Моногенные врожденные ошибки метаболизма являются актуальными мишенями для генотерапии, поскольку они представляют собой аутосомно-рецессивные заболевания с хорошо изученной патофизиологией и высокоинформативными биохимическими показателями, однако их терапевтическое лечение остается сложным и громоздким. Мочевая болезнь кленового сиропа (MSUD, MIM: 248600) - одно из самых ранних описанных метаболических расстройств. Это аутосомно-рецессивное заболевание с частотой встречаемости один случай на 185 000 живорожденных вызвано дефектом активности фермента дегидрогеназы 2-кетокислот с разветвленной цепью (BCKD), что приводит к накоплению аминокислот с разветвленной цепью (BCAA) лейцина, изолейцина, валина и соответствующих им 2-кетокислот (BCKA) в тканях и жидкостях организма^1,2. Фермент BCKD представляет собой мультимерный ферментный комплекс, состоящий из четырех компонентов: альфа- и бета-субъединиц декарбоксилазы кетокислот с разветвленной цепью (E1_α и E1_β), субъединицы дигидролипоилтрансацилазы (E2) и субъединицы дигидролипоамиддегидрогеназы (E3). MSUD вызывается мутациями в генах BCKDHA, BCKDHB или DBT, соответственно кодирующих субъединицы E1_α, E1_β и E2, которые соответствуют 45, 35 и 20% пациентов с MSUD, соответственно². Нейротоксичность при MSUD связана с накоплением лейцина и 2-кетоизокапроновой кислоты (KIC, кетокислота, получаемая из лейцина)³. В классической тяжелой форме MSUD (85-95% случаев⁴), при остаточной активности фермента менее 3%, это накопление вызывает кому и отек головного мозга вскоре после рождения с ранней смертью в отсутствие агрессивного и быстрого лечения.

Долгосрочное лечение MSUD представляет собой неудовлетворенную клиническую потребность⁴. В настоящее время лечение MSUD ограничивается жестким и пожизненным ограничением BCAA в рационе, связанным с пероральным приемом смеси аминокислот без BCAA. Такое лечение трудно поддерживать в долгосрочной перспективе и в значительной степени несовместимо с нормальным качеством жизни. Кроме того, оно не предотвращает долгосрочные нейрокогнитивные⁵ и психиатрические нарушения⁶, причем последние затрагивают примерно 30% пациентов в возрасте после 20 лет⁶. Orthotopic liver transplantation (OLT), считается как эффективная терапия MSUD, позволяющая снять диетические ограничения, полностью защитить от острых декомпенсаций во время болезни^7,8, остановить прогрессирование нейрокогнитивных нарушений^3,9, предотвратить угрожающий жизни отек головного мозга³, метаболическую и клиническую стабильность⁹. Однако трансплантация печени связана с потенциальным риском смерти и отказов трансплантата⁹. Будучи аутосомно-рецессивным моногенным заболеванием, MSUD представляет собой идеальную мишень для генотерапии, направленной на печень, поскольку клинические данные OLT свидетельствуют о том, что неполное восстановление активности фермента BCKD печени (обеспечивающей 9-13% активности BCKD организма¹⁰) является полностью лечебным. Это является веским основанием для тестирования переноса генов печени в качестве терапевтического метода для MSUD.

Среди доступных платформ доставки генов адено-ассоциированные вирусные (AAV) векторы являются наиболее подходящими для переноса генов печени¹¹. Генотерапия печени с помощью AAV достигла важной вехи, доказав безопасность и долгосрочную эффективность в клинических испытаниях для лечения гемофилии B¹². Врожденные ошибки метаболизма являются хорошими кандидатами для генотерапии AAV¹³. Доказательство эффективности концепции было получено на мышах при нарушениях цикла мочевины^14-17, органических ацидемиях¹⁸, фенилкетонурии¹⁹ и других, и в настоящее время проводятся клинические испытания переноса генов печени при ряде заболеваний, включая дефицит орнитин-транскарбамилазы (OTC) (NCT02991144), болезнь хранения гликогена типа 1a (NCT03517085), мукополисахаридоз типа VI (MPSVI) (NCT03173521) и болезнь Помпе (NCT03533673 и NCT04093349).

Были разработаны и охарактеризованы мышиные модели классического и промежуточного MSUD с мутациями в Dbt^20-22. В то время как большинство пациентов имеют мутации в генах BCKDHA и BCKDHB, не существует охарактеризованной мышиной модели MSUD, связанной с геном Bckdhb, и только одно сообщение о мыши с нокаутом Bckdha с тяжелым фенотипом и летальностью в течение 24 часов после рождения и повышенным содержанием BCAA и BCKA в плазме и тканях²³. Недавно была описана модель мыши с тканеспецифическим нокаутом Bckdha в коричневой жировой ткани, которая показала сниженную толерантность к нагрузке BCAA, но без других фенотипических признаков MSUD²⁴.

Мы подробно описали линию мыши Bckdha-/- и показали, что она точно повторяет классический фенотип MSUD человека. Далее мы разработали успешную генотерапию AAV, основанную на переносе человеческого BCKDHA (hBCKDHA) новорожденным мышам Bckdha-/-

Fig. 1: The Bckdha?/? mouse recapitulates the MSUD phenotype in humans.

a Kaplan-Meier curve (Bckdha-/- n = 15, Bckdha+/- n = 44, Bckdha+/+ n = 26); log-rank Mantel-Cox test (Bckdha-/- vs. Bckdha+/+ or Bckdha+/-, p values = 4.86???10?13 or 2.22 x 10¹⁶, respectively). b Weight (1 week, Bckdha-/- n = 5, Bckdha+/- n = 7, Bckdha+/+ n = 4). c Leucine and alloisoleucine plasma concentrations (3 days, Bckdha-/- n = 3, Bckdha+/- n = 3, Bckdha+/+ n = 2). d Bckdha mRNA and e BCKDHA protein levels in the liver, heart, and brain (1 week, Bckdha-/- n = 3, Bckdha+/- n = 1, Bckdha+/+ n = 1). All data are shown as means ± SD. ****P < 0.0001. Source data are provided as a Source data file.

...

Итак, не было обнаружено существенных различий между двумя конструкциями с учетом роста и выживания, концентрации лейцина в плазме и экспрессии белка BCKDHA в печени (рис. S2). Нельзя исключить незначительную тенденцию к более эффективному спасению с помощью AAV8-hAAT-iEF1α-hBCKDHA, но любой такой эффект находится в пределах межиндивидуальной изменчивости. Эти данные могут свидетельствовать о значительном вкладе непеченочных тканей в активность трансгена BCKDHA во всем организме, ответственного за фенотипическое спасение MSUD у новорожденных мышей, поскольку они показывают, что при эквивалентных дозах вектора лучшее фенотипическое спасение достигается с помощью трансгена AAV8, управляемого EF1α.

MSUD представляет собой неудовлетворенную медицинскую потребность с ограниченными терапевтическими возможностями лечения. Учитывая благоприятное влияние трансплантации печени на выживаемость, качество жизни и биомаркеры заболевания у пациентов с MSUD, мы предположили, что направленная на печень генотерапия может стать реальным терапевтическим подходом. Здесь мы показали, что однократное введение вектора AAV новорожденным мышам с MSUD привело к длительному выживанию животных и устранению фенотипа заболевания.

Поскольку мутации в BCKDHA являются одной из наиболее частых причин MSUD у людей² , первым шагом было создание и характеристика колонии мышей Bckdha-/- Мы показали, что гомозиготные мыши Bckdha-/- в точности повторяют особенности заболевания человека, при этом пораженные животные демонстрируют чрезвычайно высокие концентрации лейцина в плазме крови и раннее начало тяжелого неврологического поражения, приводящего к смерти в возрасте до P12 лет.

Исходя из клинического опыта, гетерозиготные люди, как и мыши Bckdha+/-, проявляют 50% активности фермента BCKD во всем организме и не имеют никаких фенотипических или биохимических отклонений. Это позволяет предположить, что восстановление 50% активности BCKD может полностью излечивать. Однако трансплантация печени у людей восстанавливает приблизительно 10% активности BCKD во всем организме¹⁰ и значительно улучшает фенотип MSUD и метаболические параметры у подавляющего большинства пациентов^4,28. Таким образом, исходя из этих соображений, в контексте генотерапии повышение BCKDH выше 10% от нормы будет достаточным для спасения фенотипа заболевания, в то время как уровни около 50% от нормы полностью исправят MSUD. Появляющиеся данные испытаний генотерапии, направленной на печень, с использованием векторов AAV свидетельствуют о том, что уровни трансдукции, необходимые для спасения MSUD, действительно достижимы, поскольку в некоторых случаях были достигнуты супрафизиологические уровни экспрессии трансгена у больных гемофилией А²⁹, а трансдукция всего тела была зафиксирована у младенцев, страдающих спинальной мышечной атрофией³⁰ и мышечной дистрофией Дюшенна³¹, среди прочих. Одна из проблем опосредованного вектором AAV переноса генов в печень заключается в том, что из-за преимущественно неинтегрирующей природы этих векторов экспрессия трансгенов в быстро делящихся тканях не является стабильной. Это было показано на нескольких доклинических моделях животных^32-34, в которых векторы AAV вводились в то время, когда печень еще не достигла взрослого размера. Это, несомненно, является ограничением в развитии неонатальной гентерапии MSUD, так как раннее лечение, в идеале вскоре после рождения, принесло бы большую пользу пациентам.

Здесь, используя вездесущий промотор EF1α, мы смогли добиться полного и устойчивого фенотипического спасения как клинически, так и биохимически у новорожденных мышей Bckdha-/- мРНК и белок трансгена BCKDHA были обнаружены в печени, мозге и сердце, что отражает широкое распространение трансдукции вектора, введенного в дозе 10¹⁴ vg/кг, что соответствует дозам, испытанным на новорожденных пациентах³⁰. При более низкой дозе вектора 10¹³ vg/кг спасение было частичным и преходящим, что указывает на субтерапевтический уровень экспрессии трансгена. Будущие исследования, направленные на оптимизацию кассеты экспрессии трансгена³⁴, тестирование гибридных промоторов³⁵ и, возможно, тестирование векторов с более широким тропизмом, чем AAV8³¹, помогут снизить порог терапевтической дозы вектора.

Напротив, ограниченный печенью перенос генов с использованием промотора hAAT³⁶ обеспечил частичное, хотя и устойчивое спасение фенотипа MSUD. Действительно, у мышей, которым вводили вектор в дозе 10¹⁴ vg/кг, наблюдался более низкий рост массы тела, концентрация лейцина в плазме была примерно в 4,5-6 раз выше нормы (против 2-х раз при повсеместном подходе). Это позволяет предположить, что отсутствие внепеченочной экспрессии может снижать терапевтическую эффективность, что согласуется с предыдущими результатами нашей лаборатории, показавшими, что мультитканевая экспрессия альфа-кислотной глюкозидазы обеспечивает превосходное спасение болезни Помпе у новорожденных мышей по сравнению с экспрессией трансгена, ограниченного печенью³⁵. Альтернативный, возможно, дополнительный механизм, предложенный анализами активности BCKD, заключается в том, что конструкция hAAT может быть менее активной, чем конструкция EF1α в печени in vivo, хотя предыдущие отчеты показали, что промотор hAAT более мощный, чем EF1α³⁷.

Наши данные о том, что в условиях неонатальной генотерапии долгосрочное избавление от болезни с помощью вездесущего промотора может включать и внепеченочную коррекцию молекулярного дефекта, что согласуются с недавними данными³⁸ , согласно которым, как и у людей, окисление аминокислот с разветвленной цепью происходит в большинстве тканей мыши, включая мышцы, бурый жир, печень, почки и сердце. В соответствии с этим, последние данные свидетельствуют о спасении от болезни в легкой мышиной модели MSUD (промежуточная модель MSUD [iMSUD]) с помощью вектора AAV9, экспрессирующего E2 не только в печени, но и в мышцах в неонатальном возрасте³⁹. Эта модель несет мутацию в субъединице E2 [DBT] BCKDH и имеет более мягкий фенотип, чем классическая форма MSUD, что объясняет, почему она может быть спасена системным введением при отъеме от матери (P21-P28, что соответствует позднему подростковому возрасту у людей). По сравнению с повсеместной экспрессией при самых высоких дозах вектора, специфический перенос генов в печень приводит к длительному выживанию, но более плохому росту и более высоким концентрациям метаболических параметров. Действительно, в мышиной модели, использованной в нашем исследовании, животных пришлось лечить сразу при рождении, чтобы избежать ранней летальности, связанной с MSUD. Как обсуждалось выше, выраженный рост печени в течение первых недель жизни у мышей^32,40 приводит к разбавлению геномов векторов AAV и потере экспрессии трансгенов, что, возможно, объясняет частичную эффективность подхода, специфичного для печени (hAAT). Кроме того, тот факт, что восстановление экспрессии BCKDHA в печени до супрафизиологических уровней не приводит к полной коррекции заболевания, может быть обусловлен и рядом других факторов. К ним относится экспрессия фермента только в подмножестве гепатоцитов. Основываясь на литературных данных⁴¹ и нашем собственном опыте работы с векторами AAV, можно предположить, что при дозах, используемых в данном случае, почти 100% гепатоцитов мыши будут экспрессировать фермент. В крупных моделях животных эффективность трансдукции AAV в печени значительно ниже⁴² , как и ожидается у человека. Отсутствие достаточной экспрессии в других тканях или образование нефункционального и/или неправильно сформированного фермента BCKD в гепатоцитах в результате избыточной экспрессии также могут играть определенную роль. Было показано, что рекомбинантно экспрессированный белок E1 зависит от молекулярных шаперонов для правильного сворачивания и гетеротетрамерной сборки в клетках^26,43,44.

Основываясь на этих наблюдениях и учитывая, что у человека печень достигает почти полного размера к 10 годам⁴⁵ , можно утверждать, что в контексте MSUD и других подобных заболеваний с ранними проявлениями крайне необходимы стратегии достижения долгосрочной эффективности после переноса генов AAV. В качестве альтернативы этому подходу и общей стратегии для достижения долгосрочного спасения педиатрических заболеваний с первичными проявлениями в печени⁴⁶ с помощью направленного на гепатоциты переноса генов следует предусмотреть многократное введение вектора в течение определенного времени. Развитие гуморального иммунитета против введенного вектора после переноса генов⁴⁷ представляет собой одно из наиболее важных ограничений повторного введения вектора^48,49. Последние разработки в области использования иммуносупрессивных агентов для предотвращения образования антител против вектора AAV^50,51, а также использования ферментов, разрушающих IgG⁵² и других методов, направленных на удаление антител^53-55, вероятно, позволят решить проблему нейтрализации антител против AAV. В качестве альтернативы, использование терапии на основе мРНК⁵⁶ может помочь перевести пациентов в возраст, когда печень полностью сформирована и однократная инфузия вектора AAV обеспечит длительный терапевтический эффект.

В заключение мы приводим убедительные доказательства долгосрочной терапевтической эффективности неонатальной генотерапии AAV8 в мышиной модели MSUD, которая приводит к летальному исходу вскоре после рождения. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы точно оценить потенциальный вклад внепеченочных тканей в избавление от болезни в отличие от дозозависимых эффектов в печени. Это исследование представляет интерес для более широкого подмножества генетических заболеваний, характеризующихся ранним, постнатальным началом, для которых экспрессия как в печени, так и в периферических тканях может спасти болезнь в долгосрочной перспективе.