Революция в области редактирования генома - это забег на длинную дистанцию, но с захватывающим дух прогрессом в последние годы. Эта новая технология взаимодействует с механизмами репарации ДНК для получения результатов редактирования генома, специфичных для конкретного участка. На сегодняшний день разработано до четырех различных инженерных нуклеаз, позволяющих модифицировать геном широкого спектра эукариотических клеток. Это стало возможным благодаря специфическим инструментам, появившимся в конце 1990-х годов, направленным на нуклеазы, с описанием мегануклеаз [1], нуклеаз с цинковыми пальчиками (ZFNs) и транскрипционных активатор-подобных эффекторных нуклеаз (TALENs) [2,3] до создания РНК-направляемых эндонуклеаз на основе бактериальной иммунной системы clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR), описанной в 2013 году [4,5]. Благодаря простоте конструкции, универсальности и низкой стоимости, РНК-направляющие системы больше подходят для применения в качестве инструмента геномной инженерии, позволяя целенаправленно и эффективно модифицировать большое количество типов клеток и организмов [6].

CRISPR/Cas был впервые обнаружен в бактериях и археях 30 лет назад как адаптивный защитный механизм против вторжения чужеродных последовательностей ДНК, таких как вирусная или плазмидная ДНК [7-10]. Несколько лет спустя применение этой системы для редактирования генов у эукариот открыло новую эру в области биотехнологий [11].

Система CRISPR/Cas9 типа II является наиболее широко применяемой стратегией редактирования. Она состоит из РНК-направляемой эндонуклеазы (нуклеазы Cas9) и направляющей (guide) РНК (gRNA), которая образована РНК CRISPR и транс-активирующими последовательностями РНК CRISPR. После объединения Cas9 и gRNA образуют рибонуклеопротеиновый комплекс (RNP), готовый к связыванию с комплементарным участком целевой ДНК мишени, который должен находиться рядом с протоспейсерной последовательностью смежного мотива (PAM) [11]. Затем эндонуклеаза Cas9 расщепляет целевую ДНК, создавая сайт-специфические двунитевые разрывы (DSBs) [12].

С помощью редактирования генома можно прервать, вставить или заменить интересующую последовательность в геноме путем создания целевых специфических DSBs с помощью системы CRISPR/Cas9. ДНК DSBs могут быть восстановлены двумя способами: повторное сшивание концов с помощью таких путей, как негомологичное соединение концов (NHEJ) и микрогомологичное соединение концов, которое может привести к инсерциям и делециям (indels), или шаблонная репарация с использованием донорской молекулы ДНК посредством гомологически-направленной репарации (HDR; рис. 1). В этом случае донорский шаблон обычно поставляется в виде плазмиды, одноцепочечного олигодезоксинуклеотида (ssODN) [13] или вирусного вектора, включая адено-ассоциированные вирусы [14-16] или лентивирусный вектор с дефицитом интеграции [17].

Недавно появились новые подходы к редактированию генов в клетках млекопитающих, которые действуют без DSB, например, редактирование оснований и праймеров (рис. 1). Группа David Liu's [18,19] описала редакторы оснований аденина и цитозина, которые опосредуют преобразование A->T в G->C или C->G в T->A в геномной ДНК, соответственно. Для создания этих редакторов они создали аденозин-цитидин-деаминазу тРНК, слитую с каталитически ослабленным белком Cas9 (dCas9 или Cas9 nickase), чтобы работать с ДНК без необходимости DSBs. Кроме того, в 2019 году группа доктора David Liu's описала стратегию прайм-редактирования - универсальный и точный метод редактирования генома, который позволяет напрямую записывать новую генетическую информацию в определенный участок ДНК. В прайм-редактировании используется каталитически ослабленный белок Cas9, соединенный с инженерной обратной транскриптазой (прайм-редактором), запрограммированной направляющей РНК прайм-редактирования, которая позволяет прайм-редактору достичь целевого сайта и осуществить желаемую правку [20].

Гемопоэтические стволовые и клетки предшественники (HSPCs) представляют собой редкую популяцию клеток, способных к самообновлению и мультипотентной дифференцировке во все гемопоэтические линии, и играют решающую роль в поддержании непрерывного производства всех клеток крови. Эти особые свойства HSPCs способствовали их широкому использованию в клеточной и генной терапии. Трансплантация гемопоэтических стволовых клеток (HSCT) является наиболее часто применяемой клеточной терапией и регулярно используется для восстановления кроветворной системы после миелоаблации. С момента проведения первой HSCT в 1957 году [21] мы научились очищать, манипулировать и вводить пациентам HSPCs. Эти знания привели к значительному прогрессу в лечении наследственных гемопоэтических заболеваний (обзор сделан Ferrari et al. [22]). Аутологичная HSCT ex vivo генно-корригированных HSPCs облегчает лечение моногенных заболеваний крови, при которых малое количество совместимых по антигену лейкоцитов человека доноров HSPCs и риск развития болезни "трансплантат против хозяина" препятствуют применению аллогенной HSCT [22,23] (рис. 2). Наиболее распространенными ex vivo протоколами генотерапии HSPC являются протоколы, основанные на использовании вирусных векторов, в основном гамма-ретровирусных и лентивирусных векторов. Эти вирусные векторы интегрируют терапевтическую кассету, содержащую правильную кДНК, в геном HSPCs пациентов. Ранее перенос генов с помощью гамма-ретровирусных векторов позволил добиться впечатляющей коррекции генетических заболеваний кроветворения [24,25], однако использование этих векторов несло в себе генотоксические риски [26,27]. Разработка лентивирусных векторов повысила безопасность генотерапии и эффективность введения терапевтических генов в HSPCs. Это воплотилось в безопасные и эффективные клинические испытания генотерапии на основе лентивирусных векторов для лечения многочисленных наследственных заболеваний кроветворной системы [28-37] и не-гемопоэтических заболеваний [38].

Совсем недавно генотерапия расширила свое применение в области онкогематологии за счет использования оптимизирующего онколитического вируса или наделения иммунных клеток с новыми функциями эффективного целенаправленного воздействия на мишени раковых клеток, таких как химерные антигенные рецепторы (CAR)-T клеток.

Хотя генотерапия HSPCs на основе лентивируса демонстрирует очевидную клиническую пользу для коррекции многих наследственных заболеваний, ее широкое применение может быть ограничено, если требуется физиологический контроль трансгена или заболевание вызвано мутацией с усилением функции. Кроме того, более широкому использованию терапии добавлением генов на основе лентивирусов может помешать долгосрочный риск генотоксичности, который маловероятен, но возможен. Поэтому необходима более точная и специфическая генотерапия. В этом контексте развивается редактирование генов как способ осуществления точных модификаций генома живых клеток. Кроме того, стратегии редактирования генов могут также способствовать повышению стойкости и активности иммунных клеток, нацеленных на раковые клетки. В этом контексте расширение инструментария редактирования генов делает возможными доселе недостижимые терапевтические стратегии. Внедрение программируемых эндонуклеаз, в основном ZFN, TALEN и системы CRISPR/Cas9, или новейших разработок, таких как CRISPR-ассоциированные транспозазы [39], редакторы оснований [18,19] или редакторы праймеров [20], изменили ландшафт генной терапии.

В этом обзоре мы опишем различные аспекты редактирования генов в кроветворной системе, от коррекции наследственных заболеваний крови до лечения рака.