Талассемия - это наследственное гематологическое заболевание, которое имеет типичный аутосомно-рецессивный характер наследования [1]. Приблизительно 4,4 из каждых 10 000 живорожденных страдают α- или β-талассемией, что составляет 1,7% населения мира [2,3]. Этот синдром считается опасным для жизни заболеванием в развивающихся странах, где отсутствие ранней диагностики и генетического консультирования способствовало широкому распространению заболевания среди населения [4,5]. α-Талассемия распространена в популяциях Африки и Юго-Восточной Азии, в то время как β-талассемия распространена в странах Средиземноморья, Юго-Восточной Азии, Ближнего Востока, Африки и Южной Америки [6,7]. Эпидемиология талассемии постоянно меняется в связи с миграционными процессами и межрасовыми браками, что приводит к распространению заболевания в регионах, где ранее его не было. Широкое распространение заболевания стало глобальной проблемой здравоохранения и требует новых инновационных методов лечения, которые помогут замедлить его распространение [4].

β-Талассемия классифицируется как талассемия major, minor и intermedia на основании зиготности мутаций гена β-глобина (HBB). Гомозиготная мутация (β⁰) характеризуется полным отсутствием цепей b-глобина, вызывая большую талассемию или Cooley's анемию [8]. Анемия Cooley's является наиболее тяжелой формой талассемии. Она характеризуется наследованием двух копий дефектного гена β-глобина, что необходимо для возникновения тяжелых клинических признаков заболевания [9]. Дети, наследующие гомозиготные мутации, здоровы при рождении, но основные симптомы заболевания обычно проявляются только через 6 месяцев жизни. На этом этапе развития изменения в транскрипционной регуляции и ремоделировании хроматина вызывают переключение гемоглобина с фетального на взрослый, что приводит к подавлению генов фетального глобина [8,10]. Таким образом, клинические проявления гомозиготных мутаций в HBB становятся очевидными только после завершения процесса переключения [11]. У пациентов с тяжелой формой заболевания отсутствие β-глобина приводит к накоплению непарных цепей β-глобина. Избыток α-глобина агрегирует, образуя преципитаты в эритроидных клетках-предшественниках, повреждая клеточную мембрану и способствуя апоптозу эритроидных клеток-предшественников (неэффективный эритропоэз) [12]. Таким образом, у людей с β-Thalassemia major наблюдается тяжелая анемия, и им приходится переливать кровь в течение всей жизни.

Гетерозиготная мутация (β⁺) вызывает минорную талассемию, что приводит к бессимптомной анемии со слабой или умеренной микроцитарной анемией. Пациенты, чья клиническая тяжесть находится между талассемией большой и талассемией малой, классифицируются как промежуточная талассемия [13]. Талассемия интермедиа генотипически гетерогенна [11]. Большинство пациентов с промежуточной талассемией являются гомозиготами или сложными гетерозиготами по β-талассемии [9]. В некоторых случаях поражается только один локус β-глобина, в то время как другие локусы полностью нормальны, что приводит к доминантно наследуемой промежуточной талассемии [14,15]. Клинически пациенты с промежуточной талассемией обнаруживают легкую анемию и не нуждаются в пожизненном переливании крови или хелатной терапии [16,17]. Иногда пациенты с талассемией интермедиа подвергаются переливаниям крови, но реже, чем лица с большой формой β-талассемии [11,16].

По последним данным, ежегодно с β-талассемией рождается ~600 000 детей с её симптомами, и приблизительно 80-90 миллионов человек в мире являются носителями этого заболевания [9]. Люди с β-талассемией испытывают серьезные клинические, экономические, психологические и социальные проблемы на протяжении всей своей жизни, поскольку характер стандартных методов лечения тяжелых и умеренных форм талассемии накладывает тяжелое экономическое и психосоциальное бремя на этих пациентов и их семьи [16,18]. Стандартные варианты лечения, широко используемые для лечения β-талассемии, включают переливание крови и хелатную терапию железом [19,20]. Несмотря на широкое клиническое применение, эти методы имеют существенные ограничения и проблемы. Например, повторные переливания крови могут привести к перегрузке железом с опасными для жизни осложнениями, такими как сердечная недостаточность, эндокринная дисфункция и заболевания печени. Напротив, отсутствие адекватного переливания крови приводит к сокращению продолжительности жизни пациентов с трансфузионно-зависимой талассемией (TDT). Таким образом, существует настоятельная необходимость в разработке и тестировании новых терапевтических подходов, которые обещают стать одноразовой терапией для полного излечения заболевания, улучшения выживаемости и качества жизни пациентов с β-талассемией [19,21].

Последние достижения в понимании патофизиологии β-талассемии способствовали разработке новых терапевтических стратегий для этого заболевания. Были разработаны новые подходы к коррекции дисбаланса α- и β-глобиновых цепей для решения проблемы неэффективного эритропоэза и хронической перегрузки железом [19]. Например, фармакологические соединения, такие как гидроксимочевина, которая действует на несколько сигнальных путей для снижения метилирования ДНК в промоторных областях генов γ-глобина для увеличения экспрессии γ-глобина, рекомендуются для лечения β-талассемии. Повышение уровня γ-глобина способствует выработке фетального гемоглобина (HbF) и облегчает тяжесть заболевания, снижая потребность в частых переливаниях крови [22-24]. Более того, гидроксимочевина повышает общий уровень гемоглобина у пациентов и зарекомендовала себя как подходящая стратегия некурабельного лечения при β-талассемии. Гидроксимочевина эффективна при лечении промежуточной формы талассемии, а ее эффективность при лечении большой талассемии еще предстоит подтвердить с помощью рандомизированных клинических исследований [25-27]. Кроме того, рекомбинантный слитый белок Luspatercept (ACE-536), Sotatercept (ACE-011) и соединения, ингибирующие hepcidin и ferroportin , являются одними из новых фармакологических стратегий, направленных на неэффективный эритропоэз для облегчения клинических проявлений заболевания [28-30].

Аллогенная трансплантация гемопоэтических стволовых клеток (HSCT) была единственным эффективным и потенциально излечивающим методом терапии основной формы β-талассемии в течение нескольких десятилетий. При HSCT аллогенные стволовые клетки используются в качестве векторов для коррекции генетических дефектов при β-талассемии путем введения необходимых для нормального кроветворения генов HBB дикого типа [31]. Однако доступ к этой терапии ограничен из-за отсутствия подходящих по антигену лейкоцитов человека (HLA) доноров. После проведения HSCT у пациентов могут развиться долгосрочные серьезные осложнения, включая иммуно-опосредованные заболевания, эндокринные нарушения и нарушение функций легких и дыхательных путей [32-35]. Спленэктомия - еще один метод лечения, который проводится для снижения потребности в переливании крови у пациентов с основной талассемией. Однако она связана с такими неблагоприятными последствиями, как сердечная недостаточность, замедление роста и полового развития, а также повышенная восприимчивость к инфекциям [36].

За последние несколько десятилетий было приложено много усилий для разработки одноразовых лечебных терапевтических подходов для лечения β-талассемии, когда пациент не нуждается в дальнейшем лечении после завершения одного курса лечения. Подходы генотерапии для лечения β-талассемии привлекли значительное внимание как реалистичный и эффективный терапевтический подход для достижения устойчивой, стабильной и высокоуровневой экспрессии функциональных глобиновых генов у пациентов с TDT без смертности и тяжелых иммунологических осложнений, таких как отторжение трансплантата и клональное доминирование [9,34,37,38].

Современные подходы генотерапии предлагают большие терапевтические перспективы с наиболее значительными клиническими результатами при наследственных или приобретенных заболеваниях, включая рак, вирусные инфекции и рецессивные генетические нарушения, такие как талассемия, серповидно-клеточная анемия, муковисцидоз и гемофилия [39,40]. Целью этой методики является исправление дефектных генов путем введения функционального генетического материала в клетки для получения длительного терапевтического эффекта. Стратегии генотерапии можно разделить на две основные категории в зависимости от способа доставки генов, а именно: доставка генов ex vivo и in vivo. Генотерапия ex vivo - это новый подход, который предполагает забор клеток у пациента, их генетическую модификацию в лаборатории и трансплантацию измененных клеток в ткани-мишени. Этот метод имеет большое преимущество перед методом доставки генов in vivo благодаря возможности полностью охарактеризовать и устранить вредные свойства измененных клеток до трансплантации [41]. Пересаженные генетически модифицированные клетки участвуют в секреции и распространении целевых белков в окружающую среду [42]. В отличие от этого, при стратегии in vivo ДНК доставляется непосредственно в резидентные клетки ткани-мишени, обычно с помощью вирусного вектора [40]. Вирусные векторы с дефицитом репликации (например, аденовирусы, аденовирусные ассоциированные вирусы, ретровирусы и лентивирусы) могут функционировать как средства доставки генов для введения генетического материала в клетки-мишени, такие как зародышевые и соматические клетки [43]. В настоящее время эта технология широко применяется в клинических испытаниях для лечения наследственных и приобретенных заболеваний [42].

Вирусные векторы служат популярным методом доставки генов при β-талассемии. Например, лентивирусы были разработаны как отличные кандидаты в векторы для эффективной передачи HBB в моделях человека и животных. В многочисленных моделях мышей и приматов с большой [44] и промежуточной формой [44] талассемии лентивирусный перенос гена β-глобина приводит к уменьшению анемии и последующего повреждения органов, что делает рекомбинантные лентивирусы одной из наиболее эффективных векторных систем для генотерапии β-талассемии [45,46]. Лентивирусные векторы считаются удачным приложением для клинических испытаний благодаря их способности эффективно трансдуцировать клетки, такие как CD34+, которые подвергаются ограниченной пролиферации, а также неделящиеся клетки с повышенной геномной стабильностью [46,47]. В 2006 году было начато клиническое исследование на человеке (исследование LG001) с использованием лентивирусных векторов для лечения β-гемоглобинопатий [47,48]. Лентивирусный вектор 35 HPV569 был использован для переноса гена β-глобина, включающего контрольную область локуса β-глобина (LCR), которая регулирует экспрессию гена β-глобина в аутологичные гемопоэтические стволовые клетки пациентов с β-талассемией [48]. Эта терапия была клинически успешной и устранила потребность в длительном переливании крови через 1 год и сохранялась в течение почти 8 лет. Общий уровень гемоглобина поддерживался на стабильном уровне около 8 g/dL спустя 2-8 лет после лечения. Кроме того, при переливании не было зарегистрировано не-гематологических или связанных с препаратом нежелательных явлений [49].

Недавнее комплексное исследование подтвердило жизнеспособность генотерапии лентиглобином BB305, которая переносит ген βA-T87Q-глобина, кодирующий T87Q аминокислотную замену HbA, в аутологичные CD34+ HSPC. Затем модифицированные ex vivo клетки вливаются обратно пациентам с тяжелой формой талассемии для обеспечения устойчивой экспрессии модифицированного глобина [48,50]. Betibeglogene autotemcel (ZYNTEGLO™), разработанный компанией Bluebird Bio, классифицируется как передовой терапевтический лекарственный препарат (ATMP) и считается первой утвержденной генотерапией, произведенной с использованием лентиглобина BB305 для лечения TDT [51]. Согласно отчету Комитета по оценке рисков Фармаконадзора (PRAC), представленному Европейским агентством по лекарственным средствам (EMA), в июне 2019 года ZYNTEGLO™ получил условное одобрение Европейского союза (ЕС) для клинического лечения пациентов с β-талассемией в возрасте 12 лет и старше, страдающих TDT или не имеющих генотип β0/β0 [52,53]. В клинических исследованиях в рамках исследования North Star на фазах HGB-204, HGB-205, HGB-207 и HGB-212 приняли участие 63 пациента (исследования HGB 207 и HGB 212 все еще продолжаются), в то время как в настоящее время проводится оценка протоколов последующей безопасности для обеспечения долгосрочной стабильности и целостности терапии (исследование LTF-303) [54,55]. ZYNTEGLO™ считается одноразовым генетическим лечением, которое вводит функциональные, сконструированные копии генов β-глобина (βA-T87Q) путем трансдукции аутологичных гемопоэтических стволовых клеток репликационно-некомпетентным, самоинактивирующимся лентивирусным вектором BB305 [56]. Дозировка ZYNTEGLO™ определяется в зависимости от массы тела человека, а введение осуществляется преимущественно путем внутривенной инъекции. Подготовительные клинические исследования продемонстрировали, что модифицированный β-глобин вырабатывается в значительных количествах для поддержания нормального уровня гемоглобина взрослых пациентов, что, возможно, устраняет необходимость в переливании эритроцитов. Европейская комиссия (EC) определила этот препарат для лечения средней и тяжелой формы β-талассемии в качестве orphan фармацевтического продукта. Управление по контролю за продуктами и лекарствами США (FDA) также предоставило ZYNTEGLO™ статус orphan препарата для лечения TDT [53].

Хотя лентивирусные векторы относятся к платформе вирусных векторов на основе РНК, они могут быть модифицированы для уменьшения их патогенности. В настоящее время проводятся клинические исследования для оценки возможного применения лентивирусных векторов третьего поколения и их инженерии для эффективного переноса генетического материала в клетки-мишени при сохранении долгосрочной стабильной экспрессии [57]. Инженерия само-инактивирующихся лентивирусных векторов проявляется в удалении вирусных длинных терминальных повторов, что приводит к увеличению грузовой емкости, которая может вмещать измененный целевой ген и его регуляторные элементы для усиления экспрессии трансгена [44]. Более того, не-клинические исследования на мышиных моделях выявили незначительные угрозы генотоксического эффекта из-за трансактивации генетических элементов после переноса лентивирусных векторов, несущих ген человеческого β-глобина [58]. Однако, согласно руководящим принципам, принятым такими регулирующими органами, как FDA и EMA, для безопасности и эффективности генотерапии лентиглобином необходимо тщательное изучение определенных параметров, таких как токсичность вектора и стабильная интеграция [59]. В феврале 2021 года появились опасения после оценки пациента, получившего генную терапию лентиглобином, у которого была диагностирована острая миелоидная лейкемия (AML) [60]. Хотя имеющиеся данные не указывают на инсерционный мутагенез и риск образования опухоли при генотерапии ZYNTEGLO™, PRAC рекомендует частое (не реже одного раза в год) наблюдение за пациентами на предмет неблагоприятных состояний, таких как миелодисплазия, лейкемия или лимфома [55].

Хотя вирусные методы доставки генов позволяют достичь более высокой эффективности трансфекции, их применение ограничено из-за проблем безопасности и токсичности. Например, иммуногенность вектора, возможность онкогенной трансформации и внезапная смерть реципиентов привели к замене лечения на основе вирусных векторов альтернативными стратегиями генотерапии [61,62]. Появление инструмента для редактирования генома Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-associated protein 9 (CRISPR/Cas9) предлагает осуществимый и элегантный вариант редактирования генов, позволяющий безопасным и эффективным образом вносить желаемые генные модификации, снимая некоторые трудности, связанные с традиционной генной терапией [63]. Недавно предварительные результаты клинического испытания CRISPR-фазы-1 возродили надежду на возможное прорывное одноразовое лечение β-талассемии [64].

CRISPR - это прорывная технология редактирования генома с помощью РНК в 21 веке, которая открывает большие терапевтические перспективы против наследственных заболеваний крови [21]. CRISPR-опосредованные адаптивные иммунные системы были впервые обнаружены у бактерий, которые обеспечивают защиту от вторжения чужеродных генетических элементов [65-68]. Бактериальный геном содержит короткие повторяющиеся последовательности, известные как массивы CRISPR, разделенные неповторяющимися протоспейсерными последовательностями, которые будут транскрибироваться и перерабатываться в зрелые последовательности CRISPR РНК (crRNA), гомологичные вторгшемуся генетическому материалу. Сборка активного эффекторного комплекса CRISPR/Cas требует включения зрелой crRNA, которая направляет эффекторный комплекс к вторгающимся нуклеиновым кислотам, и отдельно кодируемой многодоменной нуклеазы Cas (нуклеаза класса I) или набора нуклеаз Cas (нуклеазы класса II) [67]. Распознавание мишени происходит благодаря обширной комплементарности между последовательностью ДНК захватчика и crRNA, что приводит к Cas-зависимому двухцепочечному расщеплению комплекса crRNA-чужая ДНК [65,69]. Система CRISPR типа II, состоящая из одной эффекторной нуклеазы Cas9, является самой простой и хорошо изученной системой CRISPR, которая широко применяется в геномной инженерии [65,66,69]. Система типа II требует наличия второй молекулы РНК, называемой транс-активирующей crRNA (tracrRNA), которая соединяется с crRNA для образования двойной структуры guide RNA (gRNA), необходимой для распознавания мишени и crRNA-guided расщепления ДНК, предшествующей protospacer adjacent motif (PAM), присутствующему в последовательности мишени [67,70,71]. Замечательная способность систем типа II к программированию была использована для разработки мощных инструментов редактирования генов, позволяющих целенаправленно воздействовать на любую желаемую последовательность ДНК путем настройки последовательности crRNA. Хотя в природе crRNA и tracrRNA кодируются отдельно, ученые создали химерную молекулу однонаправленной РНК (sgRNA) путем слияния crRNA с tracrRNA. В терапевтических подходах на основе CRISPR важным моментом является безопасная и эффективная доставка системы CRISPR/Cas9 в клетки-мишени. Система CRISPR/Cas9 может быть введена в изолированные клетки-мишени пациентов с β-талассемией с помощью вирусных или невирусных векторов доставки, где РНК-зависимое расщепление ДНК осуществляется Cas9 после распознавания целевой последовательности crRNA. Электропорация и микроинъекция могут быть указаны как безопасные невирусные методы доставки CRISPR [39,72,73].