Заболеваемость злокачественными опухолями центральной нервной системы и другими опухолями ЦНС составила около 31,5% от всех опухолей головного мозга с 2000 по 2014 год [1], где несвоевременная и неэффективная диагностика и лечение привели к невыносимым последствиям. Опухоли центральной нервной системы, растущие из различных участков и типов тканей, могут вызывать различные степени последствий, включая различные степени и формы когнитивных, моторно-сенсорных и интеллектуальных нарушений, а иногда даже смерть [2]. Ostrom QT et al. собрали и проанализировали данные из базы данных CBTRUS и показали, что злокачественные опухоли составили 49,1% опухолей центральной нервной системы с 2014 по 2018 год, в среднем 4,43 смертей на 100 000 человек в течение четырех лет [3]. Наиболее распространенной злокачественной опухолью центральной нервной системы является глиома, которая составляет 14,3% всех опухолей центральной нервной системы и является основной причиной смерти у большинства пациентов с внутричерепными опухолями [4]. По типу клеток глиомы можно разделить на астроцитому, глиобластому, олигодендроглиому и многие другие, а лечение и прогноз различных типов глиомы различаются соответственно. Однако все они лечатся традиционным хирургическим иссечением в сочетании с радио- и химиотерапией [5].

В дополнение к традиционным хирургическим методам ученые ищут новые открытия для улучшения диагностики и лечения глиомы. Moolten et al. продемонстрировали, что слитые белки антитела-токсины могут воздействовать на опухолевые клетки [6]. Основываясь на этом, Pastan I et al.. разработали иммунотоксин, то есть молекулу, которая специфически связывается с рецепторами, избыточно экспрессированными на опухолевых клетках, чтобы убить их. Рецептор гликопротеинов (белок B не-метастатической меланомы) на клетках глиомы также дал новую идею для целевой терапии глиомы [7].

В настоящее время патогенез глиомы еще не ясен, и потенциальные патогенные факторы включают наследственность или специфический полиморфизм генов (генетическая проблема), ионизирующее излучение, канцерогены нервной системы и другие. Поэтому мы можем рассмотреть возможность проведения новых исследований в области генотерапии. В настоящее время область генотерапии является актуальной темой для изучения глиом; исследователи обнаружили с помощью технологии секвенирования генов, что гены, включая EGFR и ERT, могут быть использованы для диагностики потенциальных пациентов с глиомой и определения прогноза [8]. С помощью интеграции генов и анализа пациентов с глиомой, Lake JA et al. обнаружили, что в 39 из 61 случая были выявлены целевые геномные изменения в их генах, 50% из которых включали интеграцию или мутацию BRAF [9]. Некоторые эксперименты также доказали, что диагностике, прогнозу и лечению глиомы может помочь выявление мутаций в генах пациента, таких как IDH1 и TP53 [10]. Кроме того, многие исследователи изучали механизмы и функции различных генов в патогенезе и прогрессировании глиомы [11-14]. Также было подтверждено, что вирусный вектор, разработанный и основанный на генетических исследованиях, оказывает определенное влияние на лечение пациентов с рецидивирующей глиомой высокой степени тяжести [15].

Новая технология редактирования генов, CRISPR/Cas9 может служить важным инструментом для исследования генов в глиомах [16]. CRISPR/Cas9 играет важную роль в иммунотерапии глиомы, создании модели опухоли, исследовании механизмов и скрининге целевых препаратов для лечения глиомы. Современные исследования показали, что редактирование генов с помощью CRISPR/Cas9 может вызывать аутофагию опухолевых клеток, ускорять их апоптоз и другие механизмы для достижения цели - постоянного уничтожения опухолевых клеток [17,18], это не только преодолевает медикаментозные ограничения традиционной терапии, но и повышает эффективность лечения [19,20]. Некоторые исследователи также рассматривали редактирование генов CRISPR/Cas9 как один из методов лечения глиомы у животных; они дополнительно изучили методы его доставки [21,22] и сравнили его лечебный эффект с другими открытыми методами генотерапии [23]. Как уже было сказано выше, мы считаем, что CRISPR/Cas9 будет применяться в клиническом лечении глиомы и имеет большие перспективы.

С быстрым развитием редактирования генов в последние годы редактирование генома путем манипулирования функциональными последовательностями ДНК в геноме хозяина стало основной стратегией в области биомедицинских исследований [24]. CRISPR/Cas9 (clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9), как совершенно новая технология направленной модификации геномов, была широко изучена благодаря простой структуре системы и легкости работы [25]. Система CRISPR/Cas состоит из ряда генов, кодирующих белки Cas и элементы CRISPR, из которых элементы CRISPR состоят из нескольких одинаковых повторяющихся последовательностей и различных спейсерных последовательностей, расположенных попеременно. Существует множество ортологов белков Cas9, включая CRISPR/SpCas9, происходящий из Streptococcus pyogenes, который был широко изучен, CRISPR/FnCas9 из Francisella novicida и CRISPR/CjCas9 из Campylobacter jejuni [26-28]. Благодаря определенному сохранению генов, кодирующих белки Cas, исследователи условно классифицировали систему CRISPR/Cas в соответствии с различиями в Cas и выделили три основных типа системы, то есть Cas3, Cas9 и Cas10, которые являются эффекторами, соответственно, для систем типа I, II и III [29]. По сравнению со сложными эндонуклеазами в CRISPR I и III типов, система CRISPR/Cas II типа включает наименьшее количество белков Cas и обычно считается самой маленькой CRISPR/Cas системой, включающей только повторяющиеся спейсерные последовательности CRISPR и три-четыре гена Cas. Среди них Cas9 кодирует белок с большим количеством доменов и высокой молекулярной массой, который может самостоятельно целенаправленно воздействовать на ДНК, расщеплять ее и вторгаться в нее. В течение следующих десяти лет многие исследователи обратили свой взор на систему CRISPR/Cas второго типа [12,30]. Protospacer adjacent motif (PAM) - это короткая последовательность ДНК, которая может быть распознана, когда Cas9 действует на субстраты ДНК, необходимые для связывания и катализа. Кроме того, PAM-представляющие олигонуклеотиды (PAMmers) стимулируют сайт-специфическое эндонуклеолитическое расщепление ssRNA-мишеней, аналогично PAM-опосредованной стимуляции катализируемого Cas9 расщепления ДНК. Используя специально разработанные PAMмеры, Cas9 можно направить на связывание или разрезание и РНК-мишеней, избегая при этом разрезания соответствующих последовательностей ДНК [31].

Самые ранние исследования системы CRISPR/Cas9 относятся к 1987 году, когда Ishino et al. впервые обнаружили кластер палиндромных последовательностей с короткими спейсерами (разделителями) у Escherichia coli [32]. CRISPR/Cas9, первоначально описанный как защитный механизм бактерий против бактериофагов, стал перспективным инструментом для редактирования генома благодаря легкости его адаптации в клетках млекопитающих, а также универсальности и гибкости для нацеливания практически на любые геномные локусы [33-35]. В 2002 году такое уникальное семейство последовательностей получило официальное название CRISPR. С 2011 года основные функции и механизмы систем CRISPR стали более четко определены, и впоследствии эти системы стали применяться для изучения различных биотехнологий С 2011 года основные функции и механизмы систем CRISPR стали более четко определены, и впоследствии эти системы стали применяться для изучения различных биотехнологий последовательностей, что позволило добиться мульти-генного нокаута в эмбрионе рыбок данио с самой высокой эффективностью 59,4% [36]. В 2014 году NIU et al. ввели соединения CRISPR/Cas9-sgRNA в эмбрионы циномольгусовой обезьяны с помощью технологии одноклеточной микроинъекции эмбрионов для редактирования Ppar-g и Rag1, эффективно добившись модификации генов на определенном участке [37] (показано в таблице 1). Универсальность и высокая эффективность редактирования генома в различных клетках и организмах с помощью системы CRISPR/CAS9 доказывают огромное преимущество этой системы в генетической модификации, делая ее эффективным, удобным и точным инструментом редактирования генов для нового поколения.

Таблица 1. История открытия системы CRISPR/CAS9.

CRISPR вмешивается и защищается от чужеродных организмов в основном с помощью трех шагов. Во-первых, идентифицируются чужеродные гены. После того как чужеродная ДНК идентифицируется клетками хозяина, короткий фрагмент (30-50 пар оснований) вставляется в сайт CRISPR клетки хозяина в качестве спейсерной последовательности. Затем в процессе транскрипции образуется crRNA после обработки нуклеотидами того, что было первоначально транскрибировалось (pre-crRNA), она попадает в банк РНК (crRNA), полученных из коротких CRISPR, и каждая crRNA содержит последовательность, комплементарную чужеродной ДНК. Две РНК, то есть crRNA и tracrRNA (trans-activating crRNA), интегрируются в sgRNA. Наконец, белок Cas9 соединяется с sgRNA и образует рибонуклеопротеиновый комплекс, который распознает и расщепляет участки генов-мишеней [41-45]. После того, как комплекс Cas9-sgRNA идентифицирует сайт гена-мишени, двухцепочечная ДНК мишени разматывается, чтобы sgRNA связалась с последовательностью целевой ДНК мишени в области затравки, образуя таким образом структуру R-петли, которая активирует сайт расщепления для разрезания целевой нити и нецелевой нити в двухцепочечной ДНК с образованием фрагментов ДНК с двухцепочечным разрывом (DSB). Заживление DSB достигается путем негомологичного соединения концов (NHEJ) с созданием случайной мутации вставки или делеции или восстанавливается путем гомологично направленной репарации (HDR) в присутствии чужеродных фрагментов ДНК для точной интеграции целевой последовательности в геном клеток-мишеней (рис. 1) [39,46]. NHEJ может вызывать делеции или вставки нескольких оснований, что приводит к повреждению последовательностей промотора, энхансеров и открытой рамки считывания, связанных с активацией транскрипции, тем самым вызывая нокаут определенного гена. HDR может вызвать мутацию конкретного гена или предсказуемый нокаут в присутствии чужеродного шаблона ДНК [47].



Figure 1. Gene editing mechanisms of the CRISPR/Cas9 system. DSBs (DNA double-stranded breaks) induced by Cas9 (brown) can be repaired in one of two ways: the non-homologous end joining (NHEJ) pathway or the homology-directed repair (HDR) pathway.

CRISPR/Cas9 - это двухкомпонентная система, включающая Cas9 и sgRNA, которые играют роли белка и РНК соответственно. Кластеры регулярно перемежающихся коротких палиндромных повторов (CRISPR/Cas9) широко используются в различных областях биологии и медицины [48,49]. С развитием секвенирования и редактирования генов технология секвенирования генов все шире и шире применяется в фундаментальных исследованиях, а исследования CRISPR/Cas9 при глиоме (табл. 2) показаны на рис. 2.



Figure 2. Advances in the research on and application of CRISPR/Cas9 in Glioma. CRISPR/CAS9 was introduced into a mouse model bearing glioma to impact the formation, progression, and treatment of glioma by different modes of action.

Table 2. Research on application of CRISPR/Cas9 in Neuroglioma.

Редактирование генов CRISPR/Cas9 может не только вводить гены-супрессоры опухолей в опухолевые клетки, но и целенаправленно восстанавливать мутировавшие гены-супрессоры опухолей и в конечном итоге восстанавливать и улучшать активность и функцию генов-супрессоров опухолей, тем самым подавляя возникновение и прогрессирование опухолей. Ген TP53 кодирует транскрипционный фактор и онкосупрессорный белок p53, который регулирует множество внутриклеточных метаболических путей, участвующих в репарации повреждений ДНК, остановке клеточного цикла, апоптозе и старении. Большинство мутаций TP53 являются миссенс-мутациями, что открывает огромные возможности для системы CRISPR/Cas9, которые и были успешно использованы для исправления отдельных нуклеотидов в различных моделях как in vitro, так и in vivo [64]. Кроме того, использование системы CRISPR-Cas9 может повысить эффективность точной коррекции и вставки генов [50].

Мутация гена тесно связана с возникновением и прогнозом глиомы [51]. В настоящее время исследования сосредоточены на использовании CRISPR/Cas9 для лечения глиомы путем нокаута генов, связанных с опухолью. Фактор сборки хроматина 1 субъединица A (CHAF1A) высоко экспрессируется в клетках глиобластомы, а высокая экспрессия CHAF1A связана с плохим прогнозом после лечения глиобластомы, что еще больше способствует пролиферации клеток глиобластомы. Honghai Peng et al. использовали CRISPR/Cas9 для нокаута CHAF1A, что привело к остановке фазы G1 и к апоптозу клеток глиомы (U251 и U87). Ингибирование CHAF1A также блокировало сигнальный путь AKT/FOXO3a /Bim способствующий пролиферации клеток глиобластомы. Этот результат позволил предположить, что CHAF1A может быть новой терапевтической мишенью для улучшения прогноза глиобластомы [50] и, возможно, станет мишенью для лекарств против глиобластомы и прогностическим биомаркером. Li-Na Zhou et al. нокаутировали shRNA Ninjurin2 (с помощью CRISPR/Cas9 редактирования генов) в первичных клетках глиомы человека, это эффективно подавляло выживаемость, рост, пролиферацию, миграцию и инвазию клеток, вызывая активацию апоптоза [65]. Нокаут IGF2BP1, индуцированный CRISPR/Cas9, также активировал передачу сигналов MAGEA6-AMPK, что приводило к апоптозу клеток глиомы (A172) [52].

Клетки естественные киллеры (NK) являются эффективными цитотоксическими эффекторными клетками, которые могут бороться с клетками глиобластомы (GBM), индуцированными опухолевыми клетками. Нокаут TIM3 с помощью CRISPR/Cas9 усилил цитотоксичность NK-клеток человека по отношению к клеткам GBM. Нокаут TIM3 с помощью CRISPR/Cas9 также может стать перспективным методом иммунотерапии для лечения GBM [53]. Белок мембраны вакуолей 1 (VMP1) - важный белок, связанный с аутофагией, который играет роль в генезе и прогрессии опухолей. Редактирование генов CRISPR/Cas9 привело к удалению VMP1, что значительно подавило клеточную пролиферацию, увеличило апоптоз клеток и вызвало остановку клеточного цикла. Нокаут VMP1 блокировал аутофагический поток, тем самым делая клетки глиомы чувствительными к радиотерапии и химиотерапии [54].

Таргетная онкотерапия является нашей общей целью, поскольку методы целенаправленного лечения позволяют более точно воздействовать на опухоль и максимально избежать повреждения нормальных тканей, тем самым улучшая прогноз и качество жизни пациентов [55,66-68]. Xiangpan Li et al. . [40] предложили вычислительные инструменты на основе CRISPR/Cas9 для прогнозирования клинического исхода пациентов с не очень злокачественной глиомой. Они предположили, что CRISPR/Cas9 можно использовать не только для лечения пациентов, но и для отбора пациентов, у которых могут быть лучшие клинические результаты. В последние годы быстро развиваются инструменты направленной терапии на основе CRISPR, включая активацию (CRISPRa) или ингибирование (CRISPRi) генов на основе CRISPR. CRISPRa очень полезен для скрининга усиления функции, в то время как CRISPRi более мощный для скрининга потери функции, чем банк РНК-интерференции (RNAi) [23,69]. Положительный отбор с использованием библиотеки CRISPR может выявить жизнеспособные клетки при определенных условиях, например, при фармацевтических исследованиях опухолевых клеток, и может легко прояснить механизм устойчивости к лекарствам [70]. С другой стороны, отрицательный отбор может эффективно выявлять мертвые клетки или медленно растущие клетки и идентифицировать гены, необходимые для выживания, которые могут быть перспективными кандидатами для молекулярно направленных противоопухолевых препаратов. Кроме того, отрицательный отбор можно применять для комбинированных летальных взаимодействий, при которых возмущение обоих генов приводит к потере жизнеспособности, на которую обычно не влияет один из генов. Этот механизм очень важен для определения оптимального портфеля молекулярных целенаправленных терапий для лечения опухолей [71]. Поскольку TMZ является препаратом первой линии химиотерапии, а мутация ATRX приводит к наиболее распространенной аномальной наследственности в глиомах, Han Bo et al. вызывали нокаут ATRX, чтобы изучить влияние ARTX на резистентность TMZ [72].

Генез опухоли обусловлен различными генетическими изменениями и всегда связан со сложными иммунными реакциями, включающими иммунное уклонение опухолевых клеток и создание иммуносупрессивного микроокружения опухоли [73]. Иммунотерапия опухолей состоит из антител, адоптивной инфузии Т-клеток, вакцин и цитокинов и представляет собой новую стратегию борьбы с раком путем искусственного стимулирования иммунной системы. Она быстро развивается в последние годы, обладает значительным лечебным эффектом при злокачественных кроветворных и солидных опухолях и считается одним из наиболее перспективных методов лечения рака [74]. Однако имеющиеся в настоящее время иммунотерапевтические средства обладают высокой токсичностью и низким уровнем успешности, а в условиях постоянного появления и развития опухолевых клеток и генов опухолевых супрессоров иммунотерапия, пригодная для многоцелевого лечения, ограничена несколькими канцерогенными путями [75,76]. Как специфический инструмент редактирования генов, CRISPR/CAS9 применим для исправления патогенных мутаций с минимальной токсичностью, а также может использоваться в качестве адъюванта для иммунотерапии для достижения более надежного иммунного ответа [77]. Кроме того, одним из наиболее перспективных применений CRISPR/CAS9-опосредованного редактирования генома в иммунотерапии опухолей является производство CAR-T клеток [78,79]. CAR обычно содержит вариабельный фрагмент внеклеточной одиночной нити для идентификации и связывания специфического опухоль-ассоциированного антигена и внутриклеточный химерный сигнальный домен для активации Т-клеток [80]. Использование CRISPR/CAS9 на CD19-специфичных CAR-нацеленного T-cell receptor α constant (TRAC) не только приводит к равномерной экспрессии CAR в Т-лимфоцитах периферической крови человека, но и повышает активность Т-клеток, которая значительно превосходит активность CAR-T-клеток, традиционно получаемых в мышиных моделях острого лимфобластного лейкоза (ALL) [56,81] (рис. 3).



Figure 3. Production of CAR-T Cells. CRISPR/CAS9 was applied in the CD19-specific CAR targeted T-cell receptor α constant (TRAC) loci to result in the uniform CAR expression in human peripheral blood T lymphocytes, and later, the CAR-T cells selectively attacked tumor cells to achieve the treatment effect.

В некоторых исследованиях также использовался CRISPR/Cas9 для нарушения передачи сигналов через PD-1 в первичных Т-клетках человека и создания потенциально "готовых" аллогенных CAR-T клеточных продуктов путем одновременного редактирования сайта TRAC и B2M [75-77]. Иммунный контрольный пункт (КПП), опосредованный PD-1/PD-L1, является одной из перспективных терапевтических мишеней при GBM [82]. В некоторых исследованиях было показано, что передача сигналов PD-1 снижается с помощью CRISPR/Cas9 у мышей с глиобластомой, что повышает эффективность CAR-T терапии [83].

Гомолог 6 B7 (B7-H6) - недавно открытый член семейства ко-стимулирующих молекул B7. Связываясь с NKP30 NK-клеток, B7-H6 может влиять на регуляцию иммунного ответа NK-клеток. В некоторых исследованиях также изучалась иммунотерапия, направленная на стволовые клетки глиомы путем нокаута B7-H6 с помощью редактирования генов CRISPR/Cas9 [57].

Большое количество исследований выявило сложность геномной генетики больных раком. Только несколько генов мутируют с высокой частотой (более 20%), но большинство раковых генов у большинства пациентов имеют частоту мутаций от 2% до 20% или меньше [84,85]. Поскольку основным направлением исследований опухолей является функциональное обоснование изменений генов-кандидатов, связанных с прогрессированием рака и ответом на лечение [58], необходимо разработать более гибкую модель, то есть сложную животную модель, содержащую разнообразные генетические изменения, для использования в доклинических испытаниях с целью ускорения идентификации генов-драйверов опухоли.

Постоянное совершенствование технологии геномной инженерии сделало возможным манипулирование in vivo всеми генами-кандидатами. Сочетание системы RCAS-TVA и инструмента редактирования генов CRISPR/Cas9 позволяет точно создавать модели опухолей человека [59,86], которые могут быть созданы с помощью CRISPR/Cas 9 путем инактивации гена-супрессора опухоли [87,88], соматической точечной мутации [89,90] и сложной перестройки генома [84,85]. Carlson Jeff C et al. создали естественную модель глиомы мыши с иммунной активностью, используя электропорацию in-utero и метод CRISPR/Cas9 для изучения трехмерной динамики сосудистых опухолей во время прогрессии глиомы [58].

Глиобластома является высоко злокачественной среди нейроглиом, с высокой инвазией в ткани и высокой смертностью. Для того чтобы лучше понять процессы инвазии глиобластомы, Prolo Laura M et al. впервые широкомасштабно использовали CRISPR/Cas9 для скрининга потери функции, целью которого был скрининг генов, которые могут способствовать вторжению опухолевых клеток в нормальные ткани, и обнаружили, что MAP4K4 является новой потенциальной мишенью для ограничения инвазии глиобластомы [52].

Поскольку трудно понять механизмы роста и выживания опухолеродной популяции глиобластомы, целенаправленное лечение невозможно. Поэтому в некоторых исследованиях использовали CRISPR/Cas9 в стволовых клетках GBM (GSC) от пациентов для изучения функций кодирующих геномов и определения путей, связанных с ростом туморогенных популяций, чтобы выявить пути, необходимые для генов, связанных с пролиферацией GBM, и лучше понять рост и лекарственную устойчивость GBM [59].

Кроме того, глиобластома является высоко злокачественной опухолью, и в настоящее время только несколько клинических подходов могут эффективно лечить глиобластому. Темозоломид (TMZ) - один из немногих химиотерапевтических препаратов для лечения глиобластомы, который имеет очень ограниченный эффект на поздних стадиях из-за резистентности опухолевых клеток [86,91]. Rocha Clarissa Ribeiro Reily et al. ввели скрининговую библиотеку лентивирусов CRISPR/Cas9 с целым геномом в клеточную линию глиобластомы человека для нокаута или активации генов с целью выявления генов, регулирующих устойчивость клеток глиомы к TMZ. Затем путем скрининга нокаута или активации генов были отобраны несколько генов-кандидатов, на которые могут быть направлены ингибиторы или малые молекулы для ослабления устойчивости глиобластомы к TMZ, некоторые из которых были использованы в клинических условиях [60].

Глиома - одна из самых агрессивных злокачественных опухолей человека, характеризующаяся как высокой заболеваемостью, так и смертностью. В клинической практике она обычно диагностируется как прогрессирующая с очень плохим прогнозом [92-94]. Изучение механизмов генеза и прогрессирования глиомы очень важно для улучшения прогноза больных глиомой [95-97]. Ogawa Junko et al. использовали технологию CRISPR/Cas9 для нацеливания конструкции HRas-IRES-tdTomato путем гомологичной рекомбинации на локус TP53 для наблюдения за инициацией глиомы в органоидах человека [61]. Рецептор ариловых углеводородов (AHR) играет важную роль в поддержании клеточного экологического гомеостаза и патофизиологии. В некоторых исследованиях AHR в глиоме нокаутировали с помощью CRISPR/Cas9, что усилило инвазивность клеток глиомы в модели ксенотрансплантата мыши и повысило экспрессию генов, которые, соответственно, способствовали инвазии или миграции [98]. DAZL является геном зародышевой линии рака, который может способствовать трансформации опухоли и играет важную роль в генезе и прогрессии рака. Нокаут DAZL в клеточной линии глиобластомы с помощью технологии редактирования генов CRISPR/Cas9 показал, что DAZL способствует опухолегенности глиобластомы путем снижения стволовости клеток [14]. Потенциальный патогенез глиомы также может быть изучен с помощью технологии редактирования генов CRISPR/Cas9 путем направленной мутации клеток глиомы. В некоторых исследованиях система CRISPR/Cas9 в сочетании с транспозиционной маркировкой линии piggyBac использовалась для модуляции глиомы, возникающей в результате повреждения нейрального развития и соматической мутации нейрональных предшественников [99]. Tejero Rut et al. сконструировали клетки GBM, полученные от пациентов, с помощью CRISPR/Cas9 с репортером индуцибельного гистона2B-GFP (iH2B-GFP) для отслеживания истории деления клеток и дальнейшего изучения механизма рецидива GBM [63].

Хотя CRISPR/Cas9 широко используется, он все еще имеет некоторые недостатки и нуждается в усовершенствовании.

(1) CRISPR/Cas9 has off-target effects during operation.
CRISPR/Cas9 вызывает эффекты вне мишени во время работы, поскольку специфичность ДНК и РНК не является абсолютной. Подобно siRNA, а специфичность siRNA не абсолютна, и замалчивание генов вне мишени может происходить посредством различных механизмов. Для решения этой проблемы было опубликовано множество методов; обычно считается, что эту проблему можно смягчить, добиваясь согласованных результатов путем целенаправленного воздействия на различные последовательности в конкретных генах с помощью нескольких различных siRNA. Для некоторых биологических проблем система CRISPR-Cas9 может превосходить другие решения. Это связано с тем, что shRNA или siRNA могут влиять на функции клеток, а CRISPR-Cas9 - нет. Что касается вне-целевого эффекта в экспрессии генов [100], то сочетание CRISPR-Cas9 с shRNA (или siRNA) позволяет отличить вне-целевые эффекты от потенциальных механизмов компенсации [101]. Более того, генно-инженерные высокоточные Cas9, гипер-точные Cas9 (HypaCas9), а также Cas9 с повышенной специфичностью (eSpCas9) могут уменьшить вне-целевую активность [102,103].

(2)
CRISPR/Cas9 недостаточно точен, а вызванные инструментом редактирования генома двунитевые разрывы ДНК (DSBS) могут быть восстановлены негомологичным терминальным переходом (NHEJ) и гомологичной рекомбинацией (HR), но отклонение первого пути у человека и других млекопитающих часто приводит к неточной репарации [104]. Cas9 иногда разрезает последовательности ДНК, похожие на те, которые он ищет, но эти последовательности содержат несколько различных оснований, что может привести к новым мутациям.

(3)
Эффективность и безопасность системы CRISPR/Cas9 в организме человека. Если необработанные опухолевые клетки будут расти быстрее, польза от генно-редактирующей терапии будет снижена.

(4)
Опухоль гетерогенна.

Внутричерепной метаболизм сложен и гибок, и опухоли мозга подвержены влиянию метаболизма [105]. Типы глиомы очень многочисленны и разнообразны [106], и у разных пациентов с одной и той же опухолью, а также существуют различия между первичными и рецидивирующими опухолями на разных стадиях развития опухоли у одного и того же пациента [107], и их генные мутации различны, что делает использование CRISPR/Cas9 для направленной генотерапии более сложной задачей.

Традиционный подход к лечению глиомы заключается в хирургическом иссечении в сочетании с радио- и химиотерапией. Он также приводит и к значительному повреждению тканей мозга с поражением, которое может рецидивировать.

Поскольку возникновение и прогрессирование глиомы тесно связаны с полиморфизмом генов, исследования ген-направленной терапии достигли большого прогресса. Направленная на опухоль терапия - это подход к лечению мутаций опухолевых генов на молекулярном уровне, а опухоль-направленная терапия достигается путем блокирования клеточных сигнальных путей, связанных с опухолями. CRISPR/Cas9 - это генотерапия, которая может лечить многие виды заболеваний с помощью технологии сплайсинга ДНК, которая в настоящее время используется в исследованиях по онкотерапии. Например, передача сигналов MAGEA6-AMPK активируется путем нокаута IGF2BP1 с помощью CRISPR/Cas9, что приводит к апоптозу клеток глиомы (A172) и подавляет выживание клеток глиомы человека, что позволяет достичь терапевтического эффекта [108].

В этой статье мы в основном обсуждаем использование CRISPR/Cas9 при глиоме для иммунотерапии, создания модели глиомы, исследования механизмов и поиска целенаправленно действующих препаратов. Платформа CRISPR/Cas9 настолько замечательна, что может стать беспрецедентным технологическим скачком в редактировании генома как для биомедицинских исследований, так и для терапии. Однако CRISPR/Cas-опосредованное редактирование генов связано с терапией химерными антигенными рецепторами Т-клеток (CAR-T), поскольку большинство из них создаются с использованием подходов редактирования ex vivo. К счастью, такие ученые, как Lau CH [109] и Pan YC [110], прилагают активные усилия для разработки стратегий доставки, которые обладают высокой тканевой специфичностью, высокой эффективностью редактирования и, что самое важное, минимальной токсичностью. В настоящее время большинство методов генотерапии глиомы все еще опираются на эксперименты на животных и не нашли широкого применения в клинической практике. Однако с 2015 года было проведено более 30 клинических испытаний с использованием технологии редактирования генома с помощью CRISPR/Cas9, и результаты показывают, что пациенты могут обнаруживать положительные результаты [38]. Предполагается, что в будущем исследования по использованию технологии CRISPR для целенаправленного лечения глиомы продолжат развиваться и будут иметь широкие перспективы применения.