кремния [56] и гидроксиапатита) [52,57].

Графеновые листы получают в основном методом химического осаждения из паровой фазы (CVD), эксфолиации, скотч-ленты (клейкой ленты) или с помощью лазера [58]. CVD является дорогостоящим методом, но позволяет лучше контролировать слои, даже на уровне монокристаллов. Химическое отшелушивание может быть завершено окислением GO [59]. Комплексная диаграмма на рис. 3B показывает различные методы производства графена [[60], [61]-62]].

С одной стороны, вирусные векторы имеют такие проблемы, как иммуногенность, вызывание воспаления и онкогенные пути. С другой стороны, невирусные векторы также не обладают адекватной скоростью трансфекции по сравнению с вирусными векторами [50].

GO, функционализированный PEI с помощью PEG-линкеров, оказался хорошим кандидатом для редактирования генома, например, для доставки CRISPR/Cas9 и однонаправленной РНК (sgRNA) в клетки AGS человека с эффективностью 39%. Предполагается, что наноструктура попадает в клетку путем эндоцитоза и эндосомальной инкапсуляции и, наконец, высвобождает свое содержимое, активируемое эффектом протонной губки, связанной с PEI. Кроме того, Cas9/sgRNA переносится в ядро благодаря сигнальным пептидам ядерной локализации, слитым с Cas9 (рис. 7A) [63].



Fig. 7. (A) A schematic demonstrates Cas9/sgRNA delivery system based on GO-PEG-PEI. Cas9/sgRNA is attached to the surface of the nanoparticle complex by physisorption and π- stacking interaction. The nanostructure enters the cell via endocytosis after binding to the cell membrane, followed by endosomal escape, transports into the nucleus, then edits the chromosome on the targeted DNA locus with a double-strand break mechanism [63]. (B) 3D illustration of a CRISPR-graphene chip that can be used for rapid detection of target genes with single-nucleotide specificity.

Кроме того, комплексная система CRISPR/Cas, которая произвела революцию в области редактирования генов и, следовательно, в здравоохранении, может извлечь пользу из платформ на основе графена и другими способами. Balderston и другие [64] сообщили о системе графенового чипа на основе CRISPR/Cas, которая способна обнаруживать сверхмалые однонуклеотидные различия в неамплифицированных образцах ДНК вне лабораторных условий. Простая схема этой интеллектуальной системы показана на рис. 7B.

Как и CNTs, нетронутый GO также может поглощать ssDNA и РНК на своей поверхности посредством π-π взаимодействия, но эта система не подходит для доставки dsDNA без дополнительной функционализации. В одном из исследований эта проблема была решена путем присоединения катионных липидов к его поверхности. Результаты показали, что конечный наноструктурный комплекс имеет размер менее 150 нм и поверхностный заряд ξ = + 15 мВ. GO получают после окисления графитового листа функциональными группами, содержащими кислород, в основном гидроксильными и эпоксидными, на базальной плоскости листа методом, называемым методом Хаммера. Новизна этого метода заключается в приготовлении этого генетического вектора с использованием микрофлюидной платформы, что позволяет уменьшить количество исходных материалов и гибко масштабировать их для дальнейших исследований [65].

GO также способен доставлять siRNA. Например, Yin и др. использовали монослойный GO для совместной доставки HDAC1 и K-Ras siRNAs для избирательного воздействия на раковую клеточную линию MIA PaCa-2. Два гена HDAC1 и K-Ras были успешно подапвлены, предотвращая рост опухоли до 80%. GO функционализован фолиевой кислотой, NH2-mPEG-NH2(5k) и Polly-allylamine hydrochloride (PAH). Клетки рака поджелудочной железы могут поглощать фолиевую кислоту, поэтому в системе адресной доставки использовалась фолиевая кислота, а скорость интернализации составила более 80% [66]. В другой попытке также использовали фолат-функционализированный GO в качестве специфической мишени для атаки клеток рака яичников SKOV3. Наноструктура PEG-GO-PEI-FA имела средний размер 216 нм. Комплекс PEG-GO-PEI-FA/siRNA также показал ингибирующий эффект на клетки рака яичников в зависимости от времени [67]. Более того, в другом исследовании GO функционализировали карбоксилатными группами, затем добавили хитозан для доставки pDNA-TNF-α Далее систему пассивировали 4,7,10,триокса-1,13-тридеканедиамином (diamine PEG) против системы фагоцитов. Наконец, нано-комплекс был покрыт углеродными точками, полученными из FA, для избирательного воздействия на фолатные рецепторы в раковых клетках. Этот тераностический агент может одновременно использовать преимущества селективной доставки в раковые клетки и возможности биовизуализации углеродных точек [68]. Однако углеродные точки - не единственные наноструктуры из семейства углеродных, демонстрирующие подходящие флуоресцентные свойства. Графеновые квантовые точки проявляют флуоресцентные свойства, которые могут быть полезны при разработке тераностических агентов.

Графеновые квантовые точки (GQD) превосходят полупроводниковые квантовые точки по меньшей токсичности и экологичности. Они также имеют большую площадь поверхности и настраиваемые оптические и электронные свойства. В одном из исследований GQD, функционализированные PEG и PLA, использовались для доставки зонда миРНК для визуализации клеток, внутриклеточной регуляции миРНК и доставки нескольких генных зондов на раковые клетки HeLa.

Функционализированные GQD были подтверждены как подходящий нанотранспорт для доставки генов в этом исследовании. Также было доказано, что загрузка генно-таргетинговых агентов в нанокомпозит оказывает положительный терапевтический эффект [69].

В другой работе использовались не-ковалентные взаимодействия для конъюгации химерного пептида MPG-2H1 и pDNA на системе GQD. Химерный пептид представлял собой комбинацию трех различных мотивов, которые эффективно преодолевают несколько барьеров на пути к ядру. GQD были изготовлены по методу Хаммера с двумя различными размерами, связанными с зеленым и красным цветами эмиссии. Окончательная наноструктура была протестирована против Т-клеток HEK 293. Интернализация плазмидной ДНК в клетки усиливается при использовании GQDs в качестве нано-векторов, и путь может быть отслежен с помощью флуоресцентных свойств этих наночастиц [70]. Другая система была разработана на основе GQDs, функционализированных PEI, для доставки GFP в качестве модели доставки генов в клетки рака толстой кишки. Кроме того, нано-комплекс декорирован рецептором фактора роста (EGFR) для улучшения клеточного поглощения. DOX, как противораковый препарат, также был добавлен в нанокомплекс для усиления ингибирующего эффекта на раковые клетки [71].

В связи с расширением использования GFNs в различных медицинских и биомедицинских приложениях, таких как доставка лекарств/генов, биосенсинг и биовизуализация, многие исследователи во всем мире пытались понять механизмы и пути клеточного обновления GFNs. Несмотря на огромные усилия, до сих пор мало что известно, и для понимания точного механизма интернализации GFNs в клетки хозяина необходимы дальнейшие углубленные исследования. Например, Huang и др. [72] нагрузили GO AuNPs и использовали поверхностно-усиленное комбинационное рассеяние (SERS) для исследования его клеточной интернализации клетками карциномы шейки матки человека (клетки Ca Ski). Результаты показали, что GO неоднородно распределен внутри клетки, а процесс интернализации в основном происходит через клатрин-опосредованный эндоцитоз, который является энергозависимым путем [72]. В другом исследовании GQDs были синтезированы с помощью микроволнового метода, и было показано, что эти GQDs могут попасть в клеточные ядра (в нескольких различных клеточных линиях) в течение 6-8 часов посредством кавеоло- и клатрин-опосредованного эндоцитоза [73]. Эти два различных клеточных процесса эндоцитоза показаны на рис. 8.



Fig. 8. Two different models of cellular endocytosis of GFNs.

Углеродные точки - это семейство углеродных структур, известных своей превосходной фотостабильностью и фотолюминесцентными свойствами. Эмиссионные спектры компакт-дисков могут быть настроены путем управления их размером, формой, концентрацией и врожденной структурой [74]. Происхождение их фотолюминесценции является спорным, поэтому управление длиной волны эмиссии является сложной задачей, поскольку молекулярное происхождение фотолюминесценции неясно.

Методы изготовления, аналогичные другим структурам семейства углерода, можно разделить на две группы: нисходящие и восходящие методы. Лазерная абляция [75], дуговой разряд и электрохимическая подготовка [76] относятся к нисходящим методам, а термическая карбонизация [77], микроволновый пиролиз [78] и гидротермальная обработка - к восходящим [79]. Поскольку первые попытки получения компакт-дисков с помощью лазерной абляции сопровождались низкой фотолюминесценцией, потребовался агент для пассивации поверхности. При использовании метода пассивации поверхности квантовый выход может достигать 93% [80]. Наиболее используемыми пассивирующими агентами являются PEG [75], PEI [81], PLL [82]. Средний диаметр компакт-дисков составляет около 10 нм [74], и было показано, что они могут доставлять ряд нуклеиновых кислот, обеспечивая при этом фотолюминесцентные свойства. На рис. 9 (средняя панель) представлен всесторонний обзор доступных стратегий для производства компакт-дисков, которые классифицируются по двум основным категориям: нисходящие и восходящие подходы.



Fig. 9. A comprehensive illustratiuon of different methods of synthesis for the preparation of carbon dots (CDs), fullerene, and nano-diamonds.

Например, CDs N-допированные, функционализированные PEI, показали приемлемую скорость трансфекции с биомаркерами GFP. Затем эти наноструктуры использовались для доставки siRNA в раковые клетки BT-474. При добавлении в комплекс противоракового препарата Трастузумаб размер PEI-CD-HER3 siRNA достиг 50-100 нм. Ингибирующий рост эффект для нано-комплекса с комбинацией лекарства и siRNA был значительно выше, чем у одного только лекарства [83].

CDs также эффективны для доставки siRNA в растительные клетки благодаря своему небольшому размеру. Schwartz и др. продемонстрировали успешный перенос siRNA с помощью функционализированных PEI компакт-дисков и успешно подавляли эндогенные гены в Nicotiana benthamiana и Solanum lycoperiscum [84]. Другая группа попробовала функционализированные PEI компакт-диски для доставки генной плазмиды SOX9. Эти небольшие наночастицы были синтезированы с помощью одностадийного микроволнового пиролиза аргинина и глюкозы. Конечный нанокомплекс со средним диаметром 10-30 нм индуцировал хондрогенную дифференциацию в эмбриональных фибробластах мыши (MEFs) [85].

Было предложено изготовление компакт-дисков методом одностадийной гидротермальной карбонизации для получения PEI-функционализированных компакт-дисков с квантовым выходом 42%. Фолиевая кислота используется как источник углерода, а PEI - как пассивирующий агент; эти наночастицы тестируются против раковых клеток для доставки pDNA. Потребовалось до 6 ч с использованием муфельной печи для медленного получения компакт-дисков из источника карбонизации при 180 ^o C [86]. В другой попытке получения CDs методом гидротермальной карбонизации использовали альгинат натрия в качестве источника углерода и перекись водорода в качестве пассивирующего агента в автоклаве при 220 ^o С в течение 12 ч. Сообщается, что квантовый выход наночастиц составил 12%, а размер наночастиц находился в диапазоне 5-10 нм [87].

С другой стороны, пиролиз углеродных точек при помощи микроволн длится всего несколько минут. Например, Hasanzadeh и др. синтезировали PLL-функционализированные CDs в ходе одностадийного микроволнового пиролиза в течение 10 минут. Эти наноматериалы показали приемлемую скорость трансфекции 70%, а квантовый выход составил около 12% [82]. Однако, когда поверхность наночастиц функционализировали более низкомолекулярным PEI (2 KDa), был получен более высокий квантовый выход (40%) [88]. Поли-L-лизин (PLL) и PEI могут электростатически взаимодействовать с фрагментами ДНК, но поскольку функционализированные PEI компакт-диски показали более высокий квантовый выход, эти наноматериалы были выбраны для доставки pCRISPER в клетки HEK-293. Подобно этим попыткам ранее было предложено использовать гиалуроновую кислоту (HA) в качестве источника углерода и полиэтиленимин (PEI) в качестве пассивирующего агента для получения компакт-дисков [89]. CDs также могут быть многофункциональными с фолатом (общий рецептор на многих раковых клетках) и восстановленным PEI для доставки siRNAs (EGFR и циклин B1). После использования одностадийного метода микроволнового пиролиза для получения PEI-CDs из глицерина (источник углерода), была активирована реакция "Michael addition" для конъюгации избыточных молекул PEI на нано-комплексе. Затем добавлялись фолиевые кислоты и, наконец, siRNA электростатически взаимодействовали с нано-комплексом для получения fc-rPEI-CD-siRNA. Эти нано-композиты эффективно снижали популяцию клеток на 75-80% в клетках рака легких H460 [90].

До настоящего времени несколько гетероатомов, таких как азот, сера, фосфор, магний и гадолиний, были допированы на компакт-диски для улучшения их флуоресцентных свойств, биосовместимости, поглощения клетками и стабильности [74]. Что касается этого, F-активированные (doped) компакт-диски (CDs) получают с помощью реакции кольцевого разворачивания в качестве генного вектора. В этом методе PEI 600 Da растворяли в безводном растворителе этаноле, затем переносили в автоклав PTFE при 180 ^o С в течение 12 ч. После охлаждения реактора до комнатной температуры раствор фильтровали через пленочный фильтр 450 нм и получали конечный продукт путем лиофилизации. Однако квантовый выход F-активированных наночастиц составил 5,6%, что ниже, чем в других попытках, упомянутых в литературе. Однако эти нано-частицы показали в 30-260 раз большую эффективность трансфекции, чем не-фторированные (non-fluorinated) CDs [91].

В другом исследовании был использован комбинированный подход для получения CDs из соли Gd(III), катионных полимеров и лимонной кислоты для получения мультимодального (MR/FL) агента визуализации с одновременной доставкой генетического материала. В этом случае скорость трансфекции была в 74 раза выше, чем у чистого 25 кДа PEI в качестве стандартного образца в присутствии 10% сыворотки. В качестве источника гадолиния использовалась соль Gd(III) или комплекс Gd-циклена, а катионные полимеры были получены методом кольцевой полимеризации эпоксида [92].

Фуллерен - это член структур семейства углеродов, состоящий из sp2-углеродов в форме полого шара, эллипсоида, трубки и многих других форм. По своей структуре фуллерены похожи на графит, который состоит из связанных шестиугольных колец на листе, но они содержат одинарные связи C5-C5 (12 пятиугольников) C5=C6 двойные связи (20 шестиугольников). Самая миниатюрная форма фуллерена, в которой ни один из двух пятиугольников не имеет общего края, - это C60, поэтому нет ничего неожиданного в том, что она является самой распространенной формой. Buckey-шары и buckey-трубки - другие названия фуллереновых структур в зависимости от их формы [93]. С60 обладает двойственным поведением, благодаря которому он способен действовать по-разному в определенных ситуациях. Например, в некоторых случаях C60 при облучении видимым светом производит виды кислорода, что подходит в качестве кандидата для фототермической терапии. В некоторых других случаях C60 может даже понижать уровень реактивных видов кислорода, что является полезным свойством для того, чтобы стать нейропротекторным агентом. Однако причина такого двойственного поведения пока не ясна. C60 обладает низкой растворимостью во многих органических растворителях и нерастворимостью в воде. Поэтому для его использования в биологических системах необходима модификация [93].

В начале фуллерен синтезировали лазерным испарением углерода в инертной атмосфере, но позже фуллерен С60 получали дуговым нагреванием графита как источника карбонизации и лазерным облучением полиароматических углеводородов (рис. 9) [94]. 7.2. Производные фуллерена в доставке генов Использование системы на основе липидов для доставки ДНК в клетки называется липофекцией. Lipofectin - это комбинация двух липидных биомолекул, которая была использована для доставки генов с помощью ионного взаимодействия между ее катионной частью и фосфатной группой в ДНК с отрицательным зарядом. Позже было подтверждено, что вектор доставки генов на основе фуллерена C60, функционализированного на его хвостовых частях, более эффективен по скорости трансфекции, чем Lipofectin, даже в присутствии сыворотки. Было продемонстрировано, что тетра(пиперазино)фуллерен эпоксид (TPFE) имеет в 4 раза более высокую скорость трансфекции, чем Lipofectin [95]. Тетрааминофуллерен может быть получен в два этапа из производных фуллерена и пиперазина. Кроме того, TPFE не проявил токсичности, а плазмида, экспрессирующая ген инсулина 2 (Ins2) мыши, перенесенная с помощью TPFE, смогла успешно снизить уровень глюкозы у самок мышей C57/BL6 [96].

Еще одна попытка была предпринята с использованием TPFE для доставки siRNA in vivo для лечения модели сепсиса (заболевания легких). TPFE и siRNA образовали комплекс, который агглютинируется белками плазмы из кровотока с образованием микронных частиц. Агглютинат быстро закупоривает легочные капилляры, высвобождает siRNA в клетки легких для подавления экспрессии целевых генов, а затем быстро выводится из легких после доставки siRNA [97]. Кроме того, было продемонстрировано, что обратимая сборка белка TPFE-siRNA-сыворотки является решающим аспектом для стабильности комплекса, поскольку siRNA нестабильны в физиологических условиях [98].

Другой фуллерен C60 на основе амина (C60-Dex-NH2), разработанный для доставки siRNA, показал приемлемое амфифильное сродство и мог образовывать мицеллоподобные агрегаты в воде, что могло ингибировать деградацию siRNA под действием реактивных видов кислорода. При облучении видимым светом комплекс C60-Dex-NH2 мог активировать контролируемую генерацию реактивных форм кислорода, эффективную для разрушения мембраны лизосом, развития лизосомного побега и повышения эффективности сайленсинга генов siRNA in vitro и in vivo. Результаты показали эффективность подавления генов до 53% в клетках MDA-MB-231-EGFP и 69% в опухолях мышей 4T1-GFP-Luc2 [99].

В решетке алмаза два атома углерода формируют основу структуры, а еще восемь атомов углерода образуют так называемую решетку "Bravais" . Другими словами, существует алмазное ядро и оболочка из аморфного углерода. Размеры нано-алмазов (NDs) находятся в диапазоне 3-6 нанометров [100]. Они могут быть полезны при экстракции и очистке белковых молекул из рекомбинантных источников и природных объектов. Нано-алмазы также обладают приемлемой загрузочной способностью для целей доставки и биосовместимы [101].

NDs получают с помощью лазерной абляции, микроволнового химического осаждения из паровой фазы с усилением плазмы, химического осаждения из паровой фазы горячей нити, низкотемпературного химического осаждения из паровой фазы с усилением нейтрального пучка, высокоэнергетического (высокое давление и высокая температура) шарового измельчения, облучения графита ионами высокой энергии при комнатной температуре и электрического облучения ионами углерода [100,102]. На рис. 9 представлен полный обзор наиболее часто используемых методов синтеза NDs. Размер NDs в генной доставке варьируется от 50 до 100 нм [103]. Функционализированные Polyglycerol (PG) NDs. обладают лучшей дисперсностью, чем PEG-функционализированные наночастицы в водной среде [104]. PG может обеспечить множество гидроксильных функциональных групп на NDs для улучшения их гидрофильности и подготовки к дальнейшей дериватизации для доставки терапевтических pDNA и полипептидов. ND-PG-октааргенин и ND-PG-октализин имеют большой положительный дзета-потенциал и образуют стабильный комплекс с pDNA [103]. Ранее было показано, что PG-функционализированные NDs получают путем кольцевой полимеризации между глицидолом на поверхности NDs. В ходе процесса происходят превращения (-OH -> -OTs (тозилат) -> -N3) в слое PG с последующей конъюгацией нескольких основных полипептидов (OctaArgenin, OctaLysine), завершенных пропарилглицином [105].

В одном интересном исследовании сравнивался механизм интернализации для чистых NDs, NDs, функционализированных лизином, и диамантоплексов (diamoplexes) (содержащих лизин-функционализированные NDs с siRNAs). Результаты показали, что для pNDs из-за их большего размера агрегатов основным механизмом клеточного поглощения является микропиноцитоз, а клатрин или кавеолы - опосредованный эндоцитоз в этом случае не наблюдаются. Однако для lys-NDs-siRNA были задействованы все три механизма [106]. Ранее было показано, что diamoplexes могут переносить siRNA с более высокой скоростью трансфекции, чем карбоксилированные NDs или pNDs [106]. NDs со средним размером 30 нм, функционализированные белком TAT вируса иммунодефицита человека и сигнальным пептидом ядерной локализации, имели лучшее клеточное поглощение, чем чистые NDs, и эффективную доставку в различные клеточные линии. Это исследование показало, что доставка NDs ANA4625-TAT-NLS-NDs имеет больший терапевтический эффект, чем анти-смысловой олигонуклеотид ANA4625, поскольку он может вызывать апоптоз клеток и подавлять экспрессию пре-мРНК/белка bcl-2 и bcl-xl [107].

Другое исследование показало, что detonation nanodiamonds (DNDs) доставляют siRNA в клетки мышей с саркомой Ewing. Исследование подтвердило, что siRNA может быть успешно доставлена в клетки с помощью гидрогенизированных или тритированных DND (H-DND и T-DND,). Эти наночастицы также эффективно предотвращают экспрессию гена EWS-FLI1 в модели опухоли ES, ксенотрансплантированной на мышах [108]. Позднее эта группа продемонстрировала автоматизированный метод количественной оценки, основанный на использовании самодельного флуоресцентного микроскопа с временной задержкой, содержащего импульсный лазерный источник, синхронизированный с генератором синхронизации детектора усиленной решетки. Затем эта установка была применена для отслеживания двухфункциональных NDs для переноса siRNA, ингибирующей онкоген, ответственный за саркому Ewing у мышей [109].

Карбоксилированные NDs со средним размером 3 нм и конъюгированные с флуоресцентным белком mCherry были использованы для переноса CRISPER-Cas9 для редактирования генf RS1, который связан с Х-сцепленным ретиношизисом. Эти наночастицы могут переносить компоненты CRISPER-Cas9, содержащие sgRNA и эндонуклеазу Cas9, в iPSCs человека и сетчатку мыши [110].

Нано-частицы, функционализированные полиамидоамином (PAMAM) для переноса siRNA для ингибирования потенциальных онкогенов E6 и E7 при раке шейки матки. Эти наночастицы были замечены в межклеточном взаимодействии путем макропиноцитоза и прямого эндосомального выхода [111].

Негативные последствия использования наноструктур на основе углерода для доставки лекарств/генов обобщены в нескольких исследованиях, таких как проблемы, связанные с респираторными и кожными заболеваниями при использовании углеродных нанотрубок [112,113], аутофагия при использовании графеновых наноматериалов [114], тяжелая острая воспалительная реакция при использовании углеродных точек у мышей [115], снижение частоты сердечных сокращений и нарушение эмбрионального развития у рыбок данио дикого типа при использовании графеновых квантовых точек [116] и повышение уровня реактивных форм кислорода в тканях Daphnia Magna (водное беспозвоночное) при использовании NDs [117]. Однако особенности углеродной основы, включая физические свойства (размеры, площадь поверхности, дозировка, отношение длины к диаметру, время, чистота и химические функциональные группы на их поверхности), каждый из них может чередовать профиль токсичности нано-частиц на основе углерода. Поэтому все углеродные нано-частицы следует считать одинаковыми, а их различия должны тщательно изучаться при исследовании профиля токсичности.

Размер, форма и функционализация играют важную роль в определении профилей цитотоксичности наночастиц. Например, короткие MWCNT со средней длиной 100-600 нм продемонстрировали более низкий уровень токсичности против эндотелиальных клеток пупочной вены человека, чем более длинные MWCNT с длиной 200-2000 нм [118]. Несмотря на то, что другие отчеты показывают тот же результат более низкой цитотоксичности при меньшей длине и диаметре CNTs [119], несколько исследований подтверждают противоположный вывод [120]. Это спорный вопрос, поскольку большинство исследований в литературе не являются точными с точки зрения чистоты материала, метода введения наночастиц в животные модели и других факторов, которые влияют на профиль токсичности наночастиц на основе углерода [17]. Более того, функционализированный GO с NH2 оказался более вредным, чем нетронутый GO [121]. В целом, функционализация для семейства графенов может снизить уровень их цитотоксичности, и это снижение в основном зависит от функциональных групп при функционализации [122].

Для лучшего понимания токсикологических эффектов CbNMs в конкретном органе/ткани/клетке человека необходимо глубокое понимание клеточных и молекулярных взаимодействий с тканью/органом-мишенью. На эти взаимодействия в основном влияют физико-химические характеристики наноструктур, их взаимодействие с клетками и накопление в конкретной ткани/органе [123]. На рис. 10 показаны возможные механизмы клеточного поглощения при воздействии CbNMs на клетку хозяина, а затем иерархические события, которые приводят к цитоксичности этих материалов. CbNMs проникают в клетки по различным путям (рис. 10), таким как прикрепление к члену клетки, проникновение в клеточную мембрану (что также вызывает физическое повреждение клетки) и эндоцитоз. Это может вызвать повышение уровня продукции реактивных форм кислорода (ROS), что индуцирует окислительный стресс и, следовательно, приводит к повреждению митохондриальной ДНК и, таким образом, к высвобождению провоспалительных цитокинов, что приводит к воспалению. Вследствие повышенного окислительного стресса, воспаления и избыточного повреждения ДНК происходит запрограммированная гибель клеток (апоптоз) [124]. CbNMs (т.е. графены) также могут снижать уровень аденозинтрифосфата (АТФ), поскольку они могут действовать как акцепторы электронов, что ингибирует цепь переноса электронов [124].



Fig. 10. Illustration of cellular uptake and toxicity mechanisms upon exposure of host cell with carbon-based nanomaterials (CbNMs).

Углеродные наноструктуры могут решить проблемы канцерогенности и иммуногенности вирусных векторов фрагментов ДНК. Однако их низкая гидрофильность должна быть исправлена путем функционализации поверхности. Гибридизация и поверхностная функционализация наноструктур на основе углерода повышают их растворимость в водном растворе, увеличивают скорость трансфекции в целевых клетках и защищают их генетическое содержимое от деградации в процессе циркуляции. Углеродные наночастицы могут также использоваться синергетически для совместной доставки лекарственных и генетических материалов и отслеживать их путь в клетки по своим оптическим свойствам. Они демонстрируют целый ряд благоприятных свойств, начиная от большого отношения поверхности к объему, оптической, фотолюминесценции, биосовместимости и химической стабильности, при этом настройка свойств поверхности, формы и размера практически легко осуществима, а их производство не требует больших затрат в зависимости от выбора используемой техники. Дальнейшие усилия должны быть направлены на токсикологическую и фармакокинетику генетической доставки с помощью структур на основе углерода и повышение скорости трансфекции для клинических исследований. Для успешного и эффективного клинического применения этих CbNM недостаточно полагаться на исследования in vivo, так как модели in vivo не точно повторяют микросреду систем человеческого организма; поэтому неизбежно подвергнуть большое количество людей воздействию этих наноматериалов для отслеживания уровня биосовместимости и цитотоксичности для клеток хозяина.