Система CRISPR/Cas является частью адаптивного иммунитета бактерий и архей [23]. Адаптивность к ранее встречавшимся агрессорам, таким как вирусы, зависит от специфических последовательностей нуклеиновых кислот в бактериальном геноме. Clustered regularly interspaced short palindromic repeats ("CRISPR") обозначают повторяющиеся элементы в бактериальном геноме, за которыми следуют короткие фрагменты чужеродных нуклеиновых кислот вирусного или плазмидного происхождения, которые становятся интегрированными после того, как организму был брошен вызов чужеродным генетическим материалом. Соответствующие участки бактериальной ДНК транскрибируются в РНК, которая затем содержит комплементарные последовательности к последовательностям ранее вторгшегося вирусного или плазмидного генетического материала [24]. Если ранее встречавшаяся чужеродная ДНК попадает в бактериальную клетку и комплементарно связывается с РНК CRISPR, этот комплекс затем направляется к нуклеазе ("Cas", CRISPR-associated), которая вносит двунитевой разрыв в чужеродную ДНК, чтобы заставить ее замолчать [25].

Потенциал использования системы CRISPR/Cas для редактирования генома с помощью программируемой РНК был открыт в 2012 году Jennifer A. Doudna и Emmanuelle Charpentier, которые за свою работу были удостоены Нобелевской премии по химии в 2020 году [26]. С момента открытия использование системы CRISPR/Cas для редактирования генома быстро расширялось, особенно с использованием системы CRISPR/Cas9, полученной из Streptococcus pyogenes [23]. Для редактирования генома с помощью CRISPR/Cas9 требуется только нуклеаза Cas9 и направляющая РНК (gRNA). [27].

В бактериях существуют два различных вида РНК, называемые "crRNA" и "tracrRNA", необходимые системе CRISPR/Cas для облегчения расщепления чужеродного материала ДНК. gRNA несет последовательность, направляющую комплекс к определенному участку ДНК. Чтобы использовать систему CRISPR/Cas для редактирования генома, необходимое условие наличия двух разных РНК можно обойти с помощью крупного прорыва, который привел к значительному упрощению применимости: разработка синтетической gRNA, которая может взять на себя функции двух бактериальных РНК [26]. РНК направляет нуклеазу в определенный геномный участок путем сопряжения оснований Уотсона-Крика первых 20 нуклеотидов gRNA с целевой последовательностью ДНК. Соответствующая последовательность ДНК называется "протоспейсер" и должна быть расположена рядом с мотивом примыкания protospacer-adjacent motif (PAM), который взаимодействует с нуклеазой (например, последовательность PAM, с которым взаимодействует Cas9 из Streptococcus pyogenes, - NGG, где "N" - любой нуклеотид, а "G" - гуанин). [23]. Проектируя 20-нуклеотидную последовательность gRNA, система CRISPR/Cas9 может быть направлена практически на любую 20-нуклеотидную последовательность, расположенную рядом с PAM. После того как нуклеаза внесла двунитевой разрыв в целевую ДНК, эндогенная система репарации ДНК стремится восстановить разрыв с помощью различных механизмов. Однако этот процесс сопряжен с ошибками и регулярно приводит к случайным вставкам или делециям в месте разрыва. Это, в свою очередь, может вызвать сдвиг рамки считывания и тем самым привести к дисфункции гена [27] (рис. 1).



Figure 1. Shown is the principle of using the clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) system for genome editing. The programmable guide RNA (gRNA) complementary binds to a specific DNA sequence termed "protospacer". The DNA-gRNA complex recruits a nuclease such as Cas9. The nuclease has to interact with a specific DNA sequence next to the protospacer termed "protospacer-adjacent motif" (PAM) in order to work. If these requirements are fulfilled, the nuclease introduces a double strand break in the DNA. Endogenous DNA repair mechanisms follow. These repair mechanisms are error-prone and lead to random insertions or deletions, which, in turn, render the gene and the encoded protein dysfunctional. In a further development, the catalytic domain of Cas9 has been deactivated and fused to a base editor, which does not introduce double strand breaks, but precise single-nucleotide changes.

Нуклеаза Cas9 - единственный белок, необходимый для того, чтобы вызвать необходимые разрывы в ДНК. Было открыто множество вариаций нуклеазы Cas9 и сконструировано еще больше альтернатив Cas9. Хотя первые открытые белки Cas9 могли вызывать только двунитевые разрывы, различные лаборатории используют редакторы оснований, используя каталитически неактивный белок Cas9, соединенный с цитидин- или аденозиндезаминазой [28]. Как и Cas9, редактор оснований требует наличия gRNA, которая направляет его к определенной последовательности ДНК - протоспейсеру - для работы. Вместо того чтобы вносить двунитевые разрывы, редактор оснований приводит к однонуклеотидным изменениям в протоспейсере, а в определенном положении в протоспейсере происходит пик активности редактирования оснований [29]. Например, при использовании аденинового редактора оснований аденин (А) (спаренный с тимином (Т) на противоположной нити ДНК) в позиции пикового редактирования дезаминируется редактором оснований и превращается в инозин (I). Другая нить зарубцовывается. В результате репарации инозин соединяется с цитозином (C) вместо T, а затем инозин заменяется гуанином (G) для соединения с C. В результате A-T превращается в G-C без двухцепочечного разрыва [6].

Использование системы CRISPR/Cas для редактирования генома имеет ряд преимуществ по сравнению с другими ранее разработанными стратегиями, такими как нуклеазы с цинковыми пальчиками и нуклеазы с эффектором, подобным активатору транскрипции (TALEN). Вышеупомянутые стратегии основаны на расщеплении ДНК, опосредованном белками, и требуют белковой инженерии для достижения специфичного участка, в то время как программируемая часть системы CRISPR/Cas (gRNA) относительно проста и недорога в разработке и производстве. Кроме того, CRISPR/Cas позволяет использовать несколько различных gRNA в одном векторе одновременно для воздействия на различные участки генома [30,31].

Однако у этого подхода есть и ограничения, которые потенциально ограничивают его универсальное применение. Наиболее важным является эффект off-target, т.е. редактирование генома на участках, отличных от мишени, из-за гомологии последовательностей мишени и сайтов вне мишени. Вне-целевые эффекты могут привести к непреднамеренному ингибированию других генов и потенциальному онкогенезу [32]. Несмотря на то, что для минимизации потенциальных эффектов off-target было использовано множество подходов, таких как модификация gRNA, редактирование off-target остается серьезной проблемой, присущей методологическому принципу, и требует тщательного рассмотрения перед любым потенциальным клиническим применением. Это имеет особое значение, поскольку обнаружение внецелевого мутагенеза является сложной задачей [33]. Другие подходы к редактированию генов, которые не приводят к двунитевым торможениям и считаются менее вероятными для возникновения нецелевого редактирования, включают использование редактирования оснований (как обсуждалось выше) и прайм-редактирования; последний принцип основан на использовании Cas9, слитого с модифицированной обратной транскриптазой, которая направляется РНК-шаблоном, служащим праймером для обратной транскриптазы и содержащим редактируемую последовательность в качестве расширения gRNA [34]. Кроме того, хотя gRNA в принципе может быть нацелена на любое геномное место, активность соответствующей нуклеазы зависит от наличия PAM рядом с нацеливаемой последовательностью. Если для трехнуклеотидного PAM Cas9 из Streptococcus pyogenes это незначительное ограничение, то у других бактерий PAM больше, сложнее и реже присутствуют в геноме. Стратегии преодоления этого ограничения включают использование различных белков Cas9 и мутагенез белка, который влияет на его PAM-специфичность [35]. Кроме того, на сегодняшний день редактирование генов приходится рассматривать как необратимое лечение, которое в случае неблагоприятных последствий нельзя прекратить, как это делают обычные лекарства [36]. Наконец, существующие методы редактирования генома очень сильно различаются по своей эффективности, в зависимости от генетического локуса и ткани. Однако исследования показали, что эффективность редактирования генов относительно высока в гепатоцитах, что важно для потенциального будущего лечения дислипидемий. Напротив, эффективность оказывается низкой, например, в кардиомиоцитах [27].

Первое исследование in vivo на мышах было опубликовано Ding et al. [37]. Авторы выбрали gRNA, нацеленную на экзон 1 мышиного Pcsk9, и создали аденовирус, экспрессирующий эту gRNA и Cas9. Через 3-4 дня после введения аденовируса мутагенез Pcsk9 произошел в более 50% случаев, что привело к значительному снижению уровня PCSK9 и снижению общего холестерина на 35-40%. Никаких внецелевых эффектов не наблюдалось. Однако этот подход был ограничен использованием аденовируса, который может вызывать иммунный ответ и не является оптимальным для применения у людей [27]. Кроме того, эта стратегия приводит к постоянной экспрессии Cas9, что, по-видимому, не было необходимым, поскольку более 50% Pcsk9 было отредактировано через три дня после введения. Использование адено-ассоциированного вируса в качестве предпочтительного вектора для лечения людей оказалось невозможным, так как мРНК Cas9 Streptococcus pyogenes вместе с gRNA были слишком большими, чтобы поместиться в этот вектор.

Wang и др. использовали модель мыши с гуманизированными гепатоцитами [38]. В качестве вектора снова использовался аденовирус, несущий генетическую информацию Streptococcus pyogenes Cas9 и gRNA, нацеленную на экзон 1 PCSK9. Через четыре дня после введения этого вектора произошел почти 50% мутагенез PCSK9 и 52% уменьшение человеческого белка PCSK9. Поскольку мыши в данном исследовании представляли собой модель химерной печени и человека, уровень белка PCSK9 у мышей повысился, вероятно, в качестве компенсаторного механизма, что, по мнению авторов, объясняет отсутствие эффекта на уровень общего холестерина. Как и в исследовании Ding et al., не было обнаружено никакого соответствующего внецелевого мутагенеза.

Используя адено-ассоциированный вирус вместо аденовируса, Ran и др. применили ортологию Cas9 из Staphylococcus aureus вместо Cas9 из Streptococcus pyogenes [39]. Поскольку Staphylococcus aureus Cas9 меньше, его генетическая информация поместилась в адено-ассоциированный вирусный вектор вместе с gRNA, нацеленной на мышиный Pcsk9. Через неделю после инъекции у мышей наблюдался мутагенез в Pcsk9 более чем на 40%, а уровень белка Pcsk9 и общего холестерина значительно снизился на 95% и 40%, соответственно.

На сегодняшний день существует три сообщения о редактировании генов PCSK9 у нечеловеческих приматов.

4.2.1. PCSK9 Editing Using a Meganuclease Первое исследование по редактированию генов in vivo у нечеловеческих приматов было опубликовано Wang et al., которые сообщили об использовании адено-ассоциированного вируса, несущего генетическую информацию для мегануклеазы [40]. Принцип работы мегануклеаз следует отличать от системы CRISPR/Cas. Мегануклеазы сконструированы на основе самонаводящихся эндонуклеаз (идентифицированных у дрожжей), которые вносят двунитевые разрывы в определенные последовательности. Мегануклеазы имеют небольшие размеры и работают с высокой специфичностью, но считаются более сложными для инженерии по сравнению с системой CRISPR/Cas. Специфичность последовательности ДНК мегануклеаз достигается путем белковой инженерии, в то время как специфичность системы CRISPR/Cas зависит от последовательности gRNA. Авторы протестировали свой подход на макаках-резусах и наблюдали зависимое от дозы снижение уровня PCSK9 до 84% при снижении уровня LDL-C до 60%. Однако было выявлено значительное количество сайтов вне мишени, где происходило непреднамеренное редактирование. После детального анализа внецелевых участков нуклеаза была переконструирована и показала, что она вызывает меньшее (но все еще заметное) внецелевое редактирование, сохраняя при этом эффективность снижения уровня LDL-C. Инъекции сопровождались преходящим повышением сывороточных трансаминаз из-за реакции Т-клеток. За лечеными нечеловеческими приматами наблюдали до трех лет, и у них наблюдалось стабильное снижение уровня PCSK9 и LDL-C в сыворотке крови [41]. Первоначально обнаруженное внецелевое редактирование оставалось стабильным с течением времени.

Хотя использование мегануклеазы имеет то преимущество, что позволяет использовать адено-ассоциированный вирус вместо аденовируса, основными недостатками являются наблюдаемое значительное нецелевое редактирование и иммунная реакция. Для того чтобы обойти обе эти проблемы, существует еще один вариант - доставка инструмента редактирования генов CRISPR/Cas к месту действия с помощью липидных наночастиц. Концептуально, эти наночастицы содержат gRNA и, кроме того, либо нуклеазу в виде белка, либо генетический материал, кодирующий нуклеазу в виде плазмиды или мРНК. В последнем случае рибосомальная система хозяина транскрибирует нуклеазу, а введенная мРНК и нуклеаза со временем деградируют. Переходящая экспрессия нуклеазы представляется достаточной для достижения устойчивого редактирования генома. Серьезных иммунных реакций не ожидается, поскольку наночастицы не содержат вирусного материала [42].

Такие наночастицы были использованы во втором исследовании по редактированию PCSK9 у не-человекообразных приматов. Исследование было проведено Musunuru и др. и представляет собой наиболее продвинутую из опубликованных на сегодняшний день попытку редактирования PCSK9 in vivo [6]. Наиболее важным отличием от предыдущих исследований является использование специфического редактора оснований, который приводит не к двуцепочечным разрывам ДНК, а к высокоспецифичной замене одного нуклеотида. Это исследование - первый отчет об успешном использовании редактора оснований in vivo у не-человекообразных приматов. После первоначального экспериментального исследования, проведенного той же группой, в котором они проверили осуществимость действия редактора оснований на мышах [43], авторы провели серию исследований in vitro, а затем исследования на мышах и cynomolgus обезьянах (Macaca fascicularis) и использовали редактор оснований аденина.

Авторы выбрали и сконструировали gRNA, нацеленную на сайт сплайсинга мРНК PCSK9. Сайты сплайсинга характеризуются последовательностями GT и AG (донорные и акцепторные сайты, соответственно), и замена нуклеотидов в этих сайтах может нарушить регулярный сплайсинг мРНК-предшественника. После определения нескольких потенциальных gRNA, которые теоретически могли бы направлять редактор оснований на A в сайте сплайсинга мРНК-предшественника, в исследованиях in vitro на гепатоцитах человека была выбрана gRNA с высоким уровнем редактирования оснований в нужном сайте, но без соответствующей активности редактирования в других геномных сайтах. Эта gRNA направляет редактор оснований на сайт сплайсинга между экзоном 1 и интроном 1 гена PCSK9. Переход A в G в сайте сплайсинга приводит к его разрушению, что приводит к сохранению интрона 1 в конечной мРНК. В интроне 1 имеется внутрикадровый стоп-кодон с последовательностью TAG, что приводит к прекращению синтеза белка PCSK9 после добавления трех аминокислот (кодируемых интроном 1) к тем, которые кодируются экзоном 1 (рис. 2).



Figure 2. Genome editing of PCSK9 using a base editor that introduces a single-nucleotide change at the splice site of exon 1 and intron 1. This results in retention of intron 1 in the final mRNA, which contains an in-frame stop codon, leading to premature termination of protein synthesis.

Доставка инструмента редактирования генов была облегчена с помощью липидных наночастиц, содержащих химически синтезированную gRNA и транскрибированную in vitro мРНК, кодирующую редактор оснований. Исследования in vitro на человеческих гепатоцитах выявили 60% редактирование оснований в целевом сайте сплайсинга, а экспрессия PCSK9 была снижена на 55%. Аналогичные результаты были получены на гепатоцитах обезьян, поскольку целевая последовательность в ортологе PCSK9 приматов идентична человеческой. Далее авторы исследовали свой подход на мышах, используя gRNA, соответствующую последовательности ортологии Pcsk9 мыши. Редактирование оснований наблюдалось в 70% клеток печени (это означает, что практически все гепатоциты были поражены, поскольку около 70% клеток печени составляют гепатоциты).

После этого были обработаны cynomolgus обезьяны. Наночастицы, содержащие два типа РНК, вводились внутривенно. В двух краткосрочных исследованиях с некропсией через 24 часа и две недели после введения наблюдалось в среднем 63% редактирования генов. Уровень белка PCSK9 и LDL-C был снижен на 81% и 65%, соответственно. На другие ткани, кроме печени, редактирование генов повлияло лишь минимально. Следует отметить, что обезьян предварительно лечили дексаметазоном, фамотидином и дифенгидрамином. Тем не менее, наблюдалось небольшое, преходящее повышение печеночных трансаминаз, которое нормализовалось через две недели после введения. В дальнейших исследованиях этот переходный рост может быть связан с липидными наночастицами, а не с содержащимися в них РНК. Все компоненты инфузии были выведены из организма в течение двух недель. Сравнивая выбранные gRNA с геномной библиотекой человека и обезьян-cynomolgus, авторы выявили до 67 относительно гомологичных геномных участков, подверженных риску внецелевого редактирования. Затем авторы исследовали нецелевое редактирование в этих участках, используя гепатоциты обезьян и биопсии печени обезьян, подвергшихся лечению, и обнаружили, что вне-целевое редактирование происходит очень редко, а наиболее распространенный участок не-целевого редактирования показал менее 1% редактирования. Этот наиболее распространенный сайт редактирования вне мишени находился в гене PCSK9 обезьяны, который отличается от человеческого ортолога. Также были протестированы человеческие гепатоциты, и в них не было обнаружено вне-целевого редактирования.

Последней и, вероятно, самой важной частью исследования является продолжающееся долгосрочное исследование с обезьянами, прошедшими курс лечения, с последующим наблюдением до восьми месяцев. Здесь наблюдался устойчивый эффект редактирования PCSK9 со снижением уровней PCSK9 и LDL-C в среднем на 90% и 60%, соответственно. По сравнению с фармакологическим ингибированием PCSK9, наблюдалось снижение концентрации липопротеина на 35%. После первоначального повышения уровня печеночных ферментов, аналогичного краткосрочному исследованию, в последующем повышения показателей функциональных тестов печени не наблюдалось.

Как отмечают авторы в своем исследовании [6], их подход может иметь ряд преимуществ по сравнению с использованием мегануклеазы. Что касается эффективности, то частота достигнутого редактирования PCSK9 была выше. Кроме того, замена одного нуклеотида представляет собой небольшое вмешательство по сравнению с индуцированием двухцепочечного разрыва ДНК и интеграцией вирусного генома в геном хозяина. Кроме того, в исследовании Wang et al. повышение уровня аминотрансфераз было более выраженным и продолжительным (до нескольких месяцев), в то время как после инфузии липидных наночастиц наблюдался лишь кратковременный ответ, что было связано с самой липидной наночастицей, а не с ее содержанием. Наконец, Musunuru et al. не наблюдали никакого вне-целевого редактирования, в то время как Wang et al. наблюдали значительную вне-целевую активность.

Третье исследование по редактированию PCSK9 у не-человекообразных приматов было проведено Rothgangl и другими [44]. Как и в исследовании Musunuru et al. [6], авторы использовали адениновый редактор оснований, который был доставлен липидной нано-частицей, содержащей мРНК редактора оснований и gRNA. Эта gRNA нацелена на донорный сайт сплайсинга интрона 1 и была выбрана в исследованиях in vitro среди нескольких кандидатов gRNA, нацеленных на различные сайты сплайсинга PCSK9. Окончательно выбранная gRNA привела к самой высокой скорости редактирования оснований и значительному снижению уровня мРНК и белка PCSK9. После успешных исследований на мышах авторы лечили обезьян-cynomolgus различными дозами (частично с повторным введением) мРНК и gRNA, содержащих липидные наночастицы. Обезьян умерщвляли на 29-й день. Лечение сопровождалось временным повышением уровня аминотрансфераз, которое исчезало на 7-й день после инфузии. Редактирование оснований произошло в среднем у 26%, при этом белок PCSK9 снизился на 32%, а LDL-C - на 14%. Поскольку повторное введение препарата не увеличило скорость редактирования оснований, авторы провели исследование на предмет возможного иммунного ответа и обнаружили, что у повторно леченных животных образовались IgG против редактора оснований. Вне-целевого редактирования не наблюдалось.

По сравнению с исследованием Musunuru et al. [6], в исследовании Rothgangl et al. [44] был использован аналогичный подход, однако наблюдение было короче, а эффективность редактирования оснований и влияние на PCSK9 и LDL-C были менее выраженными. Повторное дозирование, к сожалению, не оценивалось в исследовании Musunuru et al., а выявление IgG-опосредованного ответа Rothgangl et al. требует дальнейшего изучения иммунного ответа на редактирование оснований.

Основные данные трех вышеописанных исследований сравниваются в таблице 1.

Table 1. Comparison of studies on PCSK9 editing in non-human primates.

Всего 15 лет прошло с момента идентификации PCSK9 как регулятора липидного обмена до доказательства благотворного влияния терапевтического ингибирования PCSK9 на человека. Открытие того, что система CRISPR/Cas может использоваться в качестве инструмента для редактирования эукариотических геномов, было еще более недавним. Сочетание перспективной мишени для лечения и высокоспецифичного, потенциально одноразового метода лечения дает важное понимание и большой потенциал. Следует отметить несколько аспектов:

Во-первых, традиционные препараты, снижающие уровень липидов, такие как статины или эзетимиб, необходимо принимать ежедневно. Ингибиторы PCSK9 или, в последнее время, siRNA инклизиран назначаются каждые две-четыре недели или два раза в год, соответственно. Несмотря на значительный прогресс в лечении дислипидемий в последние десятилетия, приверженность к приему лекарств по-прежнему имеет значение для смертности [45]. Если предположить, что подход "раз и готово" [6] Musunuru и др. будет эффективным и безопасным у людей, это решит проблему предпочтения к лечению. Наблюдаемое снижение уровня LDL-C примерно на 60% сопоставимо с тем, что может быть достигнуто статинами или антителами PCSK9 [46], а понятие устойчивого снижения LDL-C может дать дополнительные преимущества в отношении кумулятивного влияния LDL-C на атеросклероз [47]. Еще одним потенциальным преимуществом является то, что, подобно антителам PCSK9 и siRNA inclisiran, для редактирования генов CRISPR/Cas не ожидается никаких взаимодействий с другими препаратами или ограничений, таких как снижение функции почек.

Во-вторых, данные Musunuru et al. представляются многообещающими в разных отношениях. Редактирование генома происходило 1. практически орган-специфично, 2. специфично для геномного участка, 3. без соответствующего вне-целевого мутагенеза, 4. с незначительной модификацией генома хозяина, не полагаясь на случайные вставки или делеции после двухцепочечного разрыва ДНК, и 5. без интеграции вирусного генома. Было показано, что все введенные компоненты быстро разрушаются. Однако перед потенциальным применением на людях необходимы данные о долгосрочной безопасности у не-человекообразных приматов.

В-третьих, имеющиеся данные о редактировании PCSK9 открывают возможности для других генетически подтвержденных мишеней лечения дислипидемии, таких как lipoprotein(a), ангиопоэтин-подобный 3 и аполипопротеин CIII, которые уже можно подавлять с помощью анти-смысловых олигонуклеотидов и siRNA [18]. Первые попытки решения этих проблем представляются многообещающими [36,48].

В-четвертых, следует помнить, что, несмотря на концептуальную элегантность и очевидную безопасность, перед любым клиническим применением необходимо продемонстрировать долгосрочную эффективность и безопасность. Поскольку современные методы приводят к (предположительно) необратимым изменениям в геноме, это подразумевает, что эффективность будет сохраняться всю жизнь, без простой возможности прекратить лечение. Это резко контрастирует с более гибким применением моноклональных антител PCSK9 или siRNA с возможностью прекращения лечения. Более того, потенциальный возврат к исходному геномному коду создает дополнительный риск вне-целевого редактирования. Кроме того, хотя носители PCSK9 с утраченной функцией не испытывают негативных проблем со здоровьем, существует вероятность того, что терапевтически индуцированный нокаут PCSK9 может вызвать неблагоприятные последствия. Например, было показано, что у мышей с нокаутом PCSK9 развивается печеночный стеатоз после с высоким содержанием жира диеты, связанный с повышенной экспрессией CD36 на гепатоцитах [49]. Чтобы полностью оценить клиническое значение этого понятия, необходимо изучить влияние различных диет, учитывая при этом, что Macaca fascicularis, исследованные в двух из упомянутых исследований [6,44], являются вегетарианцами. Таким образом, необратимые изменения в геноме также указывают на то, что клинические испытания первой фазы должны начинаться на пациентах, а не на здоровых добровольцах. Кроме того, в настоящее время липидные нано-частицы, по-видимому, вызывают значительный иммунный ответ. Вариантом повышения специфичности для печени и возможного снижения иммунного ответа может быть включение молекул GalNAc в поверхность липидных наночастиц [50]. Другой проблемой является идентификация пациентов-мишеней. Эффективность генной терапии PCSK9 может быть ограничена у пациентов с FH, имеющих мутацию LDLR, поскольку у этих пациентов уже нарушено поглощение LDL-C за счет экспрессии меньшего количества рецепторов LDL; однако клинические испытания антител PCSK9 у пациентов с гетерозиготным FH показали сопоставимую эффективность снижения уровня LDL, как и у пациентов без FH [14,51]. Генное редактирование самого LDLR у таких пациентов может стать еще одним возможным шагом. Эти вопросы должны быть рассмотрены в будущих исследованиях.

Наконец, редактирование генома принципиально отличается от других известных фармакологических методов лечения тем, что его цель - вызвать необратимые геномные изменения. В то время как изменения в клетках зародышевой линии могут передаваться потомству, в обсуждаемых здесь подходах, где мишенью являются только соматические клетки, дело обстоит иначе. Хотя изменение генома только одного человека обычно считается более терпимым, перед любым рутинным клиническим применением необходимо провести тщательное и критическое этическое обсуждение [52].

Использование системы CRISPR/Cas распространилось на все дисциплины медицины. Хотя моногенетические заболевания представляются очевидной главной целью подхода редактирования генов [53], технологии редактирования генов и оснований могут со временем стать частью терапевтического арсенала для более распространенных заболеваний, таких как дислипидемия. Теоретически, однократное применение в молодом возрасте может привести к устойчивому снижению уровня LDL-C и значительному снижению сердечно-сосудистого риска [54], что открывает возможности для настоящей первичной профилактики атеросклероза.