Для изучения естественного процесса регенерации фиброхряща был создан полной толщины дефект хряща в бедренной трохлеарной кости крыс. Во время восстановления хряща мы наблюдали, что клетки, регенерировавшие в дефекте, имели кластерное распределение (рис. 1B и рис. S1A). Кроме того, Col I постоянно экспрессировался с ранней стадии (2 недели после травмы) до относительно поздней стадии (6 недель после травмы). Между тем, хотя Col II наблюдался во время восстановления хряща, соотношение Col II и Col I было значительно снижено на поздней стадии (рис. 1, B и C). Хорошо известно, что FCs являются основным источником этих фибриллярных белков в ECM фиброхряща (6). Расположение цитоскелета регулирует дифференцировку хондроцитов (12). Стабильность микротрубочек, представленная экспрессией ace-тубулина, в клетках дефекта хряща также была снижена при формировании фиброхряща (рис. 1, D и E). Более того, в образцах хряща при ОА человека, собранных из коленного сустава, высокий уровень матричной металлопротеиназы-3 (MMP3) наблюдался в области с пониженной экспрессией COL II/I, что указывает на пагубное влияние фиброхряща на другие хрящевые ткани (рис. 1F). Эти данные позволяют предположить, что образование фиброхряща при восстановлении хряща неизбежно, и его существование еще больше угрожает окружающей здоровой ткани.

Получение стабильных FCs было первой проблемой перед исследованием гиалинизации фиброхряща in vitro. Предыдущие исследования показали, что стволовые клетки, индуцированные фактором роста соединительной ткани (CTGF) и трансформирующим фактором роста-β (TGF-β), были эффективны для регенерации фиброхряща (22, 23). Мы предположили, что обработка CTGF и TGF-β будет практичным подходом для получения FCs. После подготовки МСК костного мозга (BMSCs) мы последовательно обрабатывали клетки CTGF и TGF-β1 в течение 1 недели для получения индуцированных FCs (iFCs) (рис. 2A).

Fig. 2. The identification of CTGF- and TGF-?1-induced fibrocartilage chondrocytes...

Чтобы определить фиброзный фенотип iFCs, мы провели секвенирование РНК контролируемых BMSCs (BMSC_Ctrl) и CTGF- и TGF-β1- индуцированных BMSCs (BMSC_C+T). В общей сложности 5397 генов были дифференциально экспрессированы, причем 2695 генов были повышены, а 2702 - понижены (BMSC_C+T по сравнению с BMSC_Ctrl) (рис. S1B). Как показано на диаграмме Венна, 10 842 гена перекрывались в двух группах (рис. S1C). Тепловая карта показала дифференциально экспрессированные гены (рис. 2B). Гены, связанные с фиброзом, были увеличены в iFCs, включая Col1a1, Col1a2, Col3a1, Fmod и Fndc1. Ранее сообщалось о снижении генов защиты хряща, включая Frzb, Fgfr3 и Fgf2 (24-26). Более того, анализ обогащения набора генов (GSEA) показал, что элементы генной онтологии (GO) - дифференцировка клеток, внеклеточное пространство, активность факторов роста и процесс развития - были высоко обогащены в BMSC_Ctrl (рис. 2C). Однако BMSC_C+T были более вовлечены в связывание рецептора фактора некроза опухоли, клеточный окислительно-восстановительный гомеостаз, активность экзопептидазы и регуляцию каталитической активности (рис. 2C).

После индукции CTGF и TGF-β1 ассоциированные с развитием хряща белки, включая Sox9 и Col II, были снижены, а фиброзные белки, включая Col I, Col III и α-гладкомышечный актин (α-SMA), были значительно повышены (рис. 2D и рис. S2A). Совместное иммунофлуоресцентное окрашивание F-актина и α-SMA также показало повышение плотности α-SMA после лечения CTGF и TGF-β1 (рис. 2E). Уровень аце-тубулина также был нарушен после лечения CTGF и TGF-β1 (рис. 2, D и F и рис. S2A). С помощью анализа проточной цитометрии мы обнаружили, что только CD44 был снижен после индукции фиброза (рис. 2G и рис. S2B). Эти результаты показывают, что iFCs были успешно индуцированы последовательным воздействием CTGF и TGF-β1 и демонстрируют снижение стабильности микротрубочек.

После получения стабильных iFCs путем последовательного лечения CTGF и TGF-β1 мы исследовали роль ремоделирования микротрубочек в гиалинизации. Мы использовали реагент для стабилизации микротрубочек, доцетаксел, для обработки iFCs (рис. 3A). При концентрации доцетаксела выше 5 nM жизнеспособность клеток снижалась (рис. S1B). Поэтому мы выбрали 2,5 nM доцетаксела для лечения iFC в следующих исследованиях. Транскриптомный анализ показал, что в общей сложности было обнаружено 853 дифференциально экспрессированных гена, из которых 452 были повышены и 401 понижены между группами введения доцетаксела и транспортного средства (рис. S1E). В общей сложности 11 945 генов перекрывались в этих двух группах (рис. S1F). Гены, связанные с фиброзом, включая Fmod, Col1a1, Col3a1 и Fndc1, были заметно снижены, а гены, связанные с цитоскелетом, включая Acta2, Tuba1a, Tuba4a и Tubb2b, были значительно увеличены под действием доцетаксела (рис. 3B). GSEA показал, что при лечении доцетакселом более обогащенными оказались такие элементы, как внеклеточная область, активность лиганда рецептора, связывание сигнального рецептора и защитный ответ (рис. 3C).

Fig. 3. Microtubule stabilization inhibits fibrosis and improves chondrogenesis of induced fibrocartilage chondrocytes...

При лечении доцетакселом в iFCs значительно повышался уровень ace-тубулина (рис. 3, D и E, и рис. S2C). В отличие от группы с ведением транспортных средств, доцетаксел значительно повысил уровень белков Sox9 и Col II (рис. 3D и рис. S2C). Между тем, фиброзные белки сдерживались стабилизацией микротрубочек (рис. 3E и рис. S2C). Последовательно, соотношение α-SMA было ниже в группе, обработанной доцетакселом, по сравнению с группой, обработанной транспортным средством (рис. 3F). Для выяснения роли стабилизации микротрубочек на образование ECM в iFCs, мы провели культивирование микромассы и гранул iFCs. Результаты окрашивания сафранином O (SO) и альциановым синим показали, что в клетках, обработанных доцетакселом, синтезировалось больше GAGs (рис. 3Г). Более того, плотное окрашивание толуидиновым синим и SO в стабилизированных микротрубочками гранулах указывало на то, что они были более склонны к образованию гиалинового хрящеподобного ECM (рис. 3H). Эти данные свидетельствуют о том, что улучшение стабилизации микротрубочек доцетакселом играет эффективную роль в трансформации iFCs в гиалиновые хондроциты.

Обилие мукополисахаридных цепей хондроитинсульфата, расположенных в матриксе, придает поверхности хряща сильный отрицательный электростатический эффект (27). Наши результаты показали, что в фиброхряще, образовавшемся во время восстановления хряща, наблюдалась высокая экспрессия трансферрина (рис. 4C). Сообщалось, что трансферрин является положительно заряженным белком, поскольку он переносит ионы железа (28). Трансферрин в фиброхряще представляет собой молекулярную мишень для носителей лекарств с отрицательным поверхностным зарядом.



Fig. 4. Characterization of thermosensitive docetaxel loaded injectable hydrogel.

Schematic illustration showing (A) the synthesis of thermosensitive docetaxel loaded injectable hydrogel (D-PDP@MC-Gel) and (B) the application of D-PDP@MC-Gel for fibrocartilage modification in situ. PLGA, poly(lactic-co-glycolic acid). (C) Immunohistochemical staining for transferrin of the fibrocartilage in cartilage defect (2, 4, and 6 weeks after surgery) and the control (sham operation) group. Scale bar, 200 µm. (D) Photographs of D-PDP@MC-Gel and the gel without docetaxel (PDP@MC-Gel) at 4 and 37°C. (E and F) Rheological test on D-PDP@MC-Gel and PDP@MC-Gel under different temperature. (G) Zeta potentials of D-PDP@MC-Gel and PDP@MC-Gel. (H) Images of fluorescence captured from the cartilage after the injection of FITC-PDP@MC-Gel 1 and 7 days. (I) In vitro drug concentrations of D-PDP@MC-Gel and D-PDP in saline at 37°C. The amount of D remaining in the solution released from the D-PDP and D-PDP@MC-Gel.

Здесь мы разработали новый материал, в котором наночастицы (NPs) доцетаксела, нагруженные поли(молочно-кокогликолевой кислотой)-1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламином-полиэтиленгликолем (PLGA-DSPE-PEG), были инкапсулированы внутри гидрогеля метилцеллюлозы (D-PDP@MC-Gel) для устойчивого высвобождения доцетаксела в фиброхряще после его внутрисуставного введения (рис. 4, A и B). Доцетаксел был инкапсулирован в биодеградируемые PLGA NPs с помощью эмульсионного подхода. DSPE-PEG использовался не только для повышения коллоидной стабильности, но и для создания отрицательного потенциала для PLGA NPs.

Затем термочувствительный MC-гель был использован для формирования гидрогелевого каркаса in situ при физиологической температуре. Сканирующая электронная микроскопия (SEM) показала сферические формы контрольных частиц PLGA-DSPE-PEG без доцетаксела (PDP-частицы) и частиц с доцетакселом (D-PDP-частицы), а также пористую структуру MC-геля (рис. S3A). Как показано на рис. 4E, когда модуль сохранения (G') был больше, чем модуль потери (G''), гели переходили в эластичное состояние. И PDP@MC-гель, и D-PDP@MC-гель демонстрировали переход золя в гель при температуре около 29°C. Исследование деформации и частоты показало, что механические свойства D-PDP@MC-геля были немного сильнее, чем PDP@MC-геля (рис. S3B). Кроме того, при снижении температуры гель снова переходил в форму раствора, а многократное повышение и понижение температуры не влияло на его температурные характеристики (рис. 4F). Более того, дзета-потенциал двух типов частиц составлял около - 38 mV (рис. 4G).

Затем мы исследовали адгезию отрицательно заряженного MC-геля к фиброхрящу в модели повреждения хряща крысы через 4 недели после операции. Трохлеар бедренной кости был извлечен у крысы через 1 и 7 дней после внутрисуставного введения флуоресцеин изотиоцианата (FITC)-PDP@MC-Gel и визуализирован с помощью PerkinElmer In vivo Imaging System. Образец, выделенный в 1 день, показал большое сохранение флуоресценции на всей суставной поверхности, в то время как флуоресценция сохранялась в дефекте хряща с фиброхрящом через 7 дней после инъекции (рис. 4H). Эти данные подтверждают, что термочувствительный D-PDP@MC-гель предпочтительно прилипал к фиброхрящу за счет электростатического взаимодействия. Кроме того, уровень доцетаксела в различные промежутки времени после погружения в физиологический раствор при 37°C исследовался с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии . D-PDP@MC-Gel имел значительно более высокую концентрацию доцетаксела, чем D-PDP (рис. 4I). Эти данные свидетельствуют о том, что термочувствительный D-PDP@MC-гель предпочтительно прилипает к фиброхрящу за счет электростатического взаимодействия и непрерывно высвобождает доцетаксел.

Чтобы проверить влияние D-PDP@MC-геля на гиалинизацию фиброхряща in vivo, мы создали модель повреждения хряща крысы и провели внутрисуставное введение контрольных гелей и гелей с доцетакселом в различных дозах (5, 10 и 25 µг/кг) в момент формирования фиброхряща (4 недели после операции) (рис. 5А). Во-первых, мы обнаружили, что низкие дозы доцетаксела, включая 5 и 10 µг/кг, не оказывали значительного влияния на изменение ECM фиброхряща (рис. S4A). Однако доцетаксел (25 µг/кг) в гидрогеле увеличивал содержание GAGs в фиброхряще (рис. S4A). Поэтому для дальнейших исследований in vivo мы выбрали гидрогель с доцетакселом (25 µг/кг), нацеленный на фиброхрящ. Кроме того, мы провели внутрисуставную инъекцию доцетаксела без гидрогеля, нацеленного на фиброхрящ , в модели повреждения хряща крысы. Примечательно, что не было никакой разницы в клеточной организации, и морфологический характер ткани коленного сустава, включая мениск и синовиадльную оболочку, не наблюдался между каждой группой (рис. S4B). Изучение гистологии основных органов и разницы в весе крыс не выявило явной токсичности доцетаксела и MC-гелей для животных (рис. S3C и S4C). Как показано на макроскопическом изображении, хрящ, обработанный D-PDP@MC-гелем, демонстрировал более гладкое и неповрежденное заполнение поверхности по сравнению с контрольной группой и группой, обработанной PDP@MC-гелем (рис. 5B). Более интактное образование субхондральной кости при обработке D-PDP@MC-Gel наблюдалось при трехмерной (3D) реконструкции изображений микротомографии (рис. 5B и рис. S4F). Очевидно, что результаты гистологического исследования показали организованное распределение клеток и большое количество ГАГ в области хрящевого дефекта в группе лечения D-PDP@MC-Gel (рис. 5, C и E). Хондроциты в дефекте хряща, обработанном D-PDP@MC-Gel, показали более высокую экспрессию аце-тубулина (рис. 5, D и F). Кроме того, при наблюдении за границей дефекта было обнаружено, что аце-тубулин был специфически повышен в фиброхряще, что иллюстрирует эффект нацеливания доцетаксела на фиброхрящ с помощью отрицательно заряженного геля (рис. S3, D и E). Соотношение Col II/I в восстановленной ткани в области дефекта значительно улучшилось после обработки D-PDP@MC-гелем (рис. 5, G-I). Изменения в матриксе фиброхряща в группе, обработанной гелем с доцетакселом, также включали снижение уровня Fmod и повышение уровня аггрекана (рис. 5, J - M). Эти результаты указывают на многообещающий эффект D-PDP@MC-геля в трансформации фиброхряща в гиалиновый хрящ in situ.

Fig. 5. The effect of thermosensitive docetaxel loaded injectable hydrogel in fibrocartilage in vivo...

Чтобы определить роль стабилизации микротрубочек в гиалинизации фиброхряща при ОА человека, мы собрали дегенерированный хрящ пациента с ОА и обработали его доцетакселом или без него (рис. 6А). После инкубации с доцетакселом в течение 1 недели уровень ace-тубулина в хондроцитах был значительно выше, чем в контрольной группе (рис. 6, B - E). Между тем, уровень SOX9 и COL II значительно повысился в результате лечения доцетакселом (рис. 6, D и E). Результаты гистологических исследований показали, что лечение доцетакселом значительно улучшило соотношение COL II/I (рис. 6, F и G). Кроме того, в группе стабилизации микротрубочек снижалась регуляция FMOD и повышалась регуляция аггрекана (рис. 6, H и I). Эти данные выявляют влияние стабилизации микротрубочек на трансформацию человеческого фиброхряща в гиалиновый хрящ при ОА.

Fig. 6. The effect of microtubule stabilization on the fibrocartilage in human OA.

Экспрессия Sparc (секретируемого белка, кислого и богатого цистеином) была повышена в фиброзном процессе и снижена при лечении доцетакселом по результатам секвенирования РНК (рис. 2B и 3B). Анализ меж-белкового взаимодействия (PPI) показал, что Sparc связан с фиброзными белками в CTGF- и TGF-β1- индуцирующих и стабилизирующих микротрубочки процессах (рис. 7A). Более того, цитоскелетные гены показали связь с процессом фиброза при лечении доцетакселом iFCs (рис. 7A). Было показано, что Sparc может быть вовлечен в формирование фиброхряща и отменен стабилизацией микротрубочек. Экспрессия Sparc увеличивалась под действием CTGF и TGF-β1 и уменьшалась под действием доцетаксела in vitro (рис. 7, B - G). Мы сбили экспрессию Sparc с помощью малой интерферирующей РНК (siRNA) в BMSCs при индуцировании CTGF и TGF-β1 и затем обнаружили, что фиброз был подавлен, а хондрогенез увеличен (рис. 7, H и I). Недостаток Sparc показал сходный эффект с лечением доцетакселом на подавление фиброзного фенотипа iFCs (рис. S5, A и B). Экспрессия Sparc была увеличена во время формирования фиброзного хряща в дефекте хряща (рис. 7J). Однако, по сравнению с контрольной группой и группой PDP@MC-Gel, Sparc был подавлен D-PDP@MC-Gel в фиброхряще in vivo (рис. 7K). В хряще человека доцетаксел также подавлял экспрессию Sparc по сравнению с контрольной группой (рис. 7L). Кроме того, мы наблюдали, что экспрессия CTGF также усиливалась во время восстановления хряща, а лечение доцетакселом значительно подавляло его экспрессию (рис. S5, C-F). Эти результаты показывают, что Sparc и CTGF способствуют производству фиброхряща, и, следовательно, ингибирование Sparc и CTGF может быть терапевтической целью при гиалинизации фиброхряща.

Fig. 7. The mechanism of Sparc in the fibrocartilage hyalinization.

В этом исследовании была предложена ранее неизвестная стратегия, названная гиалинизацией фиброхряща, которая направлена на модификацию фиброхряща in situ. Здесь мы изучили метод создания модели формирования фиброхряща in vitro и in vivo и продемонстрировали, что стабилизация микротрубочек FCs улучшила гиалинизацию фиброхряща за счет ингибирования Sparc (рис. 8). Кроме того, был создан термочувствительный гидрогель с доцетакселом для воздействия на фиброхрящ и успешно достиг гиалинизации фиброхряща в модели повреждения хряща крысы (рис. 8).



Fig. 8. Schematic of articular fibrocartilage-targeted therapy by microtubule stabilization.

Fibrocartilage was modified in situ by microtubule stabilization via docetaxel loaded hydrogel. The transformation of fibrocartilage toward hyaline cartilage by microtubule stabilization was through regulating Sparc. HyC, Hyaline chondrocytes.

Состояние микротрубочек (стабилизированных и дестабилизированных) определяет организацию клетки и несколько сигнальных путей (13). В последние десятилетия разработка препаратов для стабилизации микротрубочек внесла большой вклад в клинические исследования и лечение рака (29). Большинство из них, таких как паклитаксел, доцетаксел, эпотилоны и такалонолиды (paclitaxel, docetaxel, epothilones, and taccalonolides), были использованы в клинической практике (29). Исходя из своей многофункциональности, стабилизация микротрубочек также привлекла большое внимание в клинических и фундаментальных исследованиях других заболеваний (13, 14). В данном исследовании мы обработали iFCs классическим микротрубочки стабилизирующим агентом - доцетакселом. Исходя из этого, мы сначала нацелились на модификацию фиброхряща через регулирование стабильности микротрубочек в iFCs. Стабилизация микротрубочек подавляла фиброзный фенотип и индуцировала экспрессию связанного с гиалиновым хрящом белка в iFCs. Было высказано предположение, что FCs обладают потенциалом трансформации в гиалиновые хондроциты, а стабилизация микротрубочек является перспективной мишенью для модификации FCs in situ. Более того, мы определили влияние стабилизации микротрубочек на хрящ человека при ОА. Хрящ человека при ОА, обработанный доцетакселом ex vivo, также демонстрировал повышенный фенотип гиалинового хряща и подавленный фенотип фиброхряща. Эти данные подтверждают, что стабилизация микротрубочек играет важную роль в индукции гиалинизации фиброхряща. Однако большинство препаратов для стабилизации микротрубочек токсичны и имеют побочные эффекты, такие как нейротоксичность, гематологическая токсичность и диарея (30). Наши результаты показали, что жизнеспособность и пролиферация клеток подавлялись высокими концентрациями доцетаксела (>2,5 нМ). Поэтому необходимы дальнейшие исследования оптимальной концентрации, интервалов дозирования и продолжительности терапии для содействия клинической применимости стабилизации микротрубочек при гиалинизации фиброхряща.

Чтобы проверить влияние стабилизации микротрубочек на гиалинизацию фиброхряща in vivo, мы создали модель повреждения хряща крысы, чтобы вызвать образование фиброхряща, и разработали термочувствительный инъекционный гидрогель с доцетакселом (D-PDP@MC-Gel) для воздействия на фиброхрящ. Для эффективной модификации фиброхряща in situ необходима стратегия хрящевой инженерии, направленная на суставной фиброхрящ. Кроме того, инъекционные каркасы могут быть доставлены минимально инвазивным способом путем прямой инъекции (31). Метилцеллюлоза была использована для формирования термообратимого гидрогеля для достижения золь-гель перехода гидрогеля (32, 33). Дозировка доцетаксела (75 µг/м²) в клинике основана на систематическом применении (34). В то время как оптимальная стратегия локальной доставки доцетаксела остается неясной. Избыток доцетаксела может повлиять на пролиферацию клеток и даже убить FCs непосредственно в фиброхряще, что приведет к неудаче регенерации хряща. В данном исследовании 10 µг доцетаксела было загружено в 50 µл MC-геля (25 г/кг) для однократной внутрисуставной инъекции. Наши данные показали, что MC-гель может эффективно поддерживать высвобождение доцетаксела и защищать доцетаксел от деградации под воздействием температуры и pH. Более того, низкая концентрация доцетаксела в суставе может поддерживаться, поскольку он может оставаться в MC-геле не менее 30 дней, что снижает токсичность доцетаксела. Кроме того, устойчивое высвобождение доцетаксела позволило снизить частоту дозирования и улучшить соответствие. Исследование основных органов и веса крыс продемонстрировало безопасность такой дозировки доцетаксела и MC-Gel.

На ранней стадии (2 недели после операции) множество клеток плотно распределились в дефекте хряща и произвели начальный матрикс восстановленной ткани (рис. 1B и рис. S1A). Пролиферация и миграция клеток в хрящевой дефект важны для создания естественного источника клеток и матричного каркаса для производства гиалинового хряща. Кроме того, через 6 недель после операции мы наблюдали плотную фибриллярную матрицу и относительно редкое распределение клеток в восстановленном хряще (рис. 1B и рис. S1A), что обеспечивало бесплодную микросреду для регенерации. Поэтому D-PDP@MC-гель был введен в коленный сустав через 4 недели после операции по повреждению хряща. После применения D-PDP@MC-Gel хондроциты в восстановленной области фиброхряща демонстрировали высокую экспрессию аце-тубулина, что указывает на успешное высвобождение доцетаксела в FCs и эффективную стабилизацию микротрубочек. Учитывая отрицательно заряженную природу ECM хряща, в предыдущих исследованиях для преодоления обструкции хряща использовались положительно заряженные системы, такие как авидин и положительно заряженный нано-носитель (35, 36). Наши результаты показали, что положительно заряженный белок, трансферрин, был высоко экспрессирован в фиброхряще. Положительный заряд трансферрина повреждает отрицательно заряженную среду, созданную протеогликаном в ECM здорового хряща (27), что может служить молекулярным якорем для носителей лекарств с отрицательным зарядом поверхности для воздействия на фиброхрящ (28). DSPE-PEG-COOH, переносимый доцетакселом на PLGA, обеспечивает отрицательный заряд для прилипания к фиброхрящу, чтобы высвободить лекарство и избежать воздействия на здоровый хрящ и другие ткани в синовиальном суставе. Примечательно, что фиброхрящ в восстановленной области был изменен в гиалиновый хрящ, о чем свидетельствовала сильная экспрессия Col II и аггрекана и значительно сниженная экспрессия Col I и Fmod, двух канонических маркеров фиброхряща (37). Эти результаты свидетельствуют о том, что использование D-PDP@MC-Gel было эффективным для доцетаксела, играющего свою роль в стабилизации микротрубочек в фиброхряще. Хотя мы достигли преобразования фиброхряща в гиалиновый хрящ и выявили возможность гиалинизации фиброхряща, есть вопросы, которые должны вызывать беспокойство в будущих исследованиях: (i) Каково оптимальное время введения доцетаксела для гиалинизации фиброхряща? (ii) Может ли фенотип гиалинового хряща сохраняться после отмены доцетаксела? (iii) Какова разница в механических свойствах до и после гиалинизации фиброхряща? Кроме того, существуют некоторые ограничения в изучении модели повреждения хряща крысы. Пластина роста все еще существует под суставным хрящом грызунов, что может привести к увеличению внутренней регенеративной способности хряща. Кроме того, походка и биомеханические условия крыс значительно отличаются от человеческих. Более того, размер сустава и толщина хряща также препятствуют исследованию биомеханического преимущества неохряща, перенесенного из хряща. Поэтому, чтобы отразить более конкретную информацию о процессе трансформации фиброхряща и характеристиках неохряща, таких как изменения организации ECM и биомеханических свойств, в будущем необходимо провести исследование гиалинизации фиброхряща у более крупных животных.

Ключевой механизм гиалинизации фиброхряща путем стабилизации микротрубочек был связан со Sparc. Экспрессия Sparc тесно связана с синтезом фибриллярных коллагенов, особенно Col I (38), что согласуется с анализом PPI Sparc в наших данных. Сообщалось, что Sparc критически необходим для созревания FCs и развития энтезиса (имплантации) многих соединительных тканей (39,40). Наши результаты показали, что производство CTGF и процесс формирования фиброхряща in vivo способствовали увеличению экспрессии Sparc, что позволяет предположить, что Sparc играет важную роль в формировании фиброхряща. Более того, секвенирование РНК показало, что в процессе индукции фиброза и стабилизации микротрубочек экспрессия Sparc изменялась противоположным образом. Эти данные показали, что эффект стабилизации микротрубочек при обратном фиброзе хряща основан на механизме ингибирования Sparc. Кроме того, мы также обнаружили, что стабилизация микротрубочек снижает экспрессию CTGF как in vivo, так и in vitro. Наши результаты позволяют предположить, что ингибирование Sparc и CTGF при условии стабилизации микротрубочек является критическим механизмом гиалинизации фиброхряща.

В заключение, в настоящем исследовании была изучена возможность модификации фиброхряща в гиалиновый хрящ in situ, что позволило предположить, что гиалинизация фиброхряща является практической и перспективной стратегией регенерации хряща. Данное исследование представляет собой предварительную попытку и исследование гиалинизации фиброхряща, и в будущем предстоит изучить больше возможных подходов и конкретных механизмов.