Каждый десятый человек в мире страдает хронической болезнью почек (CKD)¹. У части пациентов болезнь почек переходит в конечную стадию (ESKD), которая требует диализа или трансплантации и является фактором риска сердечно-сосудистых заболеваний и смертности из всех причин¹. Прогрессирование CKD связано с разрушением гломерулярного фильтрационного барьера, места ультрафильтрации в почке, который состоит из эндотелиальных клеток, гломерулярной базальной мембраны (GBM) и эпителиальных подоцитов^2,3. Подоциты имеют уникальную архитектуру с отростками ножек, которые отходят от их клеточных тел, формируют пальцевидные врастания (интердигитируют) и образуют щелевидные мембраны, способствующие зависимой от размера и заряда селективной фильтрации и предотвращающие потерю белков плазмы^4,5. В здоровом состоянии форма подоцитов поддерживается сложным, высокорегулируемым актиновым цитоскелетом, который поддерживает пальцевидные отростки^6,7 и прикрепляет клетки к GBM⁸. При гломерулярных заболеваниях цитоскелет подоцитов дезорганизуется, что часто приводит к потере подоцитов, нарушению фильтрации и утечке белков плазмы, таких как альбумин, в мочу^7,9-11. Альбуминурия является отличительным признаком гломерулярного заболевания, независимо от основной этиологии¹². Поэтому терапия, защищающая цитоскелет подоцитов, представляет собой новую стратегию сохранения целостности гломерулярного фильтрационного барьера, предотвращения альбуминурии и улучшения течения гломерулярной болезни.

Тимозин β4 (TB4) секвестрирует мономерный G-актин в клетках млекопитающих^13,14 и поддерживает высокую концентрацию G-актина, доступного для полимеризации в актиновые филаменты (F-актин)¹⁵. Ранее мы показали, что эндогенный TB4 экспрессируется в подоцитах и играет защитную роль. Мы обнаружили, что отсутствие эндогенного TB4 ухудшает альбуминурию, функцию почек и гломерулярное повреждение в мышиной модели иммуноопосредованного гломерулярного заболевания, одновременно с потерей подоцитов из гломерулярного фильтрационного барьера. Кроме того, прямая роль эндогенного TB4 на цитоскелет подоцитов была установлена ^{in vitro}, где потеря TB4 привела к переходу от кортикального актина к цитоплазматическим стрессовым актиновым волокнам и усилению миграции подоцитов¹⁶.

Эти результаты позволяют предположить, что лечение экзогенным TB4 может быть использовано в терапевтических целях для защиты цитоскелета подоцитов и замедления прогрессирования гломерулярной болезни. TB4 уже показал свою перспективность в качестве средства для лечения различных заболеваний, таких как инфаркт миокарда¹⁷, синдром сухого глаза¹⁸, инсульт¹⁹ и воспалительные заболевания легких²⁰. Кроме того, экзогенный TB4 оказывает защитное действие в животных моделях повреждения почек²¹, включая диабетическую нефропатию²², одностороннюю обструкцию мочеточников^23,24 и острое реперфузионное повреждение при ишемии²⁵, однако ни в одном из этих исследований не изучалось специфическое действие экзогенного TB4 на подоциты. Кроме того, в вышеуказанных исследованиях вводился пептид TB4, который имеет относительно короткий период полураспада, а его повышенный уровень в плазме крови сохраняется только в течение 6 часов после инъекции²⁶. Чтобы преодолеть быстрый метаболический оборот TB4, можно использовать рекомбинантный адено-ассоциированный вирус (AAV), опосредованную генную терапию, чтобы вызвать стабильную и долгосрочную экспрессию трансгенов с помощью одной инъекции^27-29. Действительно, конструкции AAV, кодирующие TB4, были успешно использованы для тканеспецифической (мышцы, сердце) или системной регуляции TB4 в моделях заболеваний мышей, кроликов и свиней с терапевтическим эффектом^30-32.

Здесь мы показали, что повреждение подоцитов, индуцированное адриамицином (ADR), связано со снижением экспрессии эндогенного TB4 в подоцитах. С помощью системной генотерапии повышение концентрации TB4 в adriamycin в плазме крови позволило предотвратить вызванную ADR альбуминурию и потерю подоцитов. Дальнейшее исследование F-актиновых структур подоцитов in vitro показало, что экзогенный TB4 предотвращает дезорганизацию цитоскелета, вызванную ADR. В целом, наша работа показывает, что опосредованное генотерапией системное введение TB4 представляет собой новую стратегию лечения для защиты подоцитов от повреждения и сохранения целостности гломерулярного фильтрационного барьера.



Figure 1

Podocyte-specific Tmsb4x and Tmsb10 expression is downregulated in murine Adriamycin nephropathy. (a) Uniform manifold approximation and projection (UMAP) from single-cell RNA sequencing data of 8412 glomerular cells from two wildtype (control) mice and 8296 glomerular cells from mice with Adriamycin nephropathy (ADR). After analysis and cell type assignment, ten transcriptionally distinct cell populations were discriminated including arterial endothelial cells (AEC), glomerular endothelial cells (GEC), macrophages (MF), mesangial cells, monocytes (Mono), parietal epithelial cells (PEC), podocytes, smooth muscle cells (SMC), T cells, tubular epithelial cells (TEC). The markers used for cell type identification and assignment, and the numbers of cell types per condition, are shown in Supplementary Fig. 1. (b) Feature plots showing expression of nephrin (Nphs1) and podocin (Nphs2), canonical markers of podocytes, across the dataset. (c) Violin plot comparing the scaled expression of Tmsb4x of all glomerular cells (podocytes, GECs, mesangium) between ADR (n?=?5602 cells) and control (n = 7190 cells). An average log fold decrease of 0.23 was detected in ADR compared to control (*: adjusted P value?...

Для более детального изучения организации F-актина в подоцитах мы классифицировали расположение F-актина на кортикальных стресс-волокнах актина, цитоплазматические стресс-волокна или неорганизованные волокна (рис. 5g). До введения ADR в большинстве подоцитов (61,2 ± 2,2%) преобладали кортикальные актиновые волокна, по сравнению с 26,4 ± 2,5% подоцитов с цитоплазматическими волокнами и 12,4?±?2,0% подоцитов с неорганизованными актиновыми волокнами. Лечение 0,0125 µг/мл ADR изменило это распределение, значительно снизив распространенность кортикальных стрессовых волокон (33,2 ± 2,3%, P менее 0,0001) и увеличив распространенность неорганизованных актиновых волокон (31,2 ± 3,2%, P = 0,0068) по сравнению с необработанными подоцитами. Лечение экзогенным TB4 предотвратило вызванную ADR реорганизацию F-актина и значительно увеличило долю подоцитов с кортикальными стрессовыми актиновыми волокнами (62,8 ± 1,4%, P менее 0,0001) по сравнению с группой, получавшей низкую дозу ADR. Лечение 0,125 µг/мл ADR привело к усугублению дезорганизации цитоскелета, снизив распространенность кортикальных стрессовых волокон до 25,2 ± 2,1% (P менее 0,0001) и увеличив распространенность неорганизованных актиновых волокон до 50,4 ± 4,2% (P менее 0,0001) по сравнению с группой без лечения. Совместное лечение экзогенным TB4 ослабляло эффекты ADR, при этом частота кортикальных стрессовых волокон составляла 57,2 ± 2,6% (P менее 0.0001), а частота неорганизованных актиновых волокон - 24 ± 4,2% (P = 0.0001) (рис. 5h-j).

В данном исследовании мы показали, что повреждение ADR приводит к снижению уровня мРНК Tmsb4x в гломерулах и особенно в подоцитах. Системное повышение уровня TB4 с помощью AAV-опосредованной генотерапии предотвращает вызванную ADR альбуминурию и потерю подоцитов in vivo, а лечение синтетическим TB4 предотвращает вызванную ADR дезорганизацию цитоскелета in vitro. Таким образом, мы представили первые доказательства того, что экзогенный TB4 может защитить цитоскелет подоцитов и улучшить течение гломерулярной болезни.

Предыдущие исследования продемонстрировали экспрессию эндогенного Tmsb4x в гломерулах мыши преимущественно в подоцитах^16,37,50. Однако влияние гломерулярного заболевания на уровень TB4 менее очевидно. Протеомное исследование на модели почечного фиброза с использованием остатка почки крысы показало, что уровень TB4 увеличивается в три раза в склеротических по сравнению с нормальными гломерулами⁵¹. Наша группа ранее продемонстрировала, что уровень Tmsb4x не был изменен в цельных почках, полученных от мышей с гломерулонефритом, или в гломерулярных экстрактах, полученных из биоптатов человека, взятых у пациентов с быстро прогрессирующим гломерулонефритом или волчаночным нефритом¹⁶. Эти исследования, однако, не оценивали уровни Tmsb4x специфически для конкретного типа клеток. Здесь мы провели анализ набора данных scRNAseq³⁶ и показали, что повреждение ADR у мышей приводит к снижению уровня Tmsb4x именно в подоцитах. Интересно, что мы также обнаружили снижение уровня Tmsb10 в подоцитах, предполагая, что этот другой член семейства тимозинов может играть роль в гломерулярной болезни.

Поскольку эндогенный TB4 играет защитную роль при гломерулярных заболеваниях^16,42, мы предположили, что лечение экзогенным TB4 будет полезным при повреждении ADR. Действительно, мы обнаружили, что введение ТБ4 предотвратило развитие альбуминурии у мышей, травмированных ADR. Клетки подоцитов - важнейший компонент гломерулярного фильтрационного барьера, и они являются основной мишенью повреждения почки при ADR33. Мы продемонстрировали, что TB4 предотвращает потерю подоцитов у мышей, травмированных ADR. Потеря подоцитов из гломерулярного клубочка может быть результатом гибели клеток или травмы, которая вызывает отрыв подоцитов². Актиновый цитоскелет имеет решающее значение для поддержания формы подоцитов⁵² и их прикрепления к GBM⁸. Мы разработали новый метод количественной оценки F-актина подоцитов in vivo и обнаружили, что ни ADR, ни TB4 не влияют на количество F-актина в подоцитах. Однако детальный анализ цитоскелета F-актина в культивируемых подоцитах показал, что, хотя количество F-актина не изменилось, повреждение ADR вызвало дезорганизацию актина, которая была предотвращена лечением TB4. Эти результаты показывают, что TB4 защищает цитоскелет подоцитов и предотвращает повреждение и потерю подоцитов, что связано с улучшением альбуминурии после повреждения ADR. В эпидермисе недостаток эндогенного TB4 приводит к затруднению закрытия век и к изменению наклона волосяных фолликулов, а также к дефектам planar cell polarity (PCP) с нарушением стабильности адгерентных соединений, аберрантным распределением F-актина и изменением формы клеток⁵³. PCP также связана со здоровьем подоцитов при развитии и болезни⁵⁴. Van Gogh-like 2 (Vangl2), основной белок PCP, необходим для нормальной дифференцировки гломерул^55,56, а специфическая для подоцитов делеция Vangl2 усугубляет экспериментальный гломерулонефрит у мышей^57,58. Поэтому возможно, что некоторые эффекты TB4 на клетки подоцитов могут быть опосредованы через пути PCP.

Предыдущие исследования показали, что эндогенный и экзогенный TB4 может снизить воспаление в животных моделях повреждения почек, включая нефротоксический нефрит¹⁶, ангиотензин-II индуцированную гипертоническую нефропатию⁴² и острое ишемически-реперфузионное повреждение²⁵. В нашем исследовании мы оценивали эффекты TB4 на ранних стадиях повреждения ADR, когда макрофагальная инфильтрация еще не присутствует, демонстрируя, что защитный эффект TB4, вероятно, не зависит от его противовоспалительных свойств в этом случае.

В нашем исследовании использовалась системная генотерапия, опосредованная AAV, для достижения долгосрочной регуляции трансгенов³⁸. В предыдущих исследованиях использовалось введение белка TB4, который поддерживает повышенный уровень циркулирующего TB4 только в течение 6 ч²⁶. Наша стратегия позволяет обойти быстрый оборот TB4, повышая уровень мРНК Tmsb4x в печени и обеспечивая устойчивое повышение уровня циркулирующего белка TB4 через 5 недель после введения AAV. Кроме того, мы продемонстрировали, что повышенные уровни циркулирующего TB4 после введения AAV могут достигать подоцитов. Поэтому мы предполагаем, что циркулирующий TB4 может быть интернализован подоцитами, как это было показано ранее на других типах клеток^59-61, и изменять их реакцию на повреждение, однако также вероятно, что циркулирующий TB4 может взаимодействовать с внеклеточными рецепторами для изменения функции подоцитов. Накопление возрастающих уровней белка TB4 в тканях после генотерапии AAV, вероятно, предотвращается действием пептидаз, пролил олигопептидазы и меприна, которые гидролизуют TB462, а также выведением с мочой⁶³. Будущие исследования могут нацелить кодирующие TB4 AAV на почки, однако системное введение AAV серотипов 1-9 не показало эффективной трансдукции в почках³⁸. Транскрипционный таргетинг⁶⁴, синтетические AAVs⁶⁵ и новые способы введения, такие как введение путем ретроградной уретеральной и субкапсулярной инъекции⁶⁶ или путем инъекции в почечную вену⁶⁷, показали перспективность, и их можно использовать для достижения специфической для почек сверхэкспрессии TB4. Индуцибельные AAVs^68,69 позволят регулировать время повышения уровня TB4 для оценки его способности улучшать прогрессирование установленного гломерулярного заболевания.

Подводя итог, мы показали, что повреждение ADR приводит к снижению уровня эндогенного TB4, потере подоцитов и протеинурии. Системная генотерапия TB4 защищает цитоскелет подоцитов и предотвращает протеинурию и потерю подоцитов. Эти данные позволяют предположить, что лечение с помощью TB4 может стать новой терапевтической стратегией, направленной на цитоскелет подоцитов для предотвращения повреждения подоцитов и поддержания фильтрации при гломерулярной болезни.