Увеличение количества генов чаще всего используется при аутосомно-рецессивных расстройствах. При этих заболеваниях дефект или отсутствие одной копии гена приводит к потере функции мутации и, следовательно, к недостаточному количеству синтеза белка. При увеличении геннов аномальная копия гена заменяется нормальной копией гена с помощью терапевтических векторов. Терапевтический ген может быть перенесен либо в виде мРНК, либо в виде копии ДНК [7]. ДНК необходимо вводить непосредственно в ядро клетки. Она также увеличивает устойчивое производство белка, поэтому является более предпочтительной. Осложнения при использовании мРНК включают нестабильность молекулы мРНК из-за изменения последовательности внутри нее и индукцию иммунных реакций. Недостатком генной аугментации является то, что она не может быть использована в уже дегенерированной сетчатке. Этот метод был успешно использован для одобренного Управлением по контролю за продуктами и лекарствами США (FDA) испытания фазы 3 препарата Luxturna - генного препарата для лечения врожденного амавроза Лебера, нацеленного на ген RPE65. Ген RPE65 кодирует ретиноидную изомерогидролазу, фермент зрительного цикла, синтезируемый пигментным эпителием сетчатки (RPE) [7,8].

Этот механизм используется при аутосомно-доминантных наследственных заболеваниях. В этом случае мутация является мутацией усиления функции. Заболевание возникает из-за экспрессии нежелательных белков или генных продуктов мутировавшего гена. Цель состоит в том, чтобы предотвратить экспрессию мутировавшего гена и кодирование нежелательного белка. Это может быть либо аллель-специфическим, либо неспецифическим. В аллель-специфическом случае мишенью является только мутировавший аллель. При неспецифическом аллеле мутированный и функциональный аллели глушатся и, путем увеличения количества генов, заменяются нормальным геном. Это может быть сделано на трех уровнях генетического механизма: (1) ДНК, (2) РНК и (3) транскрипция [3].

CRISPR - это кластерные регулярно перемежающиеся короткие палиндромные повторы прокариотической ДНК. Геном вируса следует за каждой повторяющейся последовательностью от предыдущей инфекции, известной как спейсерная ДНК. Cas9 - это CRISPR-ассоциированный белок 9, который специфически разрезает ДНК в этих распознанных сайтах, что приводит к подавлению генов [9]. При использовании для редактирования генома эндонуклеаза Cas9 вместе с направляющей РНК вводится в ядро клеток-мишеней. РНК-направляемая эндонуклеаза разрезает двухцепочечную ДНК в целевых местах, активируя систему репарации ДНК [3]. Этот метод был использован в терапии аутосомно-доминантного RP [10].

Другие методы редактирования генома на основе ДНК - это нуклеазы с эффекторами, подобными активаторам транскрипции (TALEN), и нуклеазы с цинковыми пальчиками (ZFN) [11]. В настоящее время проводятся клинические испытания по лечению синдрома приобретенного иммунодефицита с помощью метода редактирования генома ZFN, направленного на ген C-C хемокинового рецептора типа 5 (ген CCR5) CD4+T-клеток (T helper cells). CCR5 присутствует на поверхности этих клеток и действует как корецептор для вируса иммунодефицита человека. В данном исследовании ген CCR5 был подавлен путем редактирования генома с помощью метода ZFN [12].

Эти методы работают либо путем удаления молекул мРНК, либо путем предотвращения их трансляции.

РНК-интерференция (RNAi) - это метод пост-транскрипционного замалчивания генов, который использует специфические последовательности siRNA для расщепления целевой РНК. Путь RNAi начинается с расщепления длинных фрагментов dsRNA до малой интерферирующей РНК ферментом эндорибонуклеазой Dicer. Этот этап можно пропустить, непосредственно вводя siRNA в цитоплазму клетки-мишени. Попадая в цитоплазму, siRNA включается в белковый комплекс, называемый комплексом РНК-индуцированного сайленсинга (RISC). Двуцепочечная siRNA расщепляется на смысловую и анти-смысловую нити. Анти-смысловая нить направляет RISC к целевой мРНК и расщепляет ее, предотвращая экспрессию гена. В настоящее время РНК-интерференция проходит испытания для лечения возрастной макулярной дегенерации, глаукомы, RP и диабетической ретинопатии [3,13].

Это комплементарная нить целевой молекулы мРНК. Она подавляет экспрессию генов двумя механизмами. Анти-смысловой олигонуклеотид связывается с целевой мРНК и образует комплекс. Комплекс мРНК и анти-смыслового олигонуклеотида расщепляется под действием активности RNaseH1. Другой механизм действует путем ингибирования трансляции, предотвращения сплайсинга экзонов, capping 5'мРНК или дестабилизации РНК. В настоящее время анти-смысловые олигонуклеотиды проходят испытания для глазной генотерапии врожденного амавроза Лебера, действуя на ген CEP290. Этот ген кодирует центросомальный белок 290 [14,15].

Characteristics of the vectors are summarized in Table 1 .

Characteristics of viral vectors

AV: adenovirus, AAV: adeno-associated virus, LV: lentivirus Modified from references [18,19]

Проводятся несколько клинических испытаний по генотерапии зрительных нарушений от болезней сетчатки до болезней роговицы [20]. Table 2 суммирует некоторые клинические испытания.

Table 2: Ongoing clinical trials for ocular gene therapy

VEGFA: vascular endothelial growth factor-A, AMD: age-related macular degeneration, DR: diabetic retinopathy, rAAV: recombinant adeno associated virus, RP: retinitis pigmentosa, IDLV: integration-deficient lentiviral vector [20]

LCA - это аутосомно-рецессивное заболевание, возникающее в детском возрасте и приводящее к потере зрения. Оно возникает из-за мутации нескольких генов, особенно RPE65, кодирующего ретиноидную изомерогидролазу, которая преимущественно экспрессируется в пигментном эпителии сетчатки. Эта мутация приводит к дефициту фермента ретиноидной изомеразы, который отвечает за образование хромофора. Хромофор образует зрительные пигменты в фоторецепторах сетчатки. Это приводит к нарушению зрения [18].

Первой глазной генотерапией, одобренной FDA, стало испытание фазы 3 субретинальной инъекции Luxturna для лечения LCA на обоих глазах. Генным продуктом был AAV2-hRPE65v2 (voretigene neparvovec-rzyl), а вектором - адено-ассоциированный вирус 2 (NCT00999609) [21]. Критерии включения состояли в том, что участники должны были быть старше трех лет, иметь диагностированный случай ЛКА с мутацией RPE65, остроту зрения менее 20/60 на оба глаза с максимально возможной коррекцией. Испытуемые должны быть оценены с помощью теста на подвижность многолучевой яркости (MLMT). Наиболее важными критериями включения было наличие жизнеспособных клеток сетчатки, определяемых с помощью оптической когерентной томографии (ОКТ). Результат оценивался с помощью MLMT, который используется для измерения функциональных изменений зрения. Оценка MLMT варьировалась от 0 до 6, при этом шесть баллов - это когда испытуемый мог пройти MLMT при низкой интенсивности света. Изменение показателя MLMT - это разница между исходным показателем и показателем, полученным через год. Другими показателями результата испытания были пороговое тестирование светочувствительности в полном поле и острота зрения. Результаты исследования показали, что показатель изменения MLMT в группе вмешательства составил 1,8 по сравнению с контрольной группой, в которой показатель изменения MLMT составил 0,2. Это свидетельствовало об улучшении функционального зрения благодаря заместительной генотерапии Voretiegene Neparvovec [8]. Неблагоприятный эффект был описан в Table 3.

Table 3: Adverse effects of voretiegene neparvovec gene replacement therapy [8]

Единственными серьезными осложнениями были судороги у одного участника из 20 с предшествующим судорожным расстройством и побочные реакции на лекарственные препараты у участника с осложненной хирургической операцией в полости рта и предшествующим судорожным расстройством. Улучшение зрительных функций сохранялось в течение более трех лет. Однако долговечность вмешательства до сих пор не определена [8]. Другие клинические испытания LCA упомянуты в таблице 4.

Table 4: Ongoing clinical trials for Lebers congenital amaurosis
RPE65: encodes protein retinoid isomerohydrolase, CEP290: encodes centrosomal protein 290 [20]

RP - это группа заболеваний, которые вызывают прогрессирующую дистрофию сетчатки и потерю зрения. Это одна из самых распространенных причин потери зрения. Один из каждых 4000 человек в мире страдает от RP. RP может быть аутосомно-доминантным, аутосомно-рецессивным или Х-сцепленным. Аутосомно-рецессивная форма является наиболее распространенной. Установлено, что в развитии пигментного ретинита участвуют более 70 генов [18].

Клиническое испытание (NCT03326336) является самым передовым из проводимых клинических испытаний по лечению поздних стадий пигментного ретинита, сочетающим генотерапию, инженерию и механику. Она не нацелена на мутировавшие фоторецепторы; таким образом, остается независимой от мутации. Она направлена на ганглиозные клетки сетчатки, минуя остальные пути. В ганглиозные клетки вводят оптогенетический вектор AAV2.7m8, который кодирует светочувствительные белки CrimsonR и tdTomato. Этот трансгенный вектор вводится посредством одной интравитреальной (в стекловидное тело) инъекции, после чего используются сконструированные очки GS030MD, которые воспринимают световые изменения вблизи себя и проецируют их на генетически модифицированные ганглиозные клетки. Целью данного клинического испытания была проверка безопасности генного продукта и восстановления зрения. В ходе клинического испытания было отмечено частичное восстановление зрения у одного из 15 участников. После генотерапии участник, используя свет-стимулирующие очки, мог воспринимать и определять местоположение объектов. Терапия переносилась хорошо, не было отмечено внутриглазного воспаления или других изменений. Это указывает на то, что оптогенетическая генотерапия вместе со свет-стимулирующими очками может быть использована для частичного восстановления зрения при прогрессирующем RP [22,23].

Ген RHO (родопсин) ответственен примерно за 25% всех случаев аутосомно-доминантного пигментного ретинита (ADRP). Ген RHO транскрибирует белок RHO. Белок RHO - это зрительный пигмент, присутствующий в наружных сегментах палочек. При ADRP возможны два клинических сценария. При классе А наблюдается ранняя презентация с тяжелой прогрессирующей потерей палочек. Основной целью терапии здесь является сохранение функций колбочек. В классе В наблюдается медленное прогрессирование, и функции палочек хорошо сохранены. Здесь основной целью терапии будет сохранение палочек. Наиболее распространенной мутацией в гене RHO является замена пролина на гистидин в 23-й позиции (P23H) [10]. Текущее клиническое исследование NCT04123626 направлено на мутацию P23H гена RHO. Используемый здесь генный продукт - QR-1123. Это анти-смысловой олигонуклеотид, представляющий собой молекулу ssDNA, комплементарную целевой мРНК P23H, которая увеличивает экспрессию дикого типа белка RHO в фоторецепторах [24].

Ещё одним из генов, участвующих в патогенезе RP, является ген тирозинкиназы MER (MERTK). Фоторецепторы в эпителии сетчатки перерабатывают свои наружные сегменты. Выброшенные наружные сегменты фоторецепторов фагоцитируются MERTK [25]. В рамках текущего клинического исследования MERTK-ассоциированного RP (NCT01482195) проводится одностороннее субретинальное введение rAAV, кодирующего белок MERTK. Целью этого испытания была оценка безопасности генного продукта rAaV2-VMD2-hMERTK. Полученные данные показали, что у трех из шести участников наблюдалось улучшение зрения, которое продолжалось в течение двух лет у двух из этих участников. Неблагоприятные эффекты этого клинического испытания обобщены в таблице 5. За исключением этих побочных эффектов, клиническое исследование было признано безопасным.

Table 5: Adverse effects of gene product rAaV2-VMD2-hMERTK [26]

Возрастная макулярная дегенерация является одной из наиболее распространенных причин необратимой слепоты. Она состоит из двух фаз: (1) сухой или не-неоваскулярной и (2) влажной или неоваскулярной. Во время неоваскулярной фазы происходит атрофия клеток сетчатки в виде участков, называемая географической атрофией, что приводит к потере центрального зрения. Во время неоваскулярной фазы происходит образование новых кровеносных сосудов, исходящих из хороида в субретинальное пространство. Эти сосуды вызывают утечку жидкости в субретинальное пространство, поскольку в них отсутствуют плотные соединения. Субретинальное пространство заполняется жидкостью, что приводит к отеку и обратимой потере зрения. Однако если скопление жидкости продолжается в течение нескольких месяцев, это может привести к необратимой потере зрения [27]. Сосудистый эндотелиальный фактор роста отвечает за пролиферацию новых сосудов. Поэтому в настоящее время стандартной терапией неоваскулярной макулярной дегенерации является интравитреальное введение анти-VEGF агентов. Однако, учитывая экономическое и социальное бремя, которое несет эта терапия из-за повторных интравитреальных инъекций, осложнений, высокой стоимости лекарств и повторной визуализации, возникла необходимость в глазной генотерапии для устойчивой доставки лекарств [28]. вжэ Современные клинические испытания осуществляются двумя способами: или с помощью замедленного высвобождения анти-ангиогенных факторов или с помощью генов, замалчивающих факторы, вызывающие избыточную экспрессию VEGF [29] ( Table 6).

Table 6: Clinical trials for age-related macular degeneration [20]

Первое клиническое испытание для лечения неоваскулярной возрастной макулярной дегенерации было проведено путем воздействия на ген белка пигментного эпителия (PEDF). Номер NCT этого клинического испытания - NCT00109499 [30]. PEDF обычно присутствует в глазу и действует как фактор анти-ангиогенеза. Его уровень изменяется при неоваскулярной макулярной дегенерации. Трансген был доставлен интравитреальным путем в виде AAV2, экспрессирующего PEGF. Побочные эффекты наблюдались у 25% пациентов и ограничились легким воспалением глаз и незначительным повышением внутриглазного давления, которые легко поддавались лечению. Результаты этого исследования зависели от дозы. В когортах, получавших дозу в 108 единиц частиц, не наблюдалось увеличения поражения и значительного снижения неоваскуляризации. В то время как в когортах, получавших дозу менее 108, наблюдалось увеличение размера поражений на одну дисковую область через 12 месяцев. Это говорит о том, что такой перенос глазных генов является осуществимым подходом и необходимо провести дальнейшие исследования [31].

Афлиберцепт - это анти-VEGF фактор, который действует как рецептор для VEGF-A, VEGF-B и плацентарных факторов роста, предотвращая неоваскуляризацию. Афлиберцепт представляет собой слитый белок, кодируемый разными генами [29]. В клиническом исследовании (NCT03748784) изучалась безопасность и эффективность генного продукта ADVM-022, отвечающего за устойчивое высвобождение афлиберцепта. В качестве вектора использовался AAV-2, вводимый интравитреальным путем. По истечении 34 недель ADVM-022 хорошо переносился. Наблюдалось лишь легкое воспаление глаз, которое устранялось стероидными глазными каплями. Последовательные улучшения наблюдались на OCT, и пациенты сохраняли зрение на протяжении всего периода [32].

Эндостатин и ангиостатин ингибируют ангиогенез эндогенно. Клиническое исследование (NCT01301443) - это исследование по увеличению дозы для определения безопасности и эффективности лентивирусного вектора, вводимого субретинально для устойчивой экспрессии эндостатина и ангиостатина [33]. Процедура вызвала макулярное отверстие у одного из участников. Однако остальные перенесли ее очень хорошо. У восьми участников наблюдалась устойчивая экспрессия ангиостатина и эндостатина в течение 2,5 лет, а у двух участников - в течение четырех лет [29,34].

FLT-1 - это ген рецептора, который эндогенно ингибирует VEGF-A, предотвращая ангиогенез. В настоящее время существует два клинических испытания, посвященных sFLT-1, доставляемому вирусным вектором.

В клиническом испытании (NCT01494805) с помощью вектора AAV2 субретинально доставляется rAAV.sFlt-1, который кодирует FLT-1 естественного происхождения. Особых побочных эффектов не наблюдалось. Было установлено, что препарат безопасен и хорошо переносится, особенно гериатрической популяцией, и может помочь снизить частоту инъекций анти-VEGF. Однако значительного улучшения остроты зрения или других показателей не наблюдалось [28,35].

В другом клиническом исследовании (NCT01024998) AAV2-sFLT01 доставлялся с помощью вектора AAV-2 интравитреальным путем. Вирусный вектор кодировал слитый белок второго домена sFLT-1 и Fc-домена иммуноглобулина G1. Это было исследование по увеличению дозы, которое показало, что генный продукт хорошо переносится при всех дозах. Было отмечено, что у 5 из 10 участников, которым вводили более высокие дозы, уровень sFLT-1 был обнаружен. Участники, которые не экспрессировали sFLT-1, имели титр антител 1:400 против вектора AAV-2. В клинических испытаниях не было отмечено улучшения остроты зрения или толщины сетчатки [28,29,36].

Одним из основных недостатков глазной генотерапии является воспаление. Глаз считается местом иммунной привилегии из-за различных факторов, таких как гемато-ретинальный барьер. Однако иммуногенность вирусных векторов, их капсидов, трансгена и продукта трансгена как инородного тела может активировать иммунный ответ. На выраженность иммунного ответа влияют различные факторы, такие как используемые вирусные векторы, способ введения, доза вируса и некоторые другие [37].

AV в настоящее время используется только для генотерапии ретинобластомы, поскольку он обладает высокой иммуногенностью. Он вызывает сильное воспаление и разрушение трансдуцированной клетки. Будучи двухцепочечным вирусом, он прочно связывается с TLR9 и активирует более сильный иммунный ответ.

AAV имеет несколько серотипов, которые обладают разным уровнем иммуногенности. Большинство населения обычно имеет уже существующие антитела против AAV2, а небольшая часть населения имеет антитела против AAV8. Однако перекрестная реактивность между серотипами возможна. AAVs вызывают только благоприятный иммунный ответ, поэтому они являются предпочтительным вектором для глазной генной терапии [37].

LV вызывает более сильный иммунный ответ, чем адено-ассоциированный вирус, но он предпочтительнее, когда требуется трансдуцировать больше генетического материала [18,38].

Различные пути введения подвергают вектор различному системному и местному биораспределению. Наиболее часто используется путь введения в стекловидное тело (интравитреальный), но при этом наблюдается более высокий иммунный ответ. Это связано с тем, что вирусные частицы из стекловидного тела через канал Шлемма попадают в системную циркуляцию и лимфатический поток и могут активировать иммунный ответ. Субретинальное пространство является относительно иммунопривилегированным и демонстрирует очень слабый иммунный ответ [37].

По данным Timmers et al., связь между дозой вируса и глазным воспалением зависит от места воспаления. В передней камере увеличение дозы не показало никакого эффекта. Однако в витреальной камере увеличение дозы показало большую степень иммунного ответа [39].

Основой генной терапии является замена или инактивация дефектного гена или введение генного продукта, который может предотвратить процесс заболевания. Глазная генотерапия, в частности, оказалась перспективным инструментом для лечения многих наследственных заболеваний сетчатки, таких как RP, LCA, хориодеремия, болезнь Штаргардта, и приобретенных заболеваний, таких как nAMD, глаукома и диабетическая ретинопатия. В настоящее время проводится несколько клинических испытаний, которые, хотя и находятся на ранних стадиях, показали многообещающие результаты. Цель любого клинического испытания - оценить безопасность и эффективность генного продукта. Когда речь идет о безопасности глазной генотерапии, следует обратить внимание на воспаление. Есть несколько факторов, которые влияют на него, например, используемые векторы, способ введения и доза генного продукта. Субретинальный путь вызывает более слабый иммунный ответ по сравнению с интравитреальным путем. В настоящее время предпочтение отдается AAVs, хотя следует рассмотреть и более новые вирусные векторы. Поскольку мы уже знаем, какие факторы влияют на него, необходимо разработать векторы и методы доставки для предотвращения глазного воспаления. Факторами, влияющими на выбор вектора, являются иммуногенность, размер, количество генетического материала, который он может нести, и неблагоприятные эффекты, которые он вызывает, если таковые имеются. Существует несколько вопросов без ответа, когда речь заходит об устойчивости глазной генотерапии. Мы до сих пор не знаем, как долго продлится эффект генотерапии, какие факторы будут влиять на него и как на них можно воздействовать. Еще один вопрос, требующий решения, - это долгосрочные неблагоприятные последствия генотерапии.

Cуществует несколько генов-мишеней, когда речь идет о nAMD. Можно разработать комбинированный подход с использованием нескольких генов-мишеней для таких заболеваний. Для достижения положительного результата в этом случае необходимо провести тщательное изучение молекулярной генетики заболевания. Хотя глазная генная терапия достигла значительного прогресса в лечении заболеваний сетчатки, генная терапия других глазных заболеваний, таких как увеит, отторжение роговичного трансплантата и генетические дистрофии роговицы, требует решения. Окулярная генотерапия - это новая и перспективная область, которая может изменить траекторию лечения глазных заболеваний в будущем.