Анемия Фанкони (FA) - серьезное генетическое заболевание, характеризующееся в основном аномалиями развития, предрасположенностью к раку и недостаточностью костного мозга (BMF), которая становится очевидной у большинства пациентов с FA в течение первого десятилетия жизни ^1-3. Андрогенная терапия и регулярные переливания крови могут облегчить состояние BMF у пациентов с FA, но не устраняют основную причину заболевания ⁴. Аллогенная трансплантация гемопоэтических стволовых клеток (HSCT) от здоровых доноров является единственным методом лечения BMF у этих пациентов, но несет серьезные риски, такие как болезнь трансплантата против хозяина и повышенная частота сквамозной клеточной карциномы в долгосрочной перспективе ^{5, 6}. Генетические методы лечения, дополняющие или устраняющие мутации, вызывающие FA, во время аутологичной HSCT дадут много преимуществ перед традиционной терапией, потенциально обеспечивая длительное излечение без побочных эффектов, связанных с аллогенной трансплантацией ⁷.

FA вызывается мутациями в любом из 23 генов, которые участвуют в пути реакции на повреждение ДНК FA/BRCA ⁸. Продукты генов FA работают вместе в физических комплексах и связанных путях для восстановления межнитевых поперечных связей (ICLs) в ДНК, которые могут быть вызваны повреждающими ДНК агентами, такими как химиотерапевтические препараты (цисплатин, митомицин C) или эндогенными побочными продуктами метаболизма, такими как альдегиды ^{9, 10}. В отсутствие функционального пути FA, эти неразрешенные ICLs в конечном итоге приводят к хромосомным разрывам и нестабильности генома. Клетки пациентов с FA также нарушают нормальные уровни распространенных стрессовых факторов, таких как разрушение вилки репликации ¹¹, что подчеркивает важность пути FA для сохранения целостности генома.

Недавно лентивирусная генотерапия была успешно использована для лечения HSCs пациентов с FANCA-дефицитом (FA-A), наиболее распространенной группой комплементации FA, с помощью оптимизированных протоколов мобилизации HSCs ¹² и трансдукции ¹³. Хотя серьезных побочных эффектов не наблюдалось ни в испытании генотерапии FA, ни в большинстве испытаний генотерапии, опосредованной LV, разработанных к настоящему времени ¹⁴, возможность проведения точной генной репарации в мутировавших последовательностях, ответственных за генетическое заболевание, в HSCs FA в данном конкретном случае является дополнительной гарантией повышения безопасности генотерапии. Более того, редактирование генов также поддерживает эндогенную регуляцию экспрессии генов и может расширить терапевтическое применение на группы комплементации FA, связанные с мутациями в сильно регулируемых генах.

"Классическое" редактирование генома CRISPR-Cas основано на создании двухцепочечного разрыва ДНК (DSB) мишени, который может быть устранен либо с помощью подверженных ошибкам путей для создания полу-случайных небольших вставок и делеций (indels), либо с помощью точной гомологически направленной репарации (HDR) с помощью шаблона ^{15, 16}. Хотя HDR теоретически может способствовать "хирургическому" изменению практически любой мутации на последовательность дикого типа, ее эффективность низка в примитивных HSCs и особенно нарушена в FA-HSCs из-за их дефектов HDR ¹⁷. Редактирование генома на основе indels было продемонстрировано как хорошая альтернатива для исправления специфических мутаций FA, преобразуя нонсенс в in-frame мутации, которые восстанавливают функцию гена FA ¹⁸. Однако этот подход ограничен в спектре мутаций пациентов, которые могут быть устранены.

Новые системы редактирования генома, такие как редактирование оснований (BE), которые работают без индукции двуцепочечных разрывов ДНК, теоретически предлагают большие возможности для точного исправления специфических мутаций в генах FA ^{19, 20}. Тем не менее, возможен ли путь к генетическому излечению FA при использовании одного из многих существующих редакторов оснований, остается неясным. Здесь мы впервые сообщаем о BE-подходе к двум наиболее распространенным мутациям FANCA в клетках пациентов. Мы обнаружили, что редактирование адениновых оснований может быть очень эффективным для воздействия на аллели FA. Оптимизация конструкции редактора адениновых оснований, типа вектора, формата направляющей РНК и условий доставки восстановила экспрессию FANCA, молекулярную функцию пути FA и фенотипическую устойчивость к сшивающим агентам. Важно отметить, что ABE8e индуцировал беспрецедентно высокий уровень конверсии генов в HSPCs пациента с FA, что подтверждает большой потенциал этой стратегии для будущего клинического применения при FA.

Figure 6:mPB lineage negative cells from a FA-A patient (FA-55) can be efficiently edited by ABE8e.

A) Schematic representation of the experiment to edit lineage depleted (lin-) cells from an FA patient harboring c.295 C>T mutation. FA Lin-HSPCs were pre-stimulated for 24hr and edited with mABE8e mRNA and synthetic FA-55 sgRNA1. 24 hours after electroporation, CFUs were plated and number of CFUs in the absence or presence of MMC were scored. Individual colonies were collected to analyze the percentage of edited CFUs.

B) Survival of hematopoietic colonies (CFUs) obtained from unedited (no electroporation or mock electroporation) and edited FA Lin-HSPCs before and after MMC exposure (10nM). Number of CFUs in each condition is indicated above bars.

C) Sanger sequencing analysis of individual colonies from patient FA-55 after base editing with ABE8e in the absence or presence of MMC.

Размороженные Lin-клетки предварительно стимулировали в течение 24 часов и электрофоретировали мРНК ABE8e вместе с синтетической gRNA, нацеленной на FA-A. Через 24 часа после электропорации мы высевали необработанные, макетные нуклеофицированные и макетные отредактированные клетки в метилцеллюлозу и обрабатывали каждую культуру низкой дозой (10 нМ) MMC или транспортным средством. В присутствии MMC, макетные электрофоретированные или не-электрофоретированные Lin-клетки демонстрировали очень низкую способность к образованию колоний (Рисунок 6B). В отличие от этого, отредактированные ABE8e Lin-клетки образовывали одинаковое количество колоний в присутствии и отсутствии MMC, что подтверждает реверсию характерной для клеток FA гиперчувствительности к MMC (Рисунок 6B). Sanger-секвенирование в отдельных CFCs показало, что редактирование генов произошло по обоим аллелям во всех проанализированных колониях, независимо от того, были ли эти колонии получены в присутствии или отсутствии MMC (Рисунок 6C). Эти данные демонстрируют высокую эффективность ABE8e в отношении HSPC из HDs и от пациентов с FA, и подчеркивают потенциал редакторов оснований для исправления распространенной мутации, наблюдаемой при FA.

Здесь мы изучили возможность использования редакторов оснований CRISPR-Cas для устранения последствий мутаций FA в полученных от пациентов LCLs и HSPCs. В то время как стратегии на основе NHEJ и HDR были изучены для генетического лечения FA HSPCs ^{18, 42-44}, это первое исследование, которое, насколько нам известно, демонстрирует доказательство концепции, что редакторы оснований переносятся и высокоэффективны в FA HSPCs.

Путь FA является многофункциональным, играя роль в восстановлении сшивок ДНК, восстановлении DSB и перезапуске вилки репликации, среди прочих соответствующих функций ^45-47. Отсутствие этих функций скомпрометировало подходы на основе HDR для коррекции аллелей в клетках пациентов с FA. Однако мы обнаружили, что отсутствие функционального пути FA не препятствует активности редактора адениновых оснований в LCLs и HSPCs. Это позволяет предположить, что путь FA не является необходимым для активности редактора оснований и может быть использован в качестве новой терапевтической стратегии при FA. Редактирование нонсенс в миссенс мутацию и миссенс в дикий тип FANCA привело к фенотипическому спасению как на молекулярном, так и на фенотипическом уровне. Мы уверены, что описанный здесь подход может быть распространен на другие аллели FA и станет основой будущих методов лечения FA с помощью редактирования генов.

Мы обнаружили, что редактирование ABE может дать фенотипическую коррекцию в LCLs FA и HSPCs FA. В отредактированных LCLs FA-55 мы наблюдали повторную экспрессию белка FANCA, молекулярные доказательства повторной активации пути FA и значительное пролиферативное преимущество по сравнению с не-редактированными клетками. Аналогичным образом, отредактированные FA-75 LCLs продемонстрировали фенотипическую коррекцию на нескольких уровнях. Базовые отредактированные FA HSPC растут в присутствии MMC, что указывает на фенотипическую коррекцию первичных клеток пациента. Однако доступ к достаточному количеству FA HSPC не позволил нам в настоящее время определить, эффективно ли эти фенотипически исправленные FA HSPC приживаются в иммунодефицитной мышиной модели. Такой тест станет важным шагом в дальнейших доклинических исследованиях. Важно отметить, что способность приживления отредактированных по основаниям HSPC у иммунодефицитных мышей не изменилась по сравнению с неотредактированными клетками ни при использовании HD CB, ни при использовании mPB CD34+ клеток. Эти результаты согласуются с недавними исследованиями, проведенными на здоровых и больных серповидноклеточных HSPC ^{41, 48, 49}. Дальнейшие исследования позволят непосредственно решить важный вопрос о потенциале приживления клеток FA, отредактированных по основаниям.

Чрезвычайно высокая активность ABE8e может привести к повышению уровня непреднамеренных мутаций в окне редактирования и во внецелевых локусах ³⁵. Мы обнаружили высокий уровень непреднамеренных мутаций в окне редактирования FA-75, но не в сайте FA-55. Мы также обнаружили значительное смещение ABE8e от мишени в сайте-кандидате для sgRNA FA-75, но не обнаружили его для sgRNA FA-55. Несмотря на непреднамеренные модификации в клетках, отредактированных с помощью ABE8e, редактор был способен на гораздо более высокую эффективность редактирования в CD34+ HSPCs (рис. 5), что позволяет редактировать клинически значимые долгоживущие HSPCs. ABE8e все еще может быть полезен в FA-75, так как побочные исправления происходят на колеблющихся (wobble) основаниях и, по прогнозам, будут нейтральными после экспансии исправленного аллеля. Наш фенотипический анализ в LCLs FA-75 (рис. 3) показал, что эти побочные мутации не влияют на функцию FANCA и активацию пути FA. При необходимости можно уменьшить побочные и внецелевые эффекты ABE8e, используя RNP ABE8e или вирусоподобные частицы ABE8e, которые, как сообщалось, уменьшают внецелевые эффекты ДНК ^{35, 50}. Вариант ABE8e (TadA-8e V106W) также может быть полезным инструментом для снижения непреднамеренной модификации оснований. Непредвзятая идентификация геномных и транскриптомных внецелевых мишеней будет важным следующим доклиническим шагом в проверке любого подхода к редактированию оснований для лечения FA.

В целом, наше исследование показывает, что редактирование оснований аденина является осуществимым подходом для эффективного восстановления функций в HSPC пациентов с FA. Эти результаты закладывают основу для использования редакторов оснований при FA и других нарушениях репарации ДНК, где эти целевые инструменты могут быть более эффективными и даже безопасными по сравнению с существующими нецелевыми терапиями добавления генов.