Генетические заболевания, которые ранее считались неизлечимыми, вскоре могут быть вылечены благодаря простоте использования, универсальности, точности и специфичности системы "CRISPR-Cas9". Открытие кластеризованных регулярно перемежающихся коротких палиндромных повторов, системы CRISPR-ассоциированной нуклеазы (CRISPR/Cas9) и переход геномной инженерии от бактериальных клеток к клеткам млекопитающих ознаменовали собой существенные изменения. Этот метод геномной инженерии был использован не только в различных клеточных линиях, но и в первичных и стволовых клетках человека. Более того, в экспериментах in vivo использовались рыбки данио и мыши для исследования функций генов, моделей рака и методов генотерапии [17-23]. Таким образом, метод CRISPR/Cas9 способен изменить способы лечения генетических заболеваний [24,25]. В последнее время для лечения наиболее распространенных генетических заболеваний, таких как рак, используются генетические подходы на основе CRISPR/Cas9. Однако в списке есть еще несколько заболеваний, таких как мышечная дистрофия Дюшенна, муковисцидоз, врожденный амавроз Лебера, талассемия, серповидно-клеточная болезнь и болезнь Хантингтона, которые могут лечиться или вылечены с помощью аналогичных генетических подходов [26,27].

В хорошо разработанной системе CRISPR-Cas9 есть два основных компонента: первый - single-guide RNA (sgRNA), второй - эндонуклеаза Cas9. При необходимости система также может включать донорский шаблон для гомологичной репарации. Вместе эти два элемента создают активные рибонуклеопротеиновые (RNP) комплексы, которые могут точно определить геномный регион, где в результате редактирования образуются двунитевые разрывы (DSB) [28-30]. Прикладная система адресной доставки, специфичная для заболевания, особенно техника CRISPR-Cas9, требует эффективного метода переноса или молекулы для достаточного поглощения клетками и защиты от деградации белка, что в конечном итоге приводит к эффектам on-/off-target при конкретном заболевании [31]. Химические методы или синтетические трансфекционные носители имеют то преимущество, что их свойства могут быть приспособлены для удовлетворения потребностей доставки CRISPR-систем при коррекции генов. Кроме того, они помогают преодолеть ограничения по биобезопасности, загрузке и возможности упаковки. Невирусные векторы, по сравнению с вирусными, обладают низкой иммуногенностью, отсутствием эндогенной вирусной рекомбинации, снижают ограничения в доставке больших генетических нагрузок и более просты в крупномасштабном производстве. Невирусные векторы могут предложить заманчивые перспективы для доставки CRISPR-Cas9. Именно поэтому невирусные векторы рассматриваются в качестве альтернативы для трансляционных исследований CRISPR-Cas9 генотерапии [32-34]. Схематическое изображение системы доставки на основе CRISPR-Cas9 показано на рисунке 1.



Figure 1. Delivery methods for CRISPR-Cas9 components.

(A) Cas9 protein and sgRNA form an RNP complex for packaging purposes. (B) Cas9- and/or sgRNA-expressing plasmids are transferred into cells. (C) In vitro or in vivo viral vectors encoding Cas9 and/or sgRNA convey the mechanisms (reprinted with permission from [34]).

Самый короткий метод совместной доставки Cas9 белка и sgRNA был разработан Mout et al., впервые представившие использование материалов на базе AuNPs для редактирования генома (Figure 2A [35]). Предлагаемый белок Cas9 был использован для взаимодействия с катионами arginine-AuNPs, sgRNA, и негативно заряженной меткой пептида glutamate. AuNPs и доставляемая полезная нагрузка взаимодействовали, чтобы создать нано-ансамбли, которые могут быстро соединяться с клеточными мембранами и высвобождать сжатый белок Cas9 и sgRNA груз в цитоплазму. До 90% генов мишеней были успешно трансфицированы с использованием этого метода, при этом наблюдалась высокая эффективность редактирования гена такая же как при adeno-associated virus integration site 1 (AAVS1) (29%) и phosphatase and tensin homolog (PTEN) (up to 30%) in in vitro исследованиях.



Figure 2. (A) Cas9/sgRNA delivery using AuNPs and gene editing. (a) Cas9 protein engineered with ArgNPs for intracellular delivery of Cas9-protein/RNP through membrane fusion. Illustration of Cas9 transporting an E-tag at the N-terminus and a nuclear localization signal at the C-terminus (NLS). (b) Chemical structure of ArgNPs. (c) Nano assembly of Cas9En-RNP and ArgNPs. (d) A membrane fusion method for delivering Cas9En (reprinted with permission from [35]). (B) Conjugation of Cas9 nuclease and carrier NPs makes CRISPR component packing and transport more efficient. Cas9En self-assembled into massive nano assemblies with arginine-functionalized-AuNPs (reprinted with permission from [35]).

Lee et al. разработали CRISPR-AuNPs транспортное средство для прямой передачи и быстрого выделения рибонуклеопротеина Cas9 и шаблонов репарации для донорской ДНК для исправления изменений генов в модели для изучения мышечной дистрофии Дюшенна (MDX) мышей [36]. AuNPs размером 15 нм сначала конъюгировали с тиол-модифицированными олигонуклеотидами, затем скрещивали с донорской ДНК и загружали комплексом Cas9-RNP, и, наконец, покрывали катионным полимером, poly{N-[N'-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl] aspartamide}, PAsp (DET). PAsp (DET) на внешней стороне CRISPR-AuNPs может вызвать растягивание эндосомы и обеспечить выход эндосомы в конце клеточного эндоцитоза, высвобождая ее в цитоплазму и вызывая высвобождение комплекса Cas9-RNP и донорной ДНК из CRISPR-AuNPs. Внешнее покрытие PAsp (DET) облегчает эндосомный выход. Повышение внутриклеточного уровня (~10 мМ) глутатиона позволяет высвободить комплекс Cas9-RNP и донорскую ДНК из CRISPR-AuNPs. Это позволило восстановить функциональную последовательность дикого типа у MDX дистрофин-дефицитных мышей, что уменьшило мышечный фиброз, восстановило экспрессию белка дистрофина и восстановило мышечную функцию без полного повреждения воспалительных цитокинов. CRISPR-AuNPs, используемые вместе, представляют собой возможный метод активного лечения пациентов с DMD путем устранения мутантных генов.

Типичная одиночного гена форма расстройства аутистического спектра была использована в мышиной модели синдрома Fragile X. Ли и др. использовали CRISPR-AuNPs в качестве носителя для переноса RNP в мозг и помогли мыши восстановить поведение высокой повторяемости [37]. После внутричерепной инъекции CRISPR-AuNPs, нацеленных на ген mGluR5 в стриатуме мышей дикого типа или нокаутных мышей Fmr1, локальные уровни гена mGluR5 в стриатуме были успешно снижены.

AuNPs были изучены в сочетании с их фототермическими свойствами и традиционными преимуществами частиц на основе липидов [38], при этом катионные AuNPs были сформированы путем присоединения коротких пептидов. Это соединение ускоряет клеточное поглощение ТАТ-пептидами AuNPs. Затем с катионными AuNPs была соединена плазмида Cas9-sgRNA, нацеленная на polo-like kinase 1 (PLK-1). Затем на AuNP-плазмиду была нанесена смесь катионных липидов, состоящая из 1,2-диолеоил-3-триметиламмониумпропана, диолеоилфосфатидилэтаноламина DOPE и холестерина, и частицы были усилены добавлением 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-поли(этиленгликоля) и 2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-поли(этиленгликоля) для повышения устойчивости. Было подтверждено, что разрушение PLK-1 в клетках меланомы было усилено облученными светом AuNPs.

Гибкая катионная платформа AuNP, известная как аргинин ArgNPs, была разработана для улучшения переноса через мембрану [35,39]. Инженеры использовали Cas9 с глутаматной пептидной меткой и NLS, поскольку глутаминовая кислота создает отрицательный потенциал вокруг Cas9 RNP для соединения с положительными ArgNP. В отличие от эндоцитоза, было обнаружено, что Cas9-ArgNPs интернализируются клетками через мембран-подобную процедуру, требующую холестерина. Более того, доставка в цитозоль была связана с длиной цепью используемого глутаматного пептида. В клетках HeLa Cas9-ArgNPs, нацеленные на гены PTEN или AAVS1, вызывали 30% indels, демонстрируя редактирование генов. Другое исследование показало гибкость этого метода доставки, используя Cas9-ArgNPs для получения SIRP-нокаутных макрофагов RAW264. 7 для усиления фагоцитоза раковых клеток [40].

SpCas9-AuNCs были локализованы в клетках посредством эндоцитоза и подвергнуты действию эндосомного и лизосомного низкого pH, что вызвало диссоциацию SpCas9-AuNCs, а также действию протонной губки, что впоследствии привело к высвобождению SpCas9 в цитоплазму [41]. Затем SpCas9-AuNCs были использованы для проверки возможности редактирования гена E6 в геноме HPV 18 в клетках HeLa с помощью трансфекции E6 sgRNA, и после обработки SpCas9-AuNCs экспрессия белка E6 HPV18 резко снизилась.

Mout и др. сконструировали белок Cas9 так, чтобы он имел отрицательный заряд, в результате чего получился белок, напоминающий sgRNA электростатически [35]. В данном исследовании олиго-тег глутаминовой кислоты (E-tag) был слит с N-концом белка Cas9, Cas9En (n: глутаминовые кислоты), а sgRNA были собраны с катионными аргининовыми AuNPs (ArgNPs) и доставлены непосредственно в цитоплазму и ядро (Рисунок 2B).

ZFNs были впервые обнаружены в ооцитах Xenopus как компонент транскрипционного фактора IIIa [42], и впоследствии они были идентифицированы как сайт-специфическая эндонуклеаза для разрезания ДНК [43]. ZFNs обладают сайт-специфическими свойствами связывания ДНК. Они обладают группой цинковых пальчиков (ZF) Cys2His2, образованных в результате взаимодействия между их ZF-доменами и аналогичными участками ДНК. ZF-белки представляют собой тип транскрипционного фактора, соединенного с эндонуклеазой. Каждая ZF-единица специфически идентифицирует три пары оснований ДНК и создает специфические для основания связи, взаимодействуя с основной бороздкой ДНК [44,45] через свои спиральные остатки.

Они могут связываться с любым триплетом в его естественных условиях, которые варьируются в зависимости от состояния ткани, контекста белка и последовательности ДНК. Одиночные цинковые пальчики, которые имеют аминокислоты [46,47], представляют собой прямолинейные структуры с необычайно высокой степенью функциональной гибкости и структурной податливости. Эффективность HR значительно повысилась благодаря внедрению ZFNs для создания ген-специфических разрывов ДНК [48]. RE типа II FokI создает домен расщепления ДНК, а затем димеризуется для специфического воздействия на соответствующие участки [49]. Активными являются два экзогенных белковых домена: первый - нуклеаза рестрикции FokI, а второй - сивенс-специфический zinc-finger transcription factor protein (ZFP). FokI, фермент нуклеазы рестрикции, обнаруживает тринуклеотидные последовательности ДНК, ZFP обнаруживает сиквенс-специфичные последовательности и FokI. Нуклеазный домен, состоящий из широкого набора цинковых пальчиков C2H2, взаимодействует с этим доменом, ограничивая ДНК-связывающую специфичность ZFNs и направляя их к сайту-мишени (рис. 3A). Процесс восстановления генов с помощью ZFN выглядит следующим образом: идентификация полного сайта связывания ZFN в целевом GOI (интересующем гене); конструирование пары ZFN; тестирование пары ZFN на активность; определение конструкции нацеливания для получения ожидаемых геномных модификаций; совместная передача ZFNs и вектора нацеливания для получения разрезов и вставки терапевтического трансгена в GOI [50]. На рисунке 3B-a клеточное таргетное вещество и полезная нагрузка в виде цитотоксического белка, соответственно, были генетически соединены с двумя формами ZnF, которые распознают различные последовательности ДНК. С помощью химии стрептавидин-биотин была создана двухцепочечная ДНК с большим количеством сайтов связывания ZnF, которая была присоединена к золотым наночастицам. Для создания сборки нуклеопротеиновых наночастиц белки, слитые с ZnF, и наночастицы, и функционализированные ДНК, были совместно инкубированы.



Figure 3. (A) ZFNs have a specific structure. ZFNs linked to their target locations are depicted schematically. This is a well-designed ZF DNA domain fused to the FokI type IIS restriction enzyme's DNA cleavage domain that forms nucleases. Each ZFN protein has three ZFs (shaded ovals) that recognize a target sequence in the DNA (shaded boxes). The binding of two ZFNs on target DNA with a spacer (5/6 bp) in the center causes the ZFN nuclease domains to dimerize and the target DNA to be cleaved (reprinted with permission from [51]). (B) DNA and zinc fingers are used to program the construction of nucleoprotein nanoparticles. (a) Template modular DNA design. A biotin molecule was added at the 3' end of the template DNA with a TEG linker for grafting template DNA onto AuNPs. To eliminate steric hindrance, multiple binding sites for QNK-QNK-RHR (QNK) were spatially organized with a four-base-pair spacer. (b) Sequential construction of nucleoprotein nanoparticles is depicted schematically (NNPs) (reprinted with permission from [52]).

ZFP встречаются в значительных количествах в геномах различных организмов; у человека они составляют 3% всего генома и являются очень распространенными ДНК-связывающими мотивами в транскрипционных факторах. Благодаря значительным достижениям последнего времени [51,52], постепенно раскрывается роль ZFPs в здравоохранении. Они становятся признанными мишенями для лечения рака [53,54], вирусных инфекций [55] и, в последнее время, неврологических расстройств. Fairall и др. заметили, что соединения металлов вытесняют Zn (II) из ZFPs [45]. Благодаря лучшему пониманию того, как комплексы металлов взаимодействуют с ZFs, были созданы инновационные металлические соединения для воздействия на конкретные ZFs с помощью координационной и металлоорганической химии. Для точной модуляции внутриклеточных сигнальных путей все большее внимание привлекают различные методы доставки белков [56-66]. Металлические NPs являются исходными специальными материалами для создания нано-носителя благодаря своим отличительным нано размерам и морфологии. Нуклеопротеиновые слоистые AuNPs с использованием ДНК и ZnFs были исследованы для целевой доставки белка в ксено-трансплантационных моделях мышей [67], и это показало их полезность и потенциал, продемонстрировав компетентный и селективный для опухоли цитозольный транспорт белкового груза, а также значительную регрессию опухоли при незначительной токсичности (рис. 3B). Другая группа исследовала кластеры наночастиц как улучшенный контрастный агент для MRI и двойной зонд для магнитной и флуоресцентной визуализации, используя клетки HeLa для изучения избыточной экспрессии фолатных рецепторов [68].

Как и ZFNs, TALENs являются белковыми нуклеазами природного происхождения, которые вызывают DSBs ДНК путем слияния неспецифического домена расщепления ДНК с последовательно-специфическим ДНК-связывающим доменом. Высоко консервативная повторяющаяся последовательность из транскрипционного активатора-подобного эффектора (TALE), белка, первоначально обнаруженного у фитопатогенных бактерий Xanthomonas, который спонтанно изменяет транскрипцию генов в клетках растений-хозяев, составляет эту "ДНК-связывающую область" [69,70]. ZFNs и TALENs структурно и функционально идентичны, причем TALENs более специфичны, хотя оба содержат эндонуклеазу рестрикции Fok [69]. Для связывания с определенной последовательностью ДНК эффекторные белки TAL должны быть сконструированы. TALE связывается с ДНК посредством участка ядра, содержащим набор трехаминокислотных (33-35) мотивов (рис. 4). Типичный ДНК-связывающий домен TALE распознает 1420 нуклеотидов, включая консервативное основание тимин (T) на границе 5' . Repeat-variable di-residues RVDs) [70,71] - это две чрезвычайно вариабельные аминокислоты, которые определяют ибирательность TALE. RVDs консервативны в положениях 12 и 13 [72]. Известно около 24 различных RVD, и эти петли RVD содержат аминокислотный повтор с отсутствующим остатком, обозначаемый символами N*, причем наиболее распространенным является 33 [73]. Собрать четыре базовых компонента, способных распознавать основания A, T, G и C, в TALEN легче, чем собрать субъединицы ZFN, распознающие 64 различные пары триолов или триплетов ДНК. ZFNs и TALENs, с другой стороны, полагаются на высокоточные взаимодействия белка с ДНК, которые допускают меньшее количество несоответствий [74].



Figure 4. A TALEN dimer coupled with target DNA is shown schematically. To develop a modified nuclease that can detect unique left and right half-sites, TALE arrays are fused to the FokI nuclease domain. A spacer 12-20 bp in length separates the two TALE binding sites (reprinted with permission from [74]).

Вставляя NHEJ/HDR-индуцированное изменение в кодирующую область, TALEN смогли разрушить гены NTF3 и CCR5 в клетках лейкемии человека, это указывает на то, что TALEN предназначены для расщепления эндогенных генов [75]. Разрушение одного аллеля гена Fms-related tyrosine kinase 3 (FLT3) с помощью сайт-специфического TALEN привело к созданию изогенных клонов лейкозных клеток. Использование искусственных TALEN в клетках рака простаты и реорганизация генов-мишеней андрогенового рецептора (AR) являются функционально категоризированными источниками резистентности [75]. Кроме того, исследования показали, что данный вид технологии редактирования генов является мощной и широко подходящей платформой для изучения трансмутаций генов на молекулярной основе. Эта технология была использована в раковых клетках, таких как клетки рака простаты, клетки рака молочной железы [76] и клетки гепатоцеллюлярной карциномы (ГЦК) [77] для нокаута генов. Однако из-за многочисленных ограничений ZFN и TALEN, исследования по применению в нано-медицине были ограничены или отсутствовали.

Новаторское исследование, проведенное на нематоде Caenorhabditis elegans, показало, что RNAs являются эволюционно консервативным механизмом замалчивания генов [78,79]. RNA Interference (RNAi) - это клеточный механизм, который нацелен на мРНК и подавляет трансляцию, чтобы заставить замолчать специфические гены [80]. В этом механизме антисмысловая область ds-RNA направляет распознавание и каталитическую деградацию мРНК-мишени комплексом РНК-индуцированного сайленсинга. Анти-смысловая нить дуплекса двухцепочечной РНК является посредником одного из типов siRNA (короткой интерферирующей РНК), которая направляет распознавание и каталитическую деградацию мРНК-мишени с помощью RNA-induced silencing complex's (RISC). Двухцепочечные последовательности РНК, называемые siRNA, интегрируются в RISC [81-85]. Направляющая (анти-смысловая) нить и пассажирская (смысловая) нить составляют собой 21-нуклеотидный дуплекс siRNA. Argonaute2 (Ago2) - это эндонуклеаза, которая удаляет направляющую/пассажирскую нить. Другой процесс осуществляется эндогенными в 20-25 нт короткими РНК, называемыми микроРНК (миРНК), которые либо способствуют, либо подавляют трансформацию своих мРНК-мишеней [85]. Перспективным методом секвенс-специфического подавления генов является генотерапия RNAi, которая может лечить серьезные заболевания человека, такие как генетические нарушения, вирусные инфекции и рак [86-89]. Существует большой интерес к этой технологии и к углублению наших знаний об основных принципах обоих путей, чтобы использовать их в медицинских целях, поскольку доставка малых РНК в клетки для регуляции экспрессии генов была затруднена [90]. Прохождение этих РНК через клеточную мембрану затруднено из-за их отрицательного заряда и молекулярной массы около 13 кДа. Кроме того, в присутствии РНКазы в сыворотке крови siRNA более чувствительна к разрушению, что требует использования молекулы-носителя для достижения цели. siRNA может комплексоваться или конъюгироваться с различными транспортерами, и наше понимание того, как доставляется siRNA, продвинулось вперед [91].

Благодаря своему терапевтическому потенциалу, AuNPs нашли применение во многих аспектах нано-медицины, и они являются одной из самых передовых платформ для доставки генов [92,93]. AuNPs могут быть загружены и объединены с отрицательно заряженными генными препаратами [94], при условии, что сердцевина покрыта послойной оболочкой из биоразлагаемых полимеров. С помощью различных поверхностно-активных веществ AuNPs часто получают в водных растворах, где они затем адсорбируются или осаждаются на поверхности [95].

В исследовании катионных фосфолипидных покрытых золотых нано-стержней в качестве систем распределения полезной нагрузки нуклеиновых кислот, когда отрицательно заряженные олигонуклеотиды ДНК, РНК или siRNA были прикреплены к положительно заряженной фосфолипидной поверхности, интернализация AuNRs наблюдалась с помощью микроскопии рассеяния темного поля [96]. Conde и др., начиная с культивируемых клеток человека, а затем используя беспозвоночные и позвоночные (мыши) модели, использовали композиции AuNP для эффективной доставки RNAi. Это привело к молчанию протоонкогена c-myc [97]. Основная идея этой комбинации заключается в ковалентном присоединении нуклеиновых кислот к AuNPs, что не нарушало их биологической активности [98]. Graczyk и др. показали, что ген CopGFP, экспрессируемый в модельной клеточной линии и являющийся мишенью нового тримера (AuNPs, связанные со структурными нано-частицами РНК (tectoRNAs) и несущие регуляторные фрагменты siRNA), может эффективно регулироваться тримером нового поколения, а также комплексом тример-AuNPs, нацеленным на три выбранных участка мРНК. Их конструкции tectoRNA-AuNPs обладают низкой цитотоксичностью в раковых и нераковых типах клеток, что указывает на их биосовместимость и возможность разгрузки в цитоплазме, как видно на изображениях трансмиссионной электронной микроскопии [99].

Показав, что анти-eGFP siRNA, pEGFP-N1 или pDsRed-Max-N1 могут быть упакованы для совместной доставки на AuNPs с помощью процедуры послойной самосборки, Bishop и др. изучили способность AuNPs доставлять нуклеиновые кислоты [96,100,101]. Были изготовлены конъюгаты многовалентного дезоксирибозима "10-23" AuNPs (DzNP) с различной плотностью ДНК, длиной линкера, ориентацией фермента и составом линкера для изучения влияния каталитического эффекта стерической среды и химии поверхности золота. Они продемонстрировали, что DzNP могут ингибировать экспрессию GDF15 в клетках через каталитический механизм, отличный от РНК-интерференции. Двойная техника DzNP и siRNA-AuNP имеет потенциал, поскольку действие DNAzyme дополняет регуляцию генов на основе siRNA, особенно для тех, кто намерен сосредоточиться на генах, влияющих на функцию RISC [100]. С другой стороны, сайленсинг генов исследовался с помощью многослойных siRNA-AuNPs путем измерения активности люциферазы в клетках MDA-MB231-luc2 (sRAuNPs). Это может быть связано с замедленным разрушением полипептида, поли-лизина (PLL), это означает, что интегрированное высвобождение siRNA имеет более длительный эффект замалчивания генов [101].

Снижая количество связанных белков и мРНК, Liu и др. исследовали, может ли использование золотых нано-потоков (GNFs) и siRNA (пул GNF-siRNA) предоставить in vitro и in vivo терапевтические преимущества при фототермическом лечении и глушении генов. Эти последовательности были использованы для подавления генов BAG3 и снижения системной токсичности. Более того, они экспериментально доказали, что "GNFs-siRNA" может способствовать клеточной интернализации и вызывать эндосомальный/лизосомальный выход siRNA, что приводит к подавлению белков и мРНК и указывает на то, что это подходящий вектор для переноса siRNA для реального PTT лечения [102] (рис. 5).



Figure 5. A schematic representation showing the preparation of "GNFs-siRNA" and the treatment process (reprinted with permission from [102]).

Shim et al. синтезировали агрегаты из siRNA, связанных с многочисленными AuNPs, используя чувствительную к кислотам ketal линкерную группу. AuNPs и олигонуклеотиды высвобождались, когда ketal линкер разрывался при низком pH. Целенаправленное замалчивание генов было продемонстрировано с помощью in vitro микроскопии на клетках, экспрессирующих GFP в условиях низкого уровня pH [103].

Chitosan (CS) и покрытые siRNA AuNPs (siRNA/CS-AuNPs) были синтезированы с использованием уникального подхода послойной самосборки. siRNA была защищена от ферментативной деградации в результате послойной самосборки siRNA/CS-AuNPs, сохраняя активность siRNA [102]. Чтобы объединить оптическую визуализацию с генотерапией, Shim и др. конъюгировали крошечные AuNPs с поверхностью полиплексов, несущих siRNA, с помощью кислотно-деградируемых соединений. Этот уникальный агностический препарат изменяет свои фотофизические свойства при наличии специфического для рака стимула. Одновременное изменение электромагнитного сигнала и глушение генов in vitro при специфических условиях, имитирующих рН опухоли, это используется для достижения комплексной диагностики и терапии рака (тераностика). Этот инновационный тип стимул-реактивной нанотераностики представляет собой инновацию для визуализации и лечения рака, которое является целевым, мультимодальным и комбинированным [103] (рис. 6).



Figure 6. (A) AuNPs in imaging and gene-silencing NP design. The siRNA payload is released when the nanoparticle is hydrolyzed at a low pH. (B) Three-dimensional optical coherence tomography pictures of AuNP-based nanoparticles (the lower intensity image on the right confirms NPs' disintegration at lower pH). (C) When eGFP-expressing NIH 3T3 cells are treated with AuNPs-siRNA at low pH, fluorescence microscopy demonstrates gene silencing (reprinted with permission from [103]).

Впервые они были обнаружены в работе Stephenson и Zamecnik где 13-мерные генерируемые ssASOs нацеливались на мРНК вируса саркомы Роуса [104-107], приводя к блоку трансляции [107]. Согласно нескольким исследованиям, активные ASOs обычно имеют длину 15-20 нуклеотидов и обладают исключительной специфичностью и сродством практически к любой комплементарной последовательности РНК, будь то пре-мРНК, мРНК, рибонуклеарные белки или миРНК, и что они подавляют гены мишени [105] путем базового сопряжения оснований без значительного увеличения far-off (отдаленной) токсичности [106]. Дальнейшие исследования показали, что два процесса, которые приводят к синтезу ASO, работают следующим образом: либо (1) повреждая РНК, либо (2) препятствуя трансляции РНК.

Ожидается, что анти-смысловые препараты будут успешны в лечении целого ряда заболеваний, включая рак и ВИЧ/СПИД [107]. FDA одобрило ASOs для лечения одиннадцати генетических заболеваний, и многие другие находятся в разработке. ASOs были одобрены департаментами здравоохранения многих стран, такими как Европейское агентство по лекарственным средствам (EMA) и FDA в США, и большинство из них получили коммерческое одобрение [107-109]. ASOs с трудом превращаются в эффективные терапевтические системы из-за проблем, связанных с устойчивой трансфекцией, доступом к различным видам клеток, токсичностью и эффективностью [110]. Для доставки нуклеиновых кислот в клетки были созданы различные невирусные агенты, такие как катионные липиды и полимеры, модифицированные вирусы, дендримеры, липосомы и наночастицы [111-113], но каждый подход имеет свой набор ограничений. ASOs также должны обладать благоприятными безопасными, фармакокинетическими и фармакодинамическими профилями, а также устойчивостью к нуклеазам [114]. Анти-смысловой олигонуклеотид когда защищен от разрушения РНКазой с помощью AuNPs, то это увеличивает период полураспада и, как следствие, груз лечебных агентов, поступающих в клетки. Для различных молекул нуклеиновых кислот, включая анти-смысловую одноцепочечную ДНК, способность AuNPs векторизовать исполнительные механизмы для подавления генов путем простой сборки на сердцевине наночастицы была установлена in vitro и in vivo [114-118]. PBP2A является селективным антимикробным препаратом, который восстанавливает восприимчивость, вызывая вирулентность путем экспрессии пенициллин-связывающего белка 2a (PBP2a), который считается транспептидазой, кодируемой геном mecA [119]. Как показано на рисунке 7, Beha и др. представили многослойно покрытые AuNPs (ML-AuNPs) для доставки ASO, нацеленных на ген резистентности метициллин-резистентного Staphylococcus aureus [120].



Figure 7. A schematic depiction of how to make ML-AuNPs that deliver antibiotic resistance-targeting ASOs and how to use them to treat MRSA infections in combination (reprinted with permission from [120]).

Одноцепочечный ДНК олигонуклеотид , полученный Vinhas et al. [121], избирательно воздействует в K562 клетках на экспрессию гена e14a2 BCR-ABL1. Гены замалчивались очень хорошо с помощью AuNPs, это достоверно увеличивало гибель клеток. Изменения в экспрессии белков BCL-2 и BAX, усиление активности caspase-3 и присутствие апоптических тел в клетках, на которые воздействовали nano conjugate указывают на способность соединений вызывать апоптоз клеток, экспрессирующих K562 BCR-ABL1. Более того, imatinib IC50 [122] снижался, когда вызывающие молчание золотые nano conjugate были скомбинированы с ним.

Kheirandish et al. [122] блокировали ген Leishmania major PTR1 с помощью анти-смысловой плазмиды. Ген PTR1 был подавлен анти-смысловой мРНК. Новый класс не-кодирующих РНК, которые экспрессируются только на внутриклеточной стадии amastigote, был открыт Dumas и другими [123]. Фосфоротиоатные олигонуклеотиды были использованы Ramazeilles et al. [124] для специфического воздействия на последовательность мини-экзонов, которая присутствует на 5' концах мРНК каждого паразита и ранее показала, что голые AuNP обладают анти-лейшманиозными свойствами. Ген L. major GP63 был подавлен. Наблюдалось поглощение ASOs организмом L. major. Согласно исследованию, гибридизированные AuNP могут убивать промастиготы и делать ген GP63 неактивным. Jebali et al. [125] пришли к выводу, что последовательность и размер анти-смыслового олигонуклеотида были важны для трансфекции L. major, вызывающего кожный лейшманиоз. Важно отметить, что эти ASOs могут быть изготовлены как из кодирующих, так и не-кодирующих областей гена GP63. Кроме того, гибридизированные AuNPs могут убивать L. major в дополнение к глушению гена GP63. Был опубликован подробный обзор путей деградации белков при гематологических злокачественных опухолях, в котором изучалось конкретное количество категорий стресса, приводящих к деградации белков и безуспешному лечению [126]. Кроме того, AuNPs потенциально могут помочь в изучении генетических заболеваний. Как уже указывалось, значительные исследования по поглощению важных сигнальных путей с помощью клеток MG-63 с золото-ариловыми NPs провели Abdulwahab и другие [127]. Они предположили, что эти частицы могут быть пригодны для доставки лекарств и для отслеживания в процессе их разработки. Поскольку они не влияли на биологические процессы раковых клеток остеосаркомы, эти золото-ариловые NPs могут быть эффективны для введения лекарств пациентам с этим заболеванием. Это ключевая зацепка для дальнейших исследований в области наследственных заболеваний.

Хотя во всем мире ведутся как доклинические работы, так и клинические испытания, направленные на лечебную терапию, клинический перевод CRISPR/Cas9-опосредованной коррекции генов или других генных коррекций связан с непредсказуемыми результатами [128]. Тем не менее, они показывают их перспективность для медицинских исследований, и, что важно, несколько клинических испытаний в настоящее время находятся в фазе I или фазе II. Примечательно, что технология терапевтического редактирования генов в настоящее время распространяется на спорный с этической точки зрения вопрос изменения генома человеческих эмбрионов на ранней стадии развития для защиты их от ВИЧ-инфекции [129]. Это вселяет в исследователей большой оптимизм в отношении лечения смертельных заболеваний человека.

AuNP-опосредованная генотерапия уже продемонстрировала большой потенциал в создании моделей заболеваний для коррекции и подавления мутаций моногенных заболеваний. Изучение особой и уникальной природы AuNPs значительно облегчит их использование для доставки грузов или исправления генных мутаций. Однако для получения точного результата необходимы детальное изучение и оптимизация. Приведенные здесь новые методы свидетельствуют о многочисленных перспективных преимуществах использования нано-носителей для замалчивания активности генов и редактирования генов. Как и предполагалось в предыдущих исследованиях, мы продемонстрировали, как активные методы целенаправленного воздействия на основе многофункциональных наночастиц, такие как совместная доставка других лекарств, улавливание AuNPs в органических композитах для защиты или адресной доставки, а также фототермическое высвобождение, например, могут быть применены в генотерапии. Однако нам еще предстоит провести более глубокие исследования и проанализировать их результаты, прежде чем мы сможем добиться ощутимых результатов.