Посещений: 
ГЕНОТЕРАПИЯ
мРНК-терапия
mRNA-based therapeutics: powerful and versatile tools to combat diseases • Shugang Qin,
• Xiaoshan Tang,
• Yuting Chen, et al.
 Signal Transduction and Targeted Therapy volume 7, Article number: 166 (2022)
|
The therapeutic use of messenger RNA (mRNA) has fueled great hope to combat a wide range of incurable diseases. Recent rapid advances in biotechnology and molecular medicine have enabled the production of almost any functional protein/peptide in the human body by introducing mRNA as a vaccine or therapeutic agent. This represents a rising precision medicine field with great promise for preventing and treating many intractable or genetic diseases. In addition, in vitro transcribed mRNA has achieved programmed production, which is more effective, faster in design and production, as well as more flexible and cost-effective than conventional approaches that may offer. Based on these extraordinary advantages, mRNA vaccines have the characteristics of the swiftest response to large-scale outbreaks of infectious diseases, such as the currently devastating pandemic COVID-19. It has always been the scientists' desire to improve the stability, immunogenicity, translation efficiency, and delivery system to achieve efficient and safe delivery of mRNA. Excitingly, these scientific dreams have gradually been realized with the rapid, amazing achievements of molecular biology, RNA technology, vaccinology, and nanotechnology. In this review, we comprehensively describe mRNA-based therapeutics, including their principles, manufacture, application, effects, and shortcomings. We also highlight the importance of mRNA optimization and delivery systems in successful mRNA therapeutics and discuss the key challenges and opportunities in developing these tools into powerful and versatile tools to combat many genetic, infectious, cancer, and other refractory diseases.
|
мРНК - это тип одноцепочечной рибонуклеиновой кислоты, которая транскрибируется с нити ДНК и несет в себе кодирующую информацию для синтеза белка, который в дальнейшем транскрибируется и преобразуется в функциональные белки.1 Транскрипция мРНК in vitro (IVT) была успешно осуществлена и экспрессирована в клетках скелетных мышц мыши, что подтверждает осуществимость мРНК-терапии.2 Терапия на основе мРНК была предложена, когда мРНК можно было успешно трансфицировать и вызвать иммунный ответ в дозозависимой манере путем прямой инъекции мышам для экспрессии терапевтических белков.3 Подход на основе мРНК теоретически может производить любой белок/пептид через аппарат синтеза белка, переработанный в трансфицированной клетке in vitro или in vivo.4 В отличие от препаратов на основе ДНК, транскрипты мРНК обладают относительно высокой эффективностью трансфекции и низкой токсичностью, поскольку для их функционирования не нужно проникать в ядро.5 Важно отметить, что мРНК не имеет потенциального риска случайной инфекции или оппортунистического инсерционного мутагенеза.6 Кроме того, мРНК обладает широким потенциалом для лечения заболеваний, требующих экспрессии белка, и более высокой терапевтической эффективностью благодаря непрерывной трансляции в кодированные белки/пептиды, что позволяет вызвать длительную экспрессию по сравнению с преходящими традиционными белковыми/пептидными препаратами.7 Очевидно, что эти преимущества мРНК перед ДНК или белком/пептидом позволяют быстро внедрить технологии и продукты на основе мРНК в различные отрасли биомедицины, что принесет пользу всем аспектам жизни человека, особенно миллионам пациентов, страдающих от неизлечимых заболеваний.
Тем не менее, недостаточные знания о нестабильности структуры мРНК и иммуногенности приглушили некоторые обещания и замедлили темпы создания терапевтических средств на основе мРНК для борьбы с болезнями. 8 мРНК - отрицательно заряженная макромолекула, восприимчивая к вездесущим РНКазам. Поэтому мРНК довольно трудно пройти через анионную клеточную мембрану и трансформировать функциональные белки в цитоплазме (менее 1/10 000 мРНК от исходного количества). 9 Кроме того, мРНК может вызывать иммунный ответ с сопутствующей токсичностью, что значительно ограничивает разработку терапевтических средств на основе мРНК. 10 Искусственно созданные прецизионные носители для доставки лекарств на основе мРНК играют важную роль в улучшении иммуногенности и нестабильности и преодолении клеточных барьеров. 11. Недавно, основываясь на важной роли мРНК-вакцин в борьбе с пандемией коронавируса тяжелого острого респираторного синдрома 2 (SARS-CoV-2), люди получили большое количество мРНК-вакцин против инфекционных заболеваний, подвергшихся структурным и химическим модификациям, что также значительно подогрело энтузиазм в разработке мРНК-терапевтических препаратов для улучшения их стабильности, эффективности трансляции и иммунного ответа 12 (рис. 1). Одновременно мРНК может быть успешно доставлена в различные клетки благодаря постоянному совершенствованию носителей доставки. 13 Многочисленные технологии также были разработаны для повышения терапевтической эффективности мРНК и улучшения нестабильности мРНК.
 Fig. 1 Key discoveries and advances in mRNA-based therapeutics. The development of mRNA-based therapeutics can be divided into three stages. Phase 1, mRNA discovery, in vitro synthesis and nucleic acid delivery system construction (1961-1990), including discovery mRNA523 and using protamine for RNA delivery,524 in vitro translation of isolated mRNA,525 mRNA cap was discovered,526 Liposome-entrapped mRNA delivery,527 Cap analog commercialized, T7 RNA polymerases commercialized, Cationic lipid-mediated mRNA delivery,528 Naked mRNA is translated in vivo by direct injection.529 Phase2 (1990-2019), accumulated knowledge with the continuous attempts and diverse applications, especially protein replacement therapies and vaccination approaches for cancer and infectious diseases, including using mRNAs for cancer immunotherapy,5 mRNA-based company founded and 3'-UTR regulates mRNA localization,530 antitumor T cell response induced by mRNA,531 first clinical trial with mRNA using ex vivo transfected DCs,532 mRNA-based immunotherapy for human cancer,533 preclinical study with intranodally injected DC-targeted mRNA,534 protective mRNAs vaccination in influenza240 and respiratory syncytial virus,98 CRISPR-Cas9 mRNA for gene editing,535 personalized mRNA cancer vaccine for clinical trials.330 Phase 3, mRNA-based therapeutics, as a disruptive therapeutic technology, is becoming powerful and versatile tools for therapy diseases (2019 to present), including clinical trials of mRNA vaccines for cancer and infectious disease, mRNA-1273,536 and BNT162b emergency use for SARS-CoV-2 pandemic537
Наша лаборатория стремится к тому, чтобы терапия на основе мРНК стала мощным и универсальным средством борьбы с болезнями, особенно в генотерапии и иммунотерапии.14 Мы разработали разнообразные новые наночастицы для адресной доставки15 и создали мРНК, кодирующие рецептор-связывающий домен (RBD), в липосомах для профилактики и лечения пандемии SARS-CoV-2.16
mRNA design and manufacture
Разработка терапевтических препаратов на основе мРНК в основном включает в себя дизайн мРНК, синтез, захват мРНК, фармакодинамику, фармакокинетику, оценку безопасности in vivo и in vitro, производство и клинические испытания (рис. 2). Дизайн и синтез мРНК являются важнейшими этапами в создании лекарственных препаратов на основе мРНК. мРНК имеет пять функциональных областей, включая 5' cap, 3' поли(А) хвост, открытую рамку считывания (ORF)? фланкирующие и 3' нетранслируемые области (UTRs), элементы которых определяют эффективность трансляции и скорость распада мРНК. 6 Получение высокобиологически активной РНК обычно зависит от надежного дизайна и подготовки. 17
 Fig. 2
mRNA drugs production pipeline. The encoding of peptide/protein is designed and inserted into a plasmid DNA construct. Plasmid DNA is transcribed into mRNA by bacteriophage polymerases in vitro, and mRNA transcripts are purified by high-performance liquid chromatography (HPLC) or nanoprecipitation to remove contaminants and reactants. Subsequently, purified mRNA is entrapped in various vehicles. The interactions between vehicles and mRNA can be divided into three types: (a) electrostatic adsorption with phosphate ions of the ribonucleotides; (b) complementary paired hydrogen bonding with bases of the ribonucleotides; and (c) coordination with the phosphate ions. Thus, vehicles for mRNA delivery consist of the following categories: cationic compounds, such as cationic lipids, ionizable lipids, and cationic polymers. Nucleoside-based lipids, e.g., DNCA, or nucleoside-based amphiphilic polymers, e.g., Chol(+)-oligoRNA. Metal-based compounds provide vacant orbitals to coordinate with phosphate ions. Furthermore, the efficacy, pharmacology, and safety of mRNA drugs were evaluated in vaccinated mice and primates. Finally, the scale-up manufacturing of mRNA therapeutics is conducted and followed by clinical trials262
Table 1 Critical quality controls in the preparation of mRNA drugs
The structural elements of mRNA
мРНК образуется в процессе транскрипции. Предшественник мРНК синтезируется у эукариот, когда РНК-полимераза преобразует гены в первичные транскрипты мРНК in vivo, которые обычно все еще содержат некодирующие последовательности интронов, которые далее удаляются, чтобы стать зрелой мРНК путем обработки мРНК, включая capping 5' мРНК, модификации, сплайсинг и редактирование A-to-I. 18 Подготовка зрелой мРНК IVT включает несколько этапов, получение линейного шаблона ДНК, IVT, capping 5' и добавление поли(A) хвоста. После переноса мРНК в клетку поли(А)-связывающий белок (PABP) связывается с хвостом поли(А) и взаимодействует с эукариотическими факторами инициации трансляции (eIFs). Взаимодействие eIFs с 5' cap, UTRs, PABP, инициаторной метиониловой трансферной РНК (тРНК) и 40S субъединицей рибосом приводит к circularization (образованию кольца) мРНК и образованию комплекса инициации. После того как 40S рибосомальная субъединица сканирует кодон инициации транскрипции, происходит рекрутирование 60S субъединиц рибосом и высвобождение eIFs для начала удлинения аминокислотной цепи. 19 Зрелая мРНК включает кодирующую область, UTR, хвост поли(А) и 5' cap, которые могут быть распознаны рибосомами и перенесены тРНК для создания белков. Как и в ДНК, генетическая информация в мРНК содержится в последовательности нуклеотидов, которые организованы в кодоны, состоящие из трех рибонуклеотидов каждый. Соответственно, IVT мРНК проводится для завершения транскрипции РНК in vitro путем стимулирования механизма синтеза эукариотической мРНК для обеспечения экспрессии мРНК in vivo (рис. 3). Поэтому оптимизация мРНК имеет большое значение для успешной терапии на основе мРНК.
 Fig. 3
In vitro transcribed (IVT) mRNA and translation initiation.IVT mRNA preparation includes several steps, plasmid cloning, plasmid linearization, in vitro transcription, 5' capping, and the poly(A) tail adding. Transcription, capping and the tail adding can combine into one, two or three steps that depend on the design of synthesis routes.2 After entering into the cell, mRNA translation can be initiated in an eIF4F-dependent manner to recruit a preinitiation complex (PIC). The 43S PIC is formed by 40S ribosomal subunit, the eukaryotic translation initiation factors (eIF, including eIF1, eIF1A, eIF3, eIF5) and the ternary complex, including a trimeric complex comprising eIF2 that contains α-, β-, and γ-subunits, initiating methionyl tRNA (tRNAiMet), and GTP. eIF4F is a complex composed of eIF4A, eIF4E and eIF4G. eIF4E binds to mRNA cap. eIF4G interacts with eIF3 and poly(A)-binding protein (PABP) that binds to the 3' poly(A) tail. These interactions result in mRNA circularization and 48S PIC assembly. The 48S PIC ribosomal subunit scans and finds the start codon with the help of eIF4A helicase to resolve secondary mRNA structure in the 5' UTR. Then, eIFs are released and 60S ribosomal subunit joins to initiate translation elongation by forming 80S ribosome21 mRNA translation and decay
Инициация трансляции эукариотической мРНК - это изысканно регулируемый процесс, включающий сборку комплекса мультибелок-РНК, который направляет рибосомы к инициирующему кодону. 20 Как правило, cap-зависимая трансляция начинается с распознавания cap эукариотическим фактором инициации 4F (eIF4F) и сборки преинициационного комплекса (PIC), который состоит из тернарного комплекса, 40S рибосомальной субъединицы, eIF1, eIF1A, eIF3 и eIF5. 21 eIF4F состоит из eIF4A, eIF4E и eIF4G, которые облегчают рекрутирование PIC за счет взаимодействия eIF4E-cap и eIF4G-eIF3. eIF4F обеспечивает циркуляризацию мРНК, взаимодействуя с 5' cap через eIF4E и PABP, который связывается с хвостом поли(A). 22 40S рибосома сканирует 5'-UTR и распознает инициирующий кодон с помощью eIF4A для разворачивания вторичной структуры 5'-UTR, затем 40S рибосомальная субъединица сканирует кодон инициации транскрипции, рекрутируются 60S рибосомальные субъединицы и высвобождаются eIFs для начала удлинения аминокислотной цепи. 23 Затем мРНК декодируется в рибосоме для производства определенной аминокислотной цепи или полипептида. Существует баланс между процессами трансляции и распада мРНК 24,25 (рис. 4). Ранее было установлено, что эти структурные элементы, которые активно транслируются, также тесно связаны с распадом мРНК, особенно 5' cap и поли(А) хвост. 26 5' cap защищает мРНК от 5' - 3' экзорибонуклеаз, 27 а длина поли(А) хвоста определяет 3' - 5' экзонуклеолитический распад. 28 Исходя из жизненной важности этих функциональных элементов, многочисленные исследования были направлены на оптимизацию структуры мРНК, такие как разработка серии аналогов 5' cap, изменение длины поли(А) хвоста, скрининг особенностей UTR и кодирование различных функциональных пептидов или механизмов вирусной репликации в ORFs. 29
 Fig. 4 Mechanisms of mRNA decay. Degradation of messenger mRNA plays an essential role in regulating sustained mRNA expression. mRNA is generally degraded in the following three pathways: 1 Deadenylation-dependent mRNA decay: The poly(A) tail is removed by deadenylase activity (such as CCR4, CAF1 or PARN). The LSM1-7 complex associates with the 3'-end of the mRNA transcript to induce decapping by the Dcp1-Dcp2 complex and is then degraded by exoribonuclease XRN1. Alternatively, deadenylated mRNA can be degraded by exosomes. 2. Endonuclease-mediated mRNA decay: The mRNA is cleaved into two fragments, and then the fragments are degraded by XRN1 and exosomes.538 3. Deadenylation-independent pathways require recruitment of the decapping machinery. RPS28B interacts with the enhancer of decapping-3 (Edc3) to engage the decapping enzyme. Subsequently, the mRNA is degraded by XRN1538
mRNA design
The 5' cap
5' caps расположены на 5' конце мРНК с разной степенью метилирования. 30 5' caps (m 7G ppp) содержат 7-метилгуанозин (m 7G), присоединяющий следующий нуклеотид через 5'-5' трифосфатный мостик (ppp) у эукариот 31,32 (рис. 5). Cap присоединяется к eIF4E через гидрофобные катион-π взаимодействия m 7G и отрицательный электростатический заряд трифосфатного мостика во время инициации трансляции. 33 Для удаления cap трифосфатный мостик является основной мишенью фермента декапирования мРНК в эукариотических клетках. Dcp1/2 и DcpS: Dcp1/2 расщепляет α- и β-фосфат, а DcpS расщепляет β- и γ-фосфаты. 34,35 Поэтому многочисленные стратегии оптимизации структуры мРНК были применены для оптимизации m 7G или трифосфатного мостика с целью получения аналогов cap с высоким сродством к eIF4E и низкой чувствительностью к ферментам расщепления. 36 Rydzik и др. повысили устойчивость cap к расщеплению, заменив атом кислорода трифосфатов на дигалогенметиленбисфосфонат. 37 Кроме того, модификация m 7G является важным подходом для улучшения трансляции мРНК. Ранее сообщалось, что эффективность трансляции значительно повышается при замене 7-метилированного гуанозина (m 7G) на 7-бензилированный гуанозин 38 и еще в 2 раза при присоединении m 7G к другому m 7G через тетрафосфат (m 7Gppppm 7G), аналоги которого обладают более высоким сродством к eIF4E по сравнению с природными эукариотическими 5' caps 39. Мостиковые атомы кислорода между α-β или β-γ фосфатами были, соответственно, заменены на метилен, чтобы получить m 7GpCH 2ppG или m 7GppCH 2pG для предотвращения деградации мРНК под действием Dcp1/2 или DcpS. 40 Дитиодифосфатная модификация также вводится в три- или тетрафосфатный мостик, что снижает чувствительность caps к Dcp1/2 и улучшает трансляцию мРНК.3 6 Кроме того, фосфоротиоатные аналоги cap повышают стабильность и трансляционную эффективность РНК-вакцин в незрелых дендритных клетках (DCs). 41 Примечательно, что фосфоротиоатная замена чувствительна к положению, что, возможно, связано со стереохимией в катализе. 36
 Fig. 5
Commercialization and commonly used Cap. The 5' cap of mRNA is critical to improve mRNA stability and promote translation efficiency. Modification of the 5'-5' phosphate bridge can increase the resistance to DcpS and Dcp1/Dcp2, but the translation efficiency may not necessarily increase (such as the introduction of methylene groups on the phosphate bridge). The modification of ribose nucleosides also plays essential functions in mRNA translation by recruiting translation initiation factors, such as the methylation modification on the N7 position of the guanosine cap and the ribose-2?O position of the first nucleotide (Cap 1), increasing the affinity for eIF4E and thereby improving translation efficiency116,539 The poly(A) tail
Poly(A) хвосты обычно состоят из 10-250 адениновых рибонуклеотидов. Хвосты поли(А) являются динамическими дополнениями к мРНК, их длина играет решающую роль в регуляции эффективности трансляции мРНК и экспрессии белка.42,43 Механически, 3' -концевой поли(А) хвост соединяется с PABPs и впоследствии взаимодействует с 5-концевой частью через факторы инициации трансляции eIF4G и eIF4E, что способствует формированию "замкнутой структуры" и регулирует эффективность трансляции мРНК.44 Mockey et al. первыми наблюдали положительную корреляцию между длиной поли(А) хвостов и эффективностью трансляции, добавляя поли(А) хвост из 100 вместо 64 аденозинов в цис-положении, увеличивая уровень белка приблизительно в 35 раз.45 Аналогичным образом, поли(А) длиной 120 единиц более способствует образованию стабильной и эффективной трансляции мРНК по сравнению с хвостами длиной 51 нт и 42 нт,46 а 325-нуклеотидный хвост поли(А) показывает более высокую эффективность, чем 172-нуклеотидный хвост.47 Интересно, что длина поли(А) не всегда положительно коррелирует с нестабильностью и ослаблением мРНК. Традиционно считается, что хвосты поли(А) должны содержать не менее 20 нт для достижения достаточной трансляции мРНК, однако хвосты поли(А) стабилизирующего β-актина составляют менее 20 нуклеотидов, а хвосты поли(А) длиной 425 нт и 525 нт вносят больший вклад в эффективность трансфекции, чем 120 нт хвосты поли(А) в первичных Т-клетках человека.47-49
5'-UTRs и 3'-UTRs
UTRs на 3' и 5' концах мРНК не кодируют непосредственно белки, но играют важную роль в регуляции трансляции мРНК и экспрессии белков.50 UTRs участвуют в субклеточной локализации мРНК, регулируют эффективность трансляции и стабильность мРНК.51 Как 5'-UTR, так и 3'-UTR регулируют уровень экспрессии белка, причем 5'-UTR в основном участвует в инициации процесса трансляции,52 а 3'-UTR в основном влияет на стабильность и период полураспада мРНК.53 Cap 5' запускает связывание рибосом и впоследствии распознает последовательность инициации синтеза белка во время трансляции. Кроме того, внутреннее место входа в рибосомы 5'-UTR также может привлекать рибосомы и инициировать трансляцию независимым от cap и eIF4E образом.54 Самая сильная последовательность Kozak широко используется для улучшения трансляции мРНК. Foroughmand et al. улучшили экспрессию белка, заменив последовательность Kozak в 5'-UTR бета-глобина человека на самую сильную последовательность.55 Для проверки влияния UTR на экспрессию терапевтической мРНК была создана библиотека из 10 вариантов UTR, и было обнаружено, что 5'UTR, содержащие фактор комплемента 3 (C3) и цитохром p4502E1, значительно увеличивают трансляцию белка независимо от модификаций 3'UTR.56 Подобным образом оптимизация 3'-UTR может также повысить стабильность мРНК и длительность трансляции. Стабильность мРНК повышается благодаря прерывистой пиримидин-богатой последовательности в 3'-UTR ?-глобина, а α-глобин в мРНК способствует увеличению продолжительности экспрессии белка.57,58 Разработаны более эффективные стратегии для увеличения производства белка и стабильности мРНК путем добавления двух последовательных 3'-UTR β-глобина, расположенных голова к хвосту, к мРНК по сравнению с одним β-глобиновым 3'-UTR. Примечательно, что улучшение зависит от типа клеток: экспрессия белка значительно увеличивается в зрелых DCs, но незначительно - в незрелых.46 И наоборот, мРНК eGFP с двумя повторяющимися β-глобиновыми 3'-UTR производит меньше белка, чем мРНК с β-глобиновыми 5'-UTR в человеческих плюрипотентных стволовых клетках (PSCs).59 Однако два повторяющихся цитохром b-245 альфа полипептида (CYBA) 3'-UTR производили меньше белка в клетках A549 по сравнению с одним 3'-UTR.60 Более того, 5'-UTR и 3'-UTR влияют друг на друга и на экспрессию белка.56 В целом, 5'-UTR вносит свой вклад в регуляцию экспрессии белка в зависимости от систем и типов клеток.
Trepotec и др. разработали серию коротких 5'-UTR путем вставки или изменения менее двух рибонуклеозидов на основе последовательности Козака. Две короткие 5'-UTR были либо лучше, либо одинаково эффективны, чем 5'-UTR альфа-глобина человека.61 Ferizi и др. оценили UTRs пяти природных долгоживущих мРНК и обнаружили, что UTRs из CYBA человека имеет самую высокую и стабильную экспрессию белка в клетках NIH3T3 и A549.60 Schrom и др. сравнили эффективность минимальной 5'-UTR, 5'-UTR альфа-глобина человека и 5'-UTR CYBA, что привело к более высокой экспрессии белка за счет оптимизации кодирования.62 Segovia и др. пытались уменьшить иммунную стимуляцию мРНК с помощью 5'-UTR из вируса венесуэльского лошадиного энцефалита (VEE).63 Asrani и др. использовали плазмиды и IVT мРНК для скрининга эффективных UTR, при этом они обнаружили различную экспрессию белка под действием плазмид и IVT мРНК в клетках HepG2.56 Примечательно, что исследователи пытались разработать эффективные UTR с помощью биоинформации и машинного обучения.64,65
The open reading frame
Дизайн ORF в основном сосредоточен на оптимизации кодонов и введении функциональных пептидов, а также на процессах репликации.66 Оптимизация кодонов - широко используемый, но спорный подход для улучшения трансляции.67 Эффективность трансляции мРНК была улучшена путем замены редких кодонов на синонимичные кодоны, декодируемые тРНК с более высоким содержанием в ORF,68,69 но это может изменить конформацию белка и привести к появлению новых пептидов с неизвестной биологической активностью in vivo.68,70. Увеличение содержания GC путем замены редких кодонов в ORFs защищает мРНК от деградации эндорибонуклеазой и усиливает экспрессию белка мРНК in vivo.71,72 Кроме того, функциональные пептиды имеют решающее значение для лекарственных препаратов мРНК, а сигнальные пептиды, кодируемые мРНК, необходимы для белков, выполняющих функции вне клеток.73 Соответственно, необходима оптимизация мРНК для улучшения функции терапевтических мРНК путем введения сигнальных пептидов в области ORF. Сигнальные пептиды и белковые сегменты также широко применяются для улучшения презентации антигена в мРНК-вакцинах.74 Kreiter и др. улучшили свойство транспортировки белковых антигенов путем кодирования сигнала секреции и трансмембранного цитоплазматического домена молекулы MHC I в ORF, что увеличило презентацию антигена в DCs в ~10 раз и повысило противоопухолевую эффективность мРНК-вакцин у мышей.75 Для усиления цитоплазматической экспрессии используются и другие функциональные пептиды: β2-микроглобулин молекул MHC I и сигнальный пептид лизосомально-ассоциированного мембранного белка DC.76 Вместе взятые, контроль качества мРНК на каждом этапе напрямую связан с ее эффективностью; поэтому производство и подготовка мРНК является ключом к терапевтическим препаратам на основе мРНК.
RNA chemical formula design
Self-amplifying RNA
По сравнению с обычной мРНК, self-amplifying RNA (saRNA) - это еще один вид молекул мРНК с другой структурой.77,78 saRNA в основном происходит из структур альфавирусов и создается путем замены последовательности генов, кодирующих структурные белки вируса, на последовательность интересующего гена.79 Альфавирусы - это одноцепочечные РНК-вирусы с положительным смыслом, обладающие способностью к саморазмножению, которое осуществляется за счет последовательности нуклеотидов, кодирующих неструктурные белки (nsP1-4).80 Эти неструктурные полипротеины функционируют как репликазы и реплицируют структурные белки вируса посредством РНК-зависимого синтеза РНК.81 Поэтому saRNA может эффективно производить большое количество интересующего белка, используя врожденную природу альфавирусов.
Основными элементами saRNA являются 5'cap, 5'-UTR, последовательность, кодирующая nsP1-4, субгеномная промоторная последовательность, ORF с GOI, 3'-UTR и 3' поли(A) хвост.82 Основное отличие saRNA от обычной мРНК заключается в последовательности репликазы. Функции отдельных nsP1-4 были частично раскрыты: nsP1 играет роль в capping, nsP2 приобретает хеликазную активность, nsP3 необходим для сборки комплекса репликации и может взаимодействовать с другими белками для предотвращения ингибирующего давления клетки-хозяина, а nsP4 приобретает активность РНК-зависимой РНК-полимеразы.83-87 Все неструктурные белки играют существенную роль в функционировании saRNA. После трансфекции saRNA в клетку последовательность nsP1-4 транслируется в полипротеин nsP1-4, который функционирует как предшественник комплекса репликазы, а затем полипротеин nsP1-4 расщепляется nsP2 с образованием полипротеина nsP1-3 и nsP4. 85 Этот образовавшийся комплекс ранней фазы репликазы транскрибирует исходную положительно сенсибилизированную нить РНК в отрицательно сенсибилизированную нить РНК, а последняя затем используется в качестве шаблона для последующей репликации.88,89. После дальнейшего расщепления полипротеина nsP1-3 на отдельные nsP1, nsP2, nsP3, вместе с nsP4 они образуют расщепленную репликазу, преимущественно участвующую в синтезе положительных нитей.90,91
Самым большим преимуществом saRNA является "щадящий" эффект. Исследователи из Имперского колледжа Лондона получили saRNA, кодирующую белок S, в липидной наночастице (LNP) в качестве вакцины против SARS-CoV-2, показав высокую эффективность в индуцировании нейтрализующих титров антител.92 Такой же эффект был продемонстрирован и в мРНК-вакцинах против ZIKV93 и гриппа.94 Однако основной проблемой для saRNA является ее более длинная последовательность (обычно 9-12 kb) по сравнению с обычной мРНК. Некоторые исследователи приложили определенные усилия для решения этой проблемы. Beissert и др. разработали новую двухстороннюю векторную систему с использованием трансамплифицирующей РНК.95 Векторная система разделяется на две нити; одна кодирует репликазу с ее ферментной активностью, обеспечиваемой второй нитью, а другая кодирует GOI, который будет трансамплифицирован первой нитью.96 Эта работа по структуре saRNA показала такую же эффективность, как и одновекторная система, обеспечивая при этом простой, экономичный по времени и затратам процесс производства. Li и др. оптимизировали репликон, определив шесть мутаций в неструктурных белках репликона VEE, которые способствовали экспрессии субгенома в клетках.97 В целом, saRNA является привлекательным инструментом для временной экспрессии целевого белка, создания стабильных клеточных линий, экспрессирующих гетерологичные белки из постоянно реплицирующейся РНК, и разработки рекомбинантных вакцин.79,98. Например, Li и др. использовали saRNA для одновременного кодирования легкой и тяжелой цепей нейтрализующего анти-SARS-CoV-2 CB6 антитела под контролем двух одинаковых субгеномных промоторов.99 Вместе взятые, saRNAs имеют большие абсолютные преимущества в непрерывной экспрессии белков и длительной эффективности по сравнению с другими химическими формулами РНК, но большая последовательность нуклеиновых кислот ограничивает ее применение. Поэтому эта перспективная технология все еще остается сложной.
Circular RNA, noncoding RNAs, and competitive endogenous RNA
Циркулярные РНК (circRNAs) - это одноцепочечные, ковалентно замкнутые молекулы РНК, которые повсеместно встречаются у разных видов - от вирусов до млекопитающих. ЦиркРНК, действующие как белковые приманки, каркасы и рекрутеры, выполняют биологические функции, выступая в качестве регуляторов транскрипции микроРНК у губок и белковых шаблонов. Циркулярные РНК образуется путем обратного сплайсинга, при котором 3'-конец экзона присоединяется к 5'-концу своего или вышележащего экзона через 3',5'-фосфодиэфирную связь, образуя закрытую структуру.100 Уникальная структура циркРНК придает им большую стабильность, более длительный период полураспада и большую устойчивость к РНКазе Р, что является недостатком линейных мРНК и является желательным.101 Некодирующие РНК (ncRNA) - это молекулы РНК, которые не транслируются в белок, но влияют на нормальную экспрессию генов и развитие заболеваний, включая микроРНК, интронные РНК, повторяющиеся РНК и длинные ncRNA.102 LncRNA функционируют как конкурирующие эндогенные РНК (ceRNAs), конкурентно занимая общие связывающие последовательности для miRNAs.103 ЦиркРНК Cdr1as функционирует как конкурентная эндогенная РНК, способствующая прогрессированию гепатоцеллюлярной карциномы (ГЦК).104 Исследования показали, что сложная сеть circRNA-miRNA-mRNA выявила важную роль в регуляции инфекции вируса Hantaan.105 Регуляторная сеть circRNA-lncRNA-miRNA-mRNA ceRNA была идентифицирована как новые прогностические маркеры для острой миелоидной лейкемии (AML).106 В настоящее время терапия на основе ncRNA в основном регулирует экспрессию ключевых белков для лечения заболеваний. Терапевтический потенциал ncRNA был признан более сорока лет назад, но лишь немногие препараты получили одобрение из-за высоких внецелевых эффектов.107 Хотя нет никаких сообщений о стратегии комбинированной терапии мРНК и цирРНК или ncRNAs. Это может быть важным средством для достижения точного и индивидуализированного лечения путем их совместной доставки для формирования регуляторной сети или комплекса, что заслуживает дальнейшего изучения.
mRNA manufacture
mRNA synthesis and optimization
IVT мРНК осуществляется с линеаризующимися шаблонами плазмидной ДНК или шаблонами PCR, требующими, по крайней мере, промотора и соответствующей последовательности конструкции мРНК.2,108 IVT мРНК осуществляется с добавлением полимераз (T7, T3 или SP6), но требует дополнительного capping.108 Некэпированная мРНК быстро разрушается РНКазой и содержит 5'-ppp группу, которая вызывает большую иммунную стимуляцию и может быть обработана фосфатазой для снижения нежелательной эффективности.109,110 Для capping IVT мРНК применяются два метода: ко-транскрипционное capping и посттранскрипционное capping.111,112 Смеси cap-динуклеотидов, содержащие четыре других нуклеозидтрифосфата (NTP), включаются на 5' конце РНК с помощью РНК-полимеразы во время ко-транскрипционного capping.113 Был описан метод без метки для идентификации 5'-концевого cap и ориентации мРНК.114 Обработка ко-транскрипционного capping позволила координировать транскрипцию с capping мРНК, но ее недостатками является конкурентное включение нуклеозидов GTP, что снижает эффективность capping.111
Интересно, что GTP сначала связывается с цепями РНК через 5'-5' трифосфатную связь, а затем происходит 7-метилирование 5' терминального гуанозина при посттранскрипционном capping.115 Для capping мРНК широко используются cap-ферменты из вируса вакцины, они обладают высокой эффективностью capping концов и способны полностью capping мРНК с помощью cap-0.116 Кроме того, необходимо учитывать иммуногенность мРНК, поэтому для получения cap-1 или cap-2 на основе cap-0 используется cap-специфическая 2'-O метилтрансфераза, что снижает иммуногенность мРНК.117,118. Полимераза инициирует транскрипцию путем нуклеофильной атаки 3'-OH гуанозина в m7G на α-фосфат следующего нуклеозидтрифосфата, заданного шаблоном ДНК, когда мРНК кэпирована, и генерирует m7GpppGpG.119 Примечательно, что m7GpppGpG образуется, когда эта атака происходит на 3'-OH m7G, в результате чего образуется обратная связь, из-за чего приблизительно 50 процентов мРНК capping в обратном направлении, не распознаются рибосомой и препятствуют общей активности трансляции мРНК.120-124 Как правило, синтезируются аналоги антиреверсивных caps, модифицирующие часть m7G caps в положении 2' или 3' (2'-O-метил, 3'-O-метил, 3'-H), что инициирует эксклюзивное включение cap в правильном направлении и повышает эффективность трансляции125.
Поли(А) хвосты IVT мРНК обычно кодируются в ДНК-шаблоне или присоединяются к IVT мРНК путем ферментативного полиаденилирования, причем в первом случае длина поли(А) хвостов контролируется более точно.2,46. Примечательно, что фермент рестрикции типа II для линеаризации плазмидного шаблона способствовал образованию нависания на 3' конце поли(А)-хвоста, когда поли(А)-хвостовой участок был закодирован в шаблонном векторе, что препятствовало трансляционной эффективности мРНК IVT. Этого необходимо избежать, заменив фермент рестрикции типа II на ферменты рестрикции типа IIS.46,126
mRNA purification
IVT мРНК после синтеза смешивается с РНК-полимеразой и ДНК-шаблонами, поэтому необходимо очистить IVT мРНК, включая удаление иммуностимулирующих загрязнений, свободных рибонуклеотидов, короткой мРНК и ДНК-шаблонов.127 Обычно для разрушения избытка ДНК-шаблонов используется ДНКаза. Для очистки и разделения синтезированной мРНК часто используются коммерческие наборы для очистки, после чего проводится осаждение с использованием этанола или изопропанола, что позволяет удалить большинство загрязняющих веществ и получить мРНК высокой чистоты, а затем мРНК осаждается высокой концентрацией LiCl или осаждением на основе спирта, хроматографические методы (молекулярно-эксклюзионная хроматография, ионообменная хроматография или аффинная хроматография с иммобилизованным олиго-dT), или элюирование с колонки с кремнеземной мембраной, которая удаляет белки, свободные нуклеотиды или другие компоненты, но не примеси dsRNA.128 Для удаления примесей dsRNA из раствора реакции транскрипции Kariko и др. использовали обращенно-фазовую HPLC для очистки мРНК, что способствовало резкому увеличению экспрессии белка в 1 000 раз и полностью устранило иммунный ответ модифицированной мРНК. Однако этот метод не подходит для масштабируемого или более крупного производства мРНК.108,129
РНКаза III, новый метод очистки, был предложен для устранения загрязнений dsRNA, и было показано, что он значительно снижает иммуногенность мРНК и повышает цитотоксическую эффективность CAR T-клеток путем электропорации РНКазы III в CAR T-клетки. Потенциальным недостатком является то, что РНКаза III может расщеплять двухцепочечную вторичную структуру, образованную одноцепочечной РНК.130 Недавно была предложена хроматография на целлюлозе для очистки мРНК IVT от микрограммов до миллиграммов и получения больших мРНК до 4 кб без специального оборудования и токсичности, а все материалы для нее одноразовые, что исключает риск перекрестного загрязнения по сравнению с HPLC Кроме того, хроматография на целлюлозе показала более высокую эффективность в восстановлении и очистке мРНК IVT. Наконец, короткие РНК могут быть удалены с помощью денатурирующего полиакриламидного гель-электрофореза, а длинные РНК могут быть отделены с помощью денатурирующего агарозного гель-электрофореза.108,131 В целом, для очистки мРНК могут быть выбраны различные методы с разными требованиями к чистоте и масштабами, которые должны определяться целью исследования или применения. Очевидно, что независимо от метода, используемого для очистки, строгие стандарты контроля качества мРНК являются основой для обеспечения максимальных преимуществ мРНК-терапевтических препаратов.
mRNA delivery systems
Исследователи изначально демонстрировали негативное отношение к терапевтическому потенциалу мРНК из-за ее нестабильности в ранних исследованиях.132 Доставка мРНК остается большой проблемой для современных терапевтических препаратов на основе мРНК. Во-первых, мРНК, будучи отрицательно заряженной макромолекулой (примерно 1-15 кб), с трудом преодолевает анионную клеточную мембрану.13 Во-вторых, средний внутриклеточный период полураспада мРНК составляет всего около 7 ч.133 . Кроме того, большое количество мРНК после попадания в эндосомы задерживается в них и не может просочиться в цитоплазму для выполнения функций трансляции, хотя голую мРНК трудно интернализировать через эндоцитоз, опосредованный рецепторами-scavenger.134 Для достижения идеальной потенции мРНК, обеспечения защиты мРНК и облегчения ее поглощения клетками, а также выхода из эндосом, необходимы подходящие системы доставки, такие как липосомы и полимеры. Кроме того, она должна обладать низкой токсичностью и иммуногенностью.135 Вдохновляет то, что мРНК может быть точно доставлена в гепатоциты, клетки Купфера и эндотелиальные клетки печени.8
Механизмы загрузки мРНК, вероятно, включают электростатические взаимодействия, водородные связи или координационные взаимодействия при гидратации тонкой пленки, нанопреципитации или микрофлюидическом смешивании. Для улучшения доставки мРНК были разработаны и синтезированы различные векторы, включая LNP, полимерные наночастицы, катионные наноэмульсии (CNEs) и другие системы доставки 136 (рис. 6). Оптимизация систем доставки мРНК позволит значительно повысить эффективность и активность трансфекции мРНК, что является неотъемлемым этапом для разработки лекарств на основе мРНК. Yang и др. создали LNPs с использованием холестерина с модификацией катионным пептидом DP7 (VQWRIRVAVIRK), что улучшило внутриклеточную доставку мРНК и иммунную стимуляцию DCs. 137 Wang и др. использовали оксид графена и полиэтиленимин (PEI) для создания инъекционного гидрогеля, который нес мРНК-кодирующую овальбумин и адъювант R848. Вакцина с мРНК подавляла рост опухоли в модели меланомы B16-OVA. 138 Phua и др. использовали наночастицу из мезопористого кремнезема для инкапсуляции мРНК и ингибитора РНК-активируемой протеинкиназы C16. C16 усилила трансляцию мРНК, и вакцина значительно подавила рост опухоли. 139 Huang и др. использовали мРНК, кодирующую конститутивно активную мутацию стимулятора генов интерферона (STING), что усилило иммунный ответ, индуцированный мРНК-вакцинами. 140
 Fig. 6
Positively charged lipids in mRNA-loaded lipid nanoparticles. The most widely used carrier of mRNA preparations is LNPs. Positively charged lipids play a vital role in LNPs because LNPs encapsulate mRNA through electrostatic adsorption between lipids and mRNA. These lipids can be classified into cationic lipids and ionizable lipids according to the generation of a positive charge. Furthermore, ionizable lipids can be divided into single-charged lipids and multicharged lipids. Here, we listed the representative lipids used in LNPs, including DOTMA, DOTAP, DSTAP, DMTAP, DDA, DOBAQ, DC-Chol,8,171 DLin-MC3-DMA,540 SM-102,67 A6,163 ALC-0315,541 and Lipid 5.151 Multicharged lipids in LNPs include C12-200,512 5A2-SC8,166 cKK-E12,542 G0-C14,151 OF-2,157 306Oi10,154 OF-Deg-Lin,158 92-O17S,160 OF-C4-Deg-Lin,543 A18-Iso5-2DC18,165 TT3,544 BAMEA-O16B,545 FTT5,546 Vc-Lipid,546 C14-4,161 Lipid 14,287 4A3-Cit,547 and ssPalmO-Phe548 Ввиду обширной литературы, мы лишь кратко представили текущие разработки в области векторов доставки мРНК. Мы перечислили некоторые типичные векторы, которые связывают мРНК с различными взаимодействиями и образуют формулы с помощью различных методов подготовки, а также кратко описали векторы доставки и адъюванты, полезную мРНК, эффективность трансфекции, модель заболевания или показания, пути введения и барьеры для доставки мРНК.
Lipid nanoparticles
Cationic lipid nanoparticles
Катионные липиды широко используются для доставки мРНК, включая N-[1-(2,3-диолоилокси)пропил]-N,N,N-триметиламмоний хлорид (DOTMA), 1, 2-диолоилокси-3-триметиламмоний пропан хлорид (DOTAP), 1,2-стеароил-3-триметиламмоний пропан (DSTAP) и 1,2-димиристоил-3-триметиламмоний пропан (DMTAP).141 Совместная доставка мРНК и gardiquimod с помощью гибридного вектора наночастиц с поли(молочно-гликолевой кислотой, PLGA)-ядром/DOTAP-оболочкой не только повысила эффективность трансфекции мРНК, но и вызвала сильный иммунный ответ в селезенке и тем самым подавила рост опухоли у мышей с опухолями меланомы B16-OVA.142 Исследование показало, что использование катионных липидов диметилдиоктадециламмония (DDA), DOTAP, DMTAP, DSTAP, N-(4-карбоксибензил)-N,Nдиметил-2,3-бис (олеоилокси) пропан-1-аминия (DOBAQ) и 3' -[N-(N',N'-диметиламиноэтан)-карбамоил] холестерин (DC-Chol) в сочетании с 1,2-диолеоил-сн-3-фосфоэтаноламином (DOPE) для формирования LNP доставляли мРНК RVG, включая индуцирование сильных гуморальных и клеточно-опосредованных иммунных ответов у мышей143. Катионные липосомы DOTAP/Chol/DSPE-полиэтиленгликоль (PEG) были использованы для инкапсуляции мРНК цитокератина9, что вызвало сильный клеточный иммунный ответ и подавило рост опухоли в агрессивной модели рака легких Льюиса при интраназальной иммунизации.144 Липосомы DOTAP, модифицированные маннозой, были использованы для вызывания гуморального и клеточного иммунного ответа для лечения вируса гриппа H1N1.145 Огромные преимущества систем доставки мРНК на основе липидных наночастиц, включая их высокую стабильность, эффективность трансфекции, эффективность, безопасность и дешевизну производства, позволили разработать вакцины и лекарства на основе мРНК с беспрецедентной скоростью и создать мощный инструмент борьбы с болезнями146.
Ionizable lipid nanoparticles
Ионизируемый аминолипид Dlin-MC3-DMA (MC3) был использован для клинической доставки siRNA при лечении транстиретин-опосредованного амилоидоза. Дальнейшие исследования показали, что соединение, состоящее из MC3 и липидов (DSPC, холестерин, DMG-PEG2000 и DSPE-PEG2000), было использовано для доставки мРНК IL-10 в качестве терапии воспалительных заболеваний кишечника, которое экспрессировало противовоспалительный цитокин IL-10 в Ly6c+ воспалительных лейкоцитах и облегчала симптомы в модели колита, вызванного сульфатом декстрана натрия147. Коррекция генетической дисперсии трансмембранного регулятора проводимости муковисцидоза (CFTR) является эффективной целью для лечения муковисцидоза. Robinson и др. загрузили мРНК CFTR в систему доставки MC3 в эпителиальные клетки бронхов пациента и восстановили основную функцию CFTR как хлоридного канала.148 Клинически значимые LNPs, состоящие из MC3, DSPC, холестерина, DMG-PEG2000 и мРНК, были трансфецированы в 30 клеточных линий, и эти данные показали, что различная эффективность трансфекции разных клеточных линий зависит от раннего и узкого окна выхода из эндосомы.149 Li и др. также использовали LNPs MC3, ковалентно конъюгированные с мРНК, инкапсулированной антителом αPV1, для специфического воздействия на легкие путем связывания белка, соединенного с плазматическими везикулами.150
Sabnis и др. разработали и синтезировали новую серию аминолипидов, аналогичных MC3, для эффективной доставки мРНК после однократного и многократного дозирования путем введения сложноэфирных связей в хвосты липидов и изменения положения сложноэфирных связей для достижения оптимальной химической стабильности, тканевого клиренса и эффективности доставки мРНК.151 Kimberly и др. синтезировали ионизируемые липиды с высокой переносимостью и сниженной стимуляцией врожденного иммунитета для мРНК при внутривенном введении, эти данные указывают на то, что различные пути введения приведут к различной экспрессии белка.152 Кроме того, были разработаны и исследованы деградирующие или недеградирующие липоиды для внутривенной или местной доставки мРНК в целевые ткани и клетки. Небольшая библиотека липоидов с использованием 3,3'-диамино-N-метилдипропиламина была разработана для реакции с 11 насыщенными алкилакрилатными хвостами, длина которых варьировалась от 6 до 18, показав, что липоид 306Oi10 с одноуглеродным ответвлением в хвосте обеспечивает десятикратное улучшение по сравнению с липоидом 306O10 с прямым хвостом, эффективность которого, содержащего наночастицы 306Oi10, ионизируется при эндосомальном рН 5,0, что благоприятно сказывается на доставке мРНК153. И мРНК, и siRNA были инкапсулированы в липоидную наночастицу, состоящую из 306Oi10, холестерина, DSPC, DOPE и PEG-липида, чья одноывременная доставка с мРНК и siRNA не только улучшает генное подавление siRNA, но и может способствовать экспрессии белка мРНК154.
Наночастицы, содержащие cKK-E12 и девять различных вариантов холестерина, были приготовлены для доставки мРНК, и результаты показали, что окислительное положение холестерина влияет на нацеливание наночастиц, адсорбируя различные белковые короны на LNP, и что наночастицы, включающие 20α-OH холестерин, могут нацеливаться на печень.155 Кроме того, система доставки cKK-E12 защищала мРНК trastuzumab от деградации и обеспечивала эффективную доставку in vivo, что значительно задерживало рост HER2-положительного рака молочной железы.156. OF-02, полученный путем изменения липидных хвостов cKK-E12, производил в два раза больше эритропоэтина, чем cKK-E12.157 OF-Deg-Lin, ионизируемый липид, изменяющий локальную структуру OF-02 от 1,2-аминоспирта до деградирующей сложноэфирной связи, доставляет мРНК в селезенку, вызывая экспрессию белка в популяции В-клеток.158 OF-C4-Deg-Lin был синтезирован путем изменения длины углеродных связей OF-Deg-Lin, специально нацеленных на селезенку.159 Хорошо известно, что большинство систем доставки мРНК имеют низкую эффективность трансфекции в первичных Т-лимфоцитах. Липоиды на основе имидазола, которые были отобраны из библиотеки липидосодержащих комбинаций аминных головок и деградирующих хвостов, содержащих S/S-S/Se/Se-Se, могли доставлять мРНК в первичные Т-лимфоциты.160
Аналогичным образом была синтезирована серия пиперазин-центрированных соединений, которые были выбраны в качестве векторов CAR мРНК для первичных Т-клеток человека.161 Для новизны, батарея катионных липид-модифицированных аминогликозидов на основе коммерчески доступных аминогликозидов была синтезирована для специфической доставки Luc мРНК в печень.162 Многие деградирующие и биосовместимые производные холестерина (OCholB липиды), содержащие дисульфидные связи в хвосте, были созданы для воздействия на легкие и селезенку.163 Аналогичным образом, липидомиметики (A1-A6), содержащие алкиновые и сложноэфирные группы в хвостах, были получены путем изменения структуры Dlin-MC3-DMA для повышения туморигенности и облегчения выхода из эндосом, которые совместно образовывали липидомиметики для эффективного лечения почечной анемии.163 Ионизируемые LNPs на основе липида iBL0713 для доставки мРНК EPO продемонстрировали эффективность, сравнимую с составами на основе Dlin-MC3-DMA, в печени.164
Lipid nanoparticles with immunostimulatory potency
Miao и др. разработали липидозы с циклическими аминогруппами, которые активируют внутриклеточный путь STING, а LNPs, состоящие из STING-активируемых циклических липидов и мРНК OVA, значительно продлевают выживаемость и повышают противоопухолевую эффективность165.
Использование дендримерных LNPs на основе 5A2-SC8 для инкапсуляции терапевтической мРНК FAH с целью получения белка FAH значительно увеличивает выживаемость мышей с нокаутом FAH, страдающих от HT-1.166 Выбор LNPs на основе C12-(2-3-2)- для инкапсуляции мРНК, кодирующей ангиотензин-превращающий фермент 2 (ACE2), существенно ослабляет фиброз печени и легких.62 Редокс-реактивная платформа NP, состоящая из G0-C14, гидрофобного редокс-реактивного цистеинового поли(дисульфид амида) (PDSA) и липида-PEG, использовалась для доставки мРНК, кодирующей p53, критический ген-супрессор опухоли, для лечения HCCs и не-мелкоклеточного рака легких (NSCLCs).167 Для доставки мРНК в клетки нейронов мозга и астроциты также применялась серия липидоподобных материалов на основе витамина Е, расщепляемых протонами.168 Кроме того, липидоподобные наночастицы TT3 (TT3 LLNs) были использованы для совместной доставки мРНК и контрастных агентов МРТ.169 Аналогичным образом, система LNP на основе дендримеров с терагностической формулой 4A3-SC8, pH-реактивным PEGylated BODIPY dyes (PBD)-липидом и PBD была создана для доставки мРНК и экспрессии белка в печени, что является перспективной системой доставки для диагностики и лечения заболеваний и рака печени.170
Polymetric nanoparticles
Полимерные соединения и их производные могут быть синтезированы из природных или синтетических материалов, что позволяет получить широкий спектр возможных структур и характеристик.171 PEI является одним из самых мощных невирусных векторов для доставки генов. Однако PEI очень токсичен и не разлагается, что ограничивает его применение, поэтому были синтезированы PEI-g-PEG с различными терминальными группами PEG и степенью приживленияи PEG, и они достигли удовлетворительной эффективности для доставки мРНК в легкие.172 Dunn и др. также продемонстрировали полимеры PEI1800-LinA5-PEG0.3, модифицировав PEI-инкапсулированную мРНК и нацелив ее на эндотелий легочных микрососудов.173 Поли (β-аминоэфиры) (PBAE), биосовместимый и биоразлагаемый полимер, были синтезированы и использованы для доставки мРНК в эндотелий легких и в легочные иммунные клетки.174 Серия олигопептидных концевых модифицированных PBAEs (OM-PBAEs) с функциями выхода из эндосомы и проникновения в цитоплазму для трансфекции мРНК была применена для специфического нацеливания на ткани печени.175 Полимеры гиперразветвленных поли(бета-аминоэфиров) (hPBAEs) были применены для доставки мРНК к эпителию легких через ингаляцию и произвели достаточное количество белка в легких при безопасности и совместимости.176 Аналогично, был создан новый PBAE на основе PCL для доставки мРНК в селезенку путем внутривенной инъекции.177 LNP APE могут доставлять мРНК в эндотелий легких, гепатоциты печени и антигенпредставляющие клетки селезенки (APCs) с высокой эффективностью трансфекции.177 Charge-altering releasable transporters (CARTs), вид экономичного и биоразлагаемого полимера, изначально были положительно заряженными полимерами, которые могут эффективно загружать мРНК и улучшать физические свойства посредством деградирующей, нейтрализующей заряд внутримолекулярной перестройки, высвобождая таким образом функциональную мРНК и транслирующий белок в клетках178. CART, применяемые для доставки мРНК, направлены не только на профессиональные APC, но и на местные APC.179 CARTs использовались для доставки мРНК, которая (кодирующая костимулирующие и иммуномодулирующие факторы, включая OX40 L-, CD80- и CD86-кодирующие) значительно подавляла рост опухоли в моделях опухолей A20 и CT26.180 Более того, полимер PEG[Glu(DET)]2, принятый Schumann, защищал и доставлял мРНК FS-344, способную экспрессировать белок фоллистатин FS-315, для лечения мышечной атрофии путем подкожного введения.181 Была синтезирована серия амфифильных полиаспартамидных производных PAsp (DET/R) для доставки мРНК в мозг мыши Ai9 путем интрацеребровентрикулярной и интратекальной инъекции.182 PEG полиаминокислотный блок-сополимер PEG-PAsp (DET) был разработан для доставки мРНК мозгового нейротрофического фактора для лечения травмы спинного мозга с удовлетворительным восстановлением.183 Кроме того, для доставки мРНК использовались некоторые материалы, полученные из пептидов. Например, комплексы PEG12KL4/мРНК были сформулированы в сухой порошок методами распылительной сушки и распылительной сублимационной сушки для интратрахеального введения;184 RALA, проникающий в клетки пептид, был применен для доставки антиген-кодирующей мРНК в иммунную систему.185 Усовершенствованный липовый полиплекс, содержащий TriMan-lip (триманнозилдиэфирный липид), Lip1, Lip2 и PEG HpK, был разработан для доставки мРНК для подавления роста опухоли и продления выживания мышей.186
Cationic nanoemulsion
CNE были предложены в качестве потенциальной системы доставки нуклеиновых кислот в 1990187 годах, и на сегодняшний день доказано, что они эффективно доставляют нуклеиновые кислоты для лечения различных заболеваний. Добавление катионных липидов в состав препарата необходимо для комплексирования нуклеиновых кислот посредством электростатических взаимодействий, что также необходимо для повышения стабильности и эффективности трансфекции нуклеиновых кислот и защиты их от деградации нуклеазами.188 Исследования показывают, что в системе доставки самораспространяющейся мРНК (saRNA) CNE усиливала местную иммунную среду путем привлечения иммунных клеток и вызывала клеточный ответ на антитела и T-primates при относительно низких дозах (75 мкг).189
Other mRNA delivery systems
Для доставки мРНК были разработаны и другие типы векторов, включая протамин-конденсированную мРНК, экзосомы, внеклеточные везикулы (EVs), мезопористый кремнезем, CaP и т.д.190. Экзосомы, полученные из реактивных астроцитов, использовались для доставки мРНК MGMT в MGMT-негативные клетки глиомы и подавляли устойчивость к темозоломиду.181 EVs с высокоаффинным анти-HER2 scFv антителом (ML39) также применялись для доставки мРНК HchrR6 в реципиентные клетки и опухоли.191 Инкорпорированные тетрасульфидом крупнопористые дендритные мезопористые кремнийорганические наночастицы были созданы для потребления внутриклеточного GSH, тем самым усиливая трансляцию мРНК.192 Для лечения трижды негативного рака молочной железы были разработаны покрытые липидами кальцийфосфатные NPs, содержащие CaP ядро, DOPA, DOTAP и DSPE-PEG для доставки мРНК MUC1 с анти-CTLA-4 моноклональным антителом.191,193. Нуклеозидные липиды для доставки мРНК привлекли внимание общественности, поскольку мРНК может быть загружена внутрь липидов через водородное взаимодействие комплементарных пар оснований с хорошей совместимостью и безопасностью. Uchida и др. гибридизировали PEG-конъюгированный олигонуклеотид (PEG-oligoRNA) с мРНК чьлагодаря комплементарности водородной связи (20:1), чтобы получить PEGylated мРНК, которая затем была загружена в Lipofectamine LTX, и система доставки сохранила высокую степень структурной стабильности in vivo.194 Полиплексные мицеллы были разработаны путем объединения ω-cholesteryl (ω-Chol)-поли (этиленгликоль) (PEG)-поликатионных блок-сополимеров с мРНК, предварительно гибридизированной с холестерин (Chol)-связанными РНК олигонуклеотидами (Chol (+)-ОлигоРНК) для улучшения устойчивости к нуклеазам мРНК и стабильности мРНК195. Кроме того, для повышения стабильности мРНК к рибонуклеазе был разработан РНК-линкер, соединяющий 10 нт олиго-адениновые нуклеотиды (OligoA) с двумя 17 нт олигонуклеотидами.196 В целом, большинство описанных векторов доставки доставляют мРНК посредством электростатических взаимодействий или взаимодействий водородных связей. Для дальнейшего применения появились новые векторы доставки, такие как самособирающиеся наночастицы из координационного полимера с оболочкой ядра, которые использовались для доставки siRNA, микроРНК или ДНК посредством координационных взаимодействий.197-199 В целом, среди платформ доставки мРНК LNP были одобрены для клинического использования и продемонстрировали уникальные преимущества, а потенциальные кандидаты в наноматериалы продолжают появляться. Выбор системы доставки мРНК зависит от размера доставляемой молекулы мРНК, заряда и органа-мишени. У различных материалов доставки есть свои преимущества и недостатки.
In vitro and in vivo barriers to mRNA delivery
Это всегда было в центре нашего внимания: увеличение поглощения клетками, облегчение выхода из лизосом и ускорение трансляции для максимальной доступности мРНК.200 Системы доставки на основе наночастиц представляют собой перспективный подход для улучшения поглощения клетками и выхода из лизосом, которые также широко исследуются в области доставки мРНК.201 В проникновении мРНК в цитоплазму с помощью наночастиц участвуют несколько этапов: эндоцитоз, выход из лизосом и высвобождение мРНК. Клеточная мембрана является динамичным и грозным барьером для внутриклеточного транспорта.201 Наночастицы взаимодействуют с клеточными мембранами посредством различных механизмов, включая клатрин-зависимый эндоцитоз, кавеола-зависимый эндоцитоз и микропиноцитоз,202 поэтому свойства частиц, включая форму, размер, состав материала и поверхностный заряд, участвуют в клеточном поглощении.
Понимание механизма клеточного поглощения мРНК является необходимым условием для эффективной доставки мРНК. Сообщалось, что голая мРНК интернализируется рецепторами мусорщиков без материалов доставки и затем накапливается в лизосомах; минимально мРНК выходит в цитозоль и экспрессирует белки, поэтому необходимо использовать векторы для внутриклеточной доставки мРНК и преодолеть начальный энергетический барьер для поглощения мРНК.203 Стимулирование активности рецепторов мусорщиков для увеличения поглощения мРНК и содействие выходу из эндосом может повысить доступность мРНК в цитоплазме.204 мРНК должна быть высвобождена из лизосом и выведена в цитозоль для трансляции кодирующего белка и неизбежно попадает в лизосомы после микропиноцитоза и клатрин-опосредованного эндоцитоза, где кислая и богатая ферментами среда склонна к деградации наноносителя и мРНК, поэтому деградация лизосом является еще одним барьером доставки мРНК.205 В настоящее время для клинической доставки мРНК ex vivo используется электропорация, но ее недостатком является то, что разрушение мембраны при электропорации может привести к потере цитоплазматического содержимого со значительной цитотоксичностью206.
Примечательно, что образование эндосом/лизосом необходимо для функционирования экзогенной мРНК, поскольку мишень рапамицина млекопитающих на поверхности лизосом участвует в нескольких клеточных процессах, включая экспрессию белка и эффективность трансфекции мРНК. Быстрая скорость поглощения наночастиц лизосомами напрямую зависит от свойств наночастиц, поэтому для трансляции мРНК необходимо как можно быстрее покинуть лизосомы.149,207-209 Материалы наночастиц обеспечивают выход из лизосом благодаря проводимости, например, DOPE, MM27 и DLinDMA, которые широко применяются на клеточной мембране кислотно-опосредованным способом.200,201,210 Кроме того, pH-реактивные пептиды, проникающие в клетки, способствовали разрушению мембраны эндосомы и усилению экспрессии белка.211 Недавно исследования показали предварительную сборку структуры инициации трансляции мРНК, называемой рибонуклеопротеинами, посредством присущего молекулярного распознавания между мРНК, покрытой m7G, и белком eIF4E, имитируя тем самым первый шаг внутриклеточного синтеза белка, и последующую электростатическую стабилизацию рибонуклеопротеинов с помощью структурно регулируемых катионных носителей с образованием наноплексов. Этот подход значительно повысил эффективность трансфекции мРНК за счет повышения стабильности внутриклеточной мРНК и синтеза белка.200 В целом, создание прецизионных систем доставки наночастиц для терапевтических препаратов на основе мРНК является ключом к определению эффективности трансляции мРНК и повышению экспрессии мРНК.
Существует также серьезная проблема доставки мРНК in vivo.212 Голая мРНК непосредственно используется для терапии на основе мРНК; однако она уязвима для широко распространенной РНКазы in vivo. Поэтому для терапии на основе мРНК необходима система доставки.213 Исследования по векторам siRNA уже относительно зрелые. К сожалению, эти векторы для доставки siRNA и pDNA могут не подходить для доставки мРНК из-за их различных характеристик.214 Поэтому необходимо срочно разработать новые векторы доставки для достижения благоприятного переноса кровью мРНК в специфические органы или клетки-мишени, проникновения в клеточную мембрану, выхода из лизосом и экспрессии мРНК и белков.215
Имеется много сообщений об усилении поглощения мРНК, кодирующей антиген, в DCs посредством модификации клеточных рецепторов наночастиц.208 По-прежнему существуют многочисленные препятствия для поглощения и внутриклеточной транспортировки, которые определяют эффективность терапии на основе мРНК.216 DCs играют ключевую роль в иммунотерапии, которые могут эффективно поглощать, обрабатывать и представлять антигены и впоследствии вызывать гуморальный и клеточный иммунитет против различных инфекционных заболеваний и рака.217 Вакцины на основе DCs являются мощной иммунотерапевтической стратегией. Аутологичные DCs используются для загрузки антигенов путем пульсации in vitro и затем вводятся обратно пациенту для запуска иммунного ответа.218 Существует несколько стратегий доставки мРНК в цитоплазму DCs, включая электропорацию, липофекцию и sonoporation.219 Электропорация, возможно, наиболее широко используемый метод введения мРНК, который быстро вводит мРНК, кодирующую ассоциированный с опухолью антиген (ТАА), с помощью относительно слабого электрического импульса, позволяет избежать деградации мРНК под действием вездесущей внеклеточной рибонуклеазы и обеспечивает клеточный процессинг мРНК и ее презентацию на поверхности DCs220. Липофекция инкапсулирует и доставляет мРНК в DCs путем формирования липоплексов мРНК, которые впоследствии поглощаются посредством клеточного эндоцитоза, а затем липид сливается с эндосомальной мембраной, высвобождая мРНК в цитоплазму221. При стратегии сонопорации мРНК загружается в микропузырьки и непосредственно пересекает мембрану цитоплазмы через временные поры, которые создаются путем осцилляции микропузырьков и их интеграции с помощью ультразвука.222 Эффективность трансфекции и экспрессии мРНК-препаратов в DCs является ключом к терапевтической эффективности. Различные стратегии доставки способствуют различной эффективности трансфекции мРНК, а именно: электропорации (90%), липофекция (5-50%) и сонпорации (5-50%).223-225 Важно отметить, что электропорация имеет высокую эффективность трансфекции и используется для лечения различных опухолей в клинических исследованиях, включая меланому,226-228 AML,76 рак яичников и инфекционные заболевания (вирус иммунодефицита человека [ВИЧ]). 229 Кроме того, предыдущие исследования показали, что липофекция обеспечивает высокую экспрессию антигена и более эффективна в увеличении CD8+ Т-клеток в DCs, это указывает на то, что липофекция обладает мощной иммуностимулирующей активностью. Однако эффективность воспроизводимости трансфекции затрудняет внедрение GMP-стандарта производства и ограничивает клиническое применение липофекции.230 В целом, сосредоточение внимания на оптимизированных стратегиях доставки, которые преодолевают барьеры DCs, является ключом к иммунотерапии на основе мРНК.
Эффективность препаратов мРНК in vitro и in vivo не всегда совпадает. Эффективность трансфекции алкиновых липидов превосходила MC3, cKK-E12 и C12-200 in vitro, но не in vivo.163 Кроме того, инкапсуляция различных мРНК, доставляемых внеклеточно, демонстрировала различное распределение; OF-Deg-Lin LNP, нагруженные Cy5 мРНК, транспортировались преимущественно в печень, тогда как OF-Deg-Lin LNP, инкапсулировавшие FLuc мРНК, экспрессировали белок в селезенке.158 Мы предположили, что вышеупомянутые несоответствия могут быть вызваны сложной внутренней средой, включая иммунную систему, переменный кровоток, гетерогенную сосудистую сеть и нецелевые клетки, и конкретные механизмы еще требуют дальнейшего изучения.
Тканевая адресная доставка терапевтических препаратов на основе мРНК необходима для эффективной доставки мРНК in vivo.67 Системы доставки могут обеспечить гораздо более эффективную и адресную доставку препаратов на основе мРНК, включая высвобождение лекарств, которое запускается в зависимости от конкретной микросреды и физико-химических свойств векторов мРНК, играющих важную роль в их системной доставке и биораспределении.231 Создание прецизионных наночастиц для доставки лекарств на основе мРНК получило широкое клиническое применение и было разработано для преодоления биологических барьеров.171 Наночастицы быстро распознаются мононуклеарными фагоцитарными системами в печени и селезенке путем связывания с сывороточными белками, и инкапсулированная мРНК высвобождается в клетки-мишени.221 Большинство наиболее широко используемых в настоящее время LNPs для доставки мРНК специфически нацелены на печень, и LNPs продолжают фокусироваться на оптимизации платформ доставки в другие ткани.232 Недавно селективное нацеливание на органы появилось как терапевтическая стратегия, позволяющая точно и предсказуемо оптимизировать LNPs и обеспечить доставку мРНК и Cas9 мРНК и одиночной направляющей РНК и рибонуклеопротеиновых комплексов Cas9 в ткани-мишени посредством внутривенного введения в печень и легкие.233 Кроме того, адресная доставка терапевтических препаратов на основе мРНК в клетки, особенно в DC и APC, играет важную роль в формировании иммунного ответа путем доставки необходимых сигналов в Т-клетки и активации экспансии и дифференцировки Т-клеток.210 В настоящее время область терапевтических препаратов на основе мРНК сосредоточена на разработке новых материалов и составов, которые могут потенциально повысить эффективность трансфекции и терапевтическую эффективность.2
The adjuvant activity of mRNA delivery systems
Катионные липосомы сами выступают в качестве вспомогательных средств, и их основная функция заключается в защите антигена от элиминации и доставке антигена к профессиональным APC234. Вакцинная платформа RNActive (CureVac AG) полагается на свой носитель для обеспечения адъювантной активности, авспомогательная активность обеспечивается за счет совместной доставки РНК в комплексе с протамином (поликатионным пептидом) путем индуцирования адаптивного ответа,235-237 что вызвало благоприятный иммунный ответ в многочисленных доклинических исследованиях на животных против рака и инфекционных заболеваний.238-241. Механистически, адъювантные свойства РНКактивной вакцины показали мощный TLR7/8-зависимый иммунный ответ, включая активацию TLR7 (в клетках мыши и человека) и TLR8 (в клетках человека), интерферона I типа, цитокинов и хемокинов.235 Однако, мРНК-опосредованная активация интерферона I типа может привести к подавлению трансляции белка и активации CD8+ Т-клеток, что может быть связано с кинетикой передачи сигналов интерферона I типа относительно активации TCR.242,243. Совместная доставка мРНК и гидрофобного адъюванта TLR7 (гардикимода) достигается с помощью гибридной системы наночастиц ядро/липидная оболочка PLGA, в которой PLGA позволяет встраивать адъювант в ядро, а липидная оболочка загружает мРНК посредством электростатических взаимодействий. Наночастица реализует сильный антиген-специфический иммунный ответ и высокоэффективную противоопухолевую активность.142
The effect of administration routes on delivery efficiency
Пути введения играют важную роль в системе доставки мРНК, поскольку некоторые специфические заболевания требуют особых путей введения, хотя внутривенное введение может удовлетворить потребности большинства заболеваний. Например, ингаляционное или интратрахеальное введение подходит для легочных заболеваний;184 церебральные заболевания можно лечить с помощью интрацеребровентрикулярной или интратекальной инъекции;182 а заболевания печени можно лечить с помощью внутривенного, внутрибрюшинного, подкожного или внутримышечного введения.244 Кроме того, различные векторы доставки будут иметь различное распределение или экспрессию при различных путях введения. Например, LNPs, содержащие липидоид 306Oi10, при внутривенном введении нацеливались и экспрессировали белок преимущественно в печени, тогда как LNPs накапливались в поджелудочной железе (11%), почках (12%) и легких (15%) и экспрессировали белок в печени (67%), поджелудочной железе (17%) и селезенке (13%); аналогично, LNPs дренировались через капилляры и лимфатическую систему при подкожном и внутривенном введении244. Сообщалось, что LNPs на основе дисульфидных связей холестерила, содержащие биоразлагаемые катионные липосомные наночастицы OCholB, продемонстрировали успешную доставку молекул мРНК в скелетную мышцу (при внутримышечном введении), легкие и селезенку (при внутривенном введении) и мозг (при инфузии в боковой желудочек).162 При внутривенном введении CART предпочтительно нацеливались на профессиональные APC во вторичных лимфоидных органах, а при подкожном введении - на местные APC.179. Таким образом, оптимальная терапевтическая эффективность может быть достигнута только при выборе соответствующих векторов доставки мРНК и путей введения. В целом, LNP-мРНК-терапевтические препараты (надлежащая практика производства, стабильность, хранение и безопасность) имеют большой потенциал в лечении инфекционных, онкологических и генетических заболеваний. Разработка систем доставки мРНК с высокой эффективностью и безопасностью имеет большое значение для широкого применения терапии на основе мРНК.
Application
Ожидается, что терапевтические препараты на основе мРНК станут мощной терапией для лечения различных рефрактерных заболеваний, включая инфекционные заболевания, генетические заболевания обмена веществ, рак, сердечно-сосудистые и цереброваскулярные заболевания и другие болезни (рис. 7). Большое количество исследований показало, что мРНК не только обеспечивает лучшую эффективность трансфекции и более длительную экспрессию белка, но и обладает большими преимуществами по сравнению с ДНК и традиционными белковыми препаратами; мРНК инициирует трансляцию белка при достижении цитоплазмы без вставки в геном, что имеет меньший риск вставки по сравнению с традиционными белковыми и ДНК-препаратами. Важно отметить, что мРНК легко синтезируется в процессе IVT, относительно проста в производстве и может быть быстро применена в различных видах терапии. Кроме того, две наиболее актуальные проблемы мРНК - иммуногенность и стабильность - контролируются химической модификацией отдельных нуклеотидов. Терапия мРНК привлекла миллиарды долларов, и все большее число хорошо финансируемых биотехнологических компаний, таких как Moderna, CureVac, BioNTech, Argos Therapeutics, RaNA, Translate Bio, Ethris, Arcturus и Acuitas (Таблица 2). Очевидно, что мРНК стала одной из наиболее привлекательных областей для разработки лекарств, которую определенно стоит исследовать в долгосрочной перспективе.
 Fig. 7
Strategies and potential application of mRNA-based therapeutics. mRNA drugs have yielded numerous inspiring treatments for refractory or previously incurable diseases, including infectious diseases, genetic diseases, cancers, and cardiovascular diseases. In particular, the mRNA vaccine has shown a strong advantage in the prevention of SARS-CoV-2 infection and may also be a potential approach against the infection of other viruses and pathogenic microorganisms, including malaria, respiratory syncytial virus, and HIV13 /span>
Table 2 Current status in mRNA therapeutics development
mRNA therapeutics that are directly based on the encoding molecules
Вышеупомянутая иммунотерапия на основе мРНК достигает многообещающих результатов путем экспрессии антигенов и последующей инициации иммунного ответа,245 что определяется как непрямая терапия, которая не нацелена на вирус или опухолевые клетки с помощью мРНК, кодирующих терапевтические белки.246 мРНК, кодирующие белки/пептиды, непосредственно нацелены на вирусы, бактерии или раковые клетки. В отличие от этого, терапевтические препараты на основе мРНК, непосредственно лечащие заболевания путем доставки функциональных белков на основе мРНК, считаются прямой стратегией, включая недостающие или пониженные в количестве эндогенные белки, функциональные чужеродные белки или антитела, а также белки для инструментов редактирования генов.247 Кроме того, стратегия прямой экспрессии белков на "фабриках клеток" может также использоваться для искусственного создания клеток, например, инженерии Т-клеток.161 Терапия замещения белков на основе мРНК уже вышла на клиническую стадию, несмотря на ограниченное количество клинических испытаний по сравнению с мРНК-вакцинами.248,249
mRNA-based monoclonal antibodies
Препараты на основе антител достигли быстрого прогресса в биофармацевтике, но всемирное применение моноклональных антител (mAbs) ограничено их уязвимыми свойствами и высокой стоимостью производства, хранения, транспортировки и распространения.250 Кодированные нуклеиновыми кислотами mAbs, особенно моноклональные антитела на основе мРНК, подают большие надежды на повышение эффективности терапии антителами, а клетки-мишени используются как фабрики для преобразования нуклеиновых кислот в функциональные mAbs.251 Кодированные плазмидной ДНК mAbs обычно сосредоточены в области инфекционных заболеваний, и некоторые уже вступили в клиническую стадию, в то время как исследования mAbs на основе мРНК (мРНК-mAbs) относительно отстают. Здесь мы сосредоточимся на применении мРНК-mAbs, которые в основном сосредоточены на лечении инфекций и опухолей.252 Широко нейтрализующее анти-ВИЧ-1 антитело VRC01 было декодировано в нуклеозид-модифицированную мРНК, и системное введение мРНК, инкапсулированной в LNP, успешно выработало VRC01 на уровне эффективности и защитило гуманизированных мышей от внутривенного заражения ВИЧ-1.253. Для лечения RSV, Tiwari и др. преобразовали существующий препарат palivizumab в сконструированную мРНК, кодирующей связанные с мембраной нейтрализующие антитела, которые показали более высокую эффективность, чем паливизумаб, и значительно подавляли RSV через 7 дней после трансфекции254. Изолированные нейтрализующие mAbs (CHKV-24) из B-клеток выжившего после естественной инфекции вируса chikungunya были успешно закодированы мРНК, экспрессированы на биологически значимых уровнях in vivo и защитили мышей от артрита и инфекции костно-мышечной ткани со снижением виремии до необнаруживаемого уровня через 2 дня после инокуляции.255 Наноструктурированный липидный носитель был использован для переноса репликонной РНК, кодирующей mAbs ZIKV-117, внутримышечно, что способствовало высокому уровню экспрессии mAbs и защитило мышей от летальной инфекции ZIKV.256 Кроме того, стратегия mAbs на основе мРНК применяется при лечении опухолей. Были разработаны различные антитела против рака на основе мРНК, которые вызывали быстрый и устойчивый титр антител в сыворотке крови in vivo, что позволило мышам выжить в условиях инкубации опухоли неходжкинской лимфомы.257 Анти-HER2 антитело (trastuzumab) было системно доставлено с помощью IVT мРНК LNPs и синтезировано in vivo, что улучшило фармакокинетический профиль по сравнению с прямым введением белка трастузумаба.156 Кроме того, Zhou et al. сообщили о новом методе быстрой доставки наночастиц/переменного домена тяжелой цепи антитела путем введения его кодирующей мРНК.258 Биспецифические Т-клеточно-захватывающие антитела (bsAbs) стали перспективным подходом к лечению злокачественных опухолей, хотя этому в некоторой степени препятствует сложность производства и короткий период полураспада в сыворотке крови. Эндогенно синтезируемые и долговечные bsAbs при системном введении (bsAbs на основе мРНК) эффективно подавляли рост опухоли.259 Ye et al. разработали saRNA , кодирующую антитело против SARS-CoV-2, с помощью альфавирусного вектора.99 Однако вирусный вектор показал низкую безопасность при разработке вакцины против SARS-CoV-2 с мРНК.260,261.
mRNA-based immunotherapy
Иммунотерапия дала множество вдохновляющих методов лечения рефрактерных или ранее не поддающихся лечению заболеваний, включая инфекционные, раковые, аутоиммунные и аллергические заболевания. 262-266 Исследования в области вакцин вызвали большой энтузиазм и многообещающие подходы к иммунотерапии пандемических инфекционных заболеваний, включая аттенуированные вакцины, инактивированные вакцины и вакцины на основе белковых субъединиц. 267 Недавно в качестве инновационных вакцин появились вакцины на основе нуклеиновых кислот, включая ДНК-вакцины и РНК-вакцины. В частности, терапевтические препараты на основе мРНК стали безопасной и эффективной стратегией защиты пациентов от инфекционных и раковых заболеваний благодаря своим исключительным преимуществам, включая высокую эффективность, относительно низкий уровень побочных эффектов и простоту производства. 1,262 Здесь мы рассмотрели применение препаратов на основе мРНК, сосредоточившись на клинических испытаниях профилактических и терапевтических вакцин против инфекционных и раковых заболеваний (рис. 8).
Fig. 8 ;
mRNA drugs elicit immunity using disease-specific targeting antigen strategies. mRNA drugs mainly go through the following three aspects from synthesis to initiate immune protection, including mRNA synthesis, intracellular processing, and initiating immune protection. Briefly, IVT mRNA drugs are encapsulated into carriers (such as nanoparticles) and are endocytosed by antigen-presenting cells (1-2); mRNA is released into the cytoplasm after escaping from endosomes and then translated into antigenic proteins by ribosomes 3). Subsequently, endogenous antigens are degraded into polypeptides by the proteasome and are presented by MHC I and activate cytotoxic T cells (CD8+ T cells) (4-6). In addition, secreted antigens can be taken up by cells, degraded inside endosomes, and presented on the cell surface to helper T cells by MHC class II proteins (6-9). Finally, helper T cells (CD4+ T cells) stimulate B cells to produce neutralizing antibodies against pathogens382
mRNA vaccines against infectious diseases
SARS-CoV-2 mRNA vaccines
SARS-CoV-2 появился в 2019 году268 , а затем вызвал пандемию по всему миру.269 На сегодняшний день, согласно отчету ВОЗ (covid19.who.int), было зарегистрировано более 228 миллионов подтвержденных случаев заболевания COVID-19, включая ~6,14 миллионов смертей. Первая вакцина COVID-19 (Pfizer-BioNTech COVID-19 Vaccine; BNT162b2) была одобрена FDA для разрешения экстренного использования, а впоследствии - вакцина Moderna COVID-19 (мРНК-1273). Эти вакцины обеспечивают ~90% эффективность профилактики инфекции при полной вакцинации и 80% при частичной вакцинации,270-273 Однако нейтрализующие антитела против варианта SARS-CoV-2 Omicron не обнаруживаются в сыворотках большинства реципиентов мРНК-1273 или BNT162b, а дополнительная доза мРНК вакцины, по-видимому, улучшает нейтрализацию.274
SARS-CoV-2 состоит из структурных белков, шипа (S), нуклеокапсида (N), оболочки (E) и мембраны (M). 275 Белок S коронавируса или RBD белка S опосредует связывание рецепторов и слияние вирусной и клеточной мембран, а проникновение вирионов в клетки-мишени стало антигенной терапевтической стратегией для разработки вакцин. 276 N-белки SARS-CoV-2 могут вызывать иммунный ответ, подавляющий вирусную инфекцию, тогда как E-белки и M-белки обычно не принимаются во внимание из-за отсутствия иммуногенности. 277,278. Для улучшения эффекта вакцины COVID-19 было использовано несколько стратегий; префузионный S белок был образован путем мутации двух остатков пролина белка шипа для стабилизации его в префузионной конформации, а в BNT162b2 и мРНК-1273 использовалась 1-метил-3'-псевдоуридилил модифицированная мРНК (m1ψ мРНК), кодирующая префузионный S белок. 271,279. SARS-CoV-2 шип RBD, как сайт связывания для hACE2, облегчает проникновение вируса в клетки-мишени и является перспективной мишенью для разработки вакцин-кандидатов. 280 Однако, мономерные RBD антигены имеют ограниченную способность к взаимодействию с рецепторами В-клеток, что способствует выработке высокоаффинных антител. 281-283. Были разработаны различные стратегии для повышения иммуногенности белка RBD, таким образом, повышая титры антител, включая конформацию димеров, тримеров или полимеров, путем добавления гуманизированного IgG Fc, 284 T4 тримеризации (Foldon) 285 или ферритина 286 к антигену (рис. 9). мРНК, кодирующая С-концевую складку или ферритин Helicobacter pylori, приводила к мультимерной конформации RBD и индуцировала надежный и длительный гуморальный иммунитет. 286 МРНК, кодирующая конъюгированный с RBD Fc, вызывает более сильный иммунный ответ. 287 Кроме того, мРНК-препараты могут эффективно блокировать связывание RBD с рецептором ACE2 человека, кодируя высокоаффинные усеченные варианты ACE2. 288
 Fig. 9
SARS-CoV-2 mRNA antigen immunogenicity and vaccine design. Full-length S-protein or RBD as a vaccine immunogen has been widely confirmed to induce high-affinity neutralizing antibodies. SARS-CoV-2 S protein is intrinsically metastable and can be stabilized in a prefusion conformation by structure-based design.549,550 Prefusion-stabilized SARS-CoV-2 Spike immunogen induces potent humoral and cellular immune responses.551,552 The RBD peptide is one of the most promising targets to design candidate vaccines. However, RBD has a low molecular weight, which leads to its weak immunogenicity, and can be further improved by forming multimers. Multimerization of RBD protein using humanized IgG Fc,284 T4 trimerization (FD)285 or Ferritin286 have been shown to induce higher neutralizing antibody compared to monomeric antigens, which will provide us with new ideas for designing powerful mRNA vaccines . Несколько вариантов SARS-CoV-2 появились в результате глобальной пандемии COVID-19.289 К счастью, были разработаны химеры вирусного S-белка для предотвращения вариантов SARS-CoV-2,270 а BNT162b2 и мРНК-1273 все еще могут эффективно предотвращать инфекции, вызванные вариантами SARS-CoV-2, включая варианты Дельта (B.1. .617.2), Альфа (B.1.1.7) и Гамма (P.1) варианты у взрослых.272,290,291 Интересно, что существует большая разница в дозировках мРНК вакцин COVID-19. Утвержденная дозировка одной дозы BNT162b2 составляет 30 µg мРНК, а мРНК-1273 - 100 µg (www.fda.gov/). Первая вакцинация 100 µg BNT162b1 не обладала значимо повышенной иммуногенностью по сравнению с первой вакцинацией 30 µg292. Тем не менее, дозозависимые ответы наблюдались при вакцинации мРНК-1273 (25, 100 и 250 µg) и ARCoV (100 и 1000 µg).276 Примечательно, что была разработана вакцина из saRNA, кодирующая белок S и VEE репликазу вируса для самоамплификации, названная LUNAR-COV19, и было показано, что однократная вакцинация 2 µg защищает мышей от летальной инфекции SARS-CoV-2.293
Продолжительность действия мРНК-вакцины COVID-19 и ее эффективность в особых популяциях требуют дальнейшего изучения долгосрочной защиты, особенно для пациентов с существующими заболеваниями и пандемическим патогеном с мутациями. Гуморальный иммунитет против SARS-CoV-2 постоянно снижался в течение нескольких месяцев после полной вакцинации BNT162b2 или мРНК-1273.294-297 BNT162b1 вызывала более слабый гуморальный иммунитет у пожилых людей, чем у молодых.285,298. К счастью, вакцинация BNT162b2 представляется безопасной для беременных женщин и может снизить риск заражения SARS-CoV-2.299-302 Кроме того, антитела против SARS-CoV-2 могут передаваться новорожденным во время беременности.303 BNT162b2 и мРНК-1273 хорошо переносятся и вызывают слабый, но значительный иммунный ответ у пациентов с иммунокомпрометирующими состояниями, включая гемодиализ,304 гематологические заболевания,305,306 злокачественные опухоли,307,308 хронические воспалительные заболевания309 и ВИЧ-инфекцию (оценивался только BNT162b2). 310 BNT162b2 показал более слабую, но значительную иммуногенность у пациентов с аутоиммунными заболеваниями, включая ревматические заболевания,311-313 рассеянный склероз,311,314-316 myasthenia gravis,317 и заболевания опорно-двигательного аппарата.318 Примечательно, что мРНК-1273 и BNT162b2 показали пониженную иммуногенность у реципиентов трансплантатов solid органов.319-323
Различные патогены вызывают серьезные инфекции человека, включая вирусы, бактерии, грибки и паразиты.324 Вирусы вызвали ряд чрезвычайных ситуаций в области общественного здравоохранения: пандемия гриппа H1N1 в 2009-2010 годах,325 заражение вирусом Зика в 2015-2016 годах,326 и нынешняя пандемия COVID-19.327 Вакцины являются жизненно важным инструментом в борьбе с инфекционными заболеваниями.328 Кандидаты в мРНК-вакцины показали схожие профили безопасности и реактогенности с инактивированными вакцинами, одобренными Европейским Союзом и американцами, однако острые и хронические инфекции составляют 15% всех смертей в мире из-за необоснованного распределения вакцин в районах с ограниченными ресурсами и недостаточного реагирования на инфекционные вспышки.329 мРНК-вакцины - идеальный подход для преодоления этих проблем и своевременного удовлетворения срочной потребности в вакцинах во время эпидемий.330 В настоящее время мРНК-вакцины интенсивно исследуются и разрабатываются для борьбы с высококонтагиозной атипичной пневмонией (SARS-CoV-2), вирусом гриппа, вирусом Зика, вирусом бешенства и ВИЧ, и соответствующие клинические результаты обобщены (табл. 3).331 Кандидаты в мРНК-вакцины были быстро созданы через 8 дней после публикации генов гемагглютинина и нейраминидазы вируса гриппа H7N9. Вакцина с мРНК (NCT03014089) защитила 47% плацент от заражения вирусом Зика по сравнению с 91% инфицированных плацент плацебо-вакцинированных мышей, а защитный гуморальный иммунитет был также подтвержден у макак-резус.332 Аналогичным образом, мРНК-1273 успешно снижала вирусную нагрузку в легких мышей и макак-резусов, зараженных SARS-CoV-2, и вызывала Th1-биологический иммунный ответ у здоровых взрослых (NCT04283461, NCT04470427). 333 Была разработана мРНК-вакцина (CV7201) с использованием мРНК, кодирующей гликопротеин вируса бешенства для лечения бешенства, которая продемонстрировала температурную стабильность и успешно вызвала определенный ВОЗ ответ антител у более 70% участников в результате трех раундов внутрикожной (i.d.) вакцинации (NCT02241135).334 Несмотря на значительные усилия по разработке и тестированию, ученым не удалось создать эффективную профилактическую вакцину против ВИЧ. В отличие от профилактических вакцин, описанных выше, мРНК-вакцины против ВИЧ направлены не только на предотвращение, но и на излечение инфекции. Анти-ВИЧ мРНК-вакцина (NCT02888756) и мРНК-вакцина на основе DC (AGS-004, NCT00672191) вышли на клинические испытания,335 но противовирусной эффективности в клинических испытаниях не наблюдалось336. У вибцинированных (vibcinated) пациентов уровень вируса в плазме крови был аналогичен контролю, получавшему плацебо (NCT00672191), и все участники возобновили антиретровирусную терапию в связи с безуспешным контролем острой ВИЧ-инфекции (NCT00672191).336 Существует несколько мРНК-вакцин против бактерий и паразитов,337 но они все еще находятся на стадии доклинической оценки.338 В совокупности эти исследования показали, что вакцинация мРНК является перспективной стратегией против инфекционных заболеваний, хотя для некоторых из них, таких как СПИД, срочно требуются дальнейшие исследования и разработки.
< a href="https://www.nature.com/articles/s41392-022-01007-w/tables/3">Table 3 Clinical trials of mRNA drugs
Influenza virus mRNA vaccine
Nachbagauer и др. выбрали консервативный стеблевой домен НА, ионный канал матрикса-2, нуклеопротеин и широкореактивную нейраминидазу в качестве антигенов для обеспечения универсальной защиты от вируса гриппа. Вакцины использовали LNPs для доставки мРНК m1Ψ и защищали мышей от заражения вирусом H1N1 при 500-кратной средней летальной дозе (внутрикожно, ионизируемый катионный липид/фосфатидилхолин/холестерин/ПЭГ-липид (50:10:38,5:1,5 моль/моль))339.
HIV mRNA vaccine
Mariano Esteban использовал векторы вируса вакцины Ankara для загрузки немодифицированной и 1-метил-3'-псевдоуридилил модифицированной мРНК (m1Ψ мРНК), кодирующей белки ВИЧ-1 Gag, Pol и Nef (ионизируемый катионный липид/фосфатидилхолин/холестерин/PEG/липид (50:10:38.5:1.5 моль/моль)).340,341
RSV mRNA vaccine
Вакцина мРНК из респираторно-синцитиального вируса мРНК-1777 показала безопасность и переносимость в клиническом испытании I фазы.342 Bett и др. использовали LNPs для доставки мРНК, кодирующей полноразмерный F белок дикого типа, полноразмерный мутированный F белок, усеченную секретируемую тримерную форму F белка, секретируемый префузионно-стабилизированный F белок, и полноразмерные формы дикого типа, при этом префузионно-стабилизированные формы вызывали более высокий иммунный ответ (состав LNPs: асимметричный ионизируемый аминолипид, DSPC, холестерин и поли(этиленгликоль) 2000-димиристоилглицерин (PEG2000-DMG) в молярном соотношении 58:30:10:2, соответственно). 343
HSV mRNA vaccine
Friedman и др. разработали трехвалентную мРНК-вакцину, направленную на гликопротеины C, D и E вируса простого герпеса типа 2. По сравнению с трехвалентной белковой вакциной, мРНК-модифицированная вакцина обеспечивала лучшую защиту.344,345 Friedman и др. сравнили мРНК-вакцину HSV и белковую вакцину, в которой использовались одни и те же антигены (гликопротеины C2, D2, E2), и первая вызвала более сильный иммунный ответ и память.346.
VZV mRNA vaccine
Vora et al. использовали LNPs для доставки m1Ψ мРНК, кодирующей антиген gE вируса varicella-zoster (VZV), который показал эффект, сравнимый с эффектом белковой вакцины, адъювантированной AS01B (состав LNP, ионизируемый липид: DSPC:холестерин:PEG-липид, 50:10:38,5:1,5).347
Human cytomegalovirus (HCMV) vaccines mRNA vaccine
Permar и др. использовали LNPs для доставки мРНК, кодирующей полноразмерный белок гликопротеина В, который вызывал более стойкий иммунный ответ, чем белковая вакцина, адъювантированная MF59 (состав LNP, ионизируемый катионный липид (запатентованный Acuitas), фосфатидилхолин, холестерин и PEG-липид (50:10:38. 5:1,5, моль/моль).348 Аналогичным образом, они разработали вакцины против HCMV с использованием мРНК, кодирующей гликопротеин B и пентамерный комплекс, которые вызывали значительный иммунный ответ у не-человекообразных приматов с уже существующим иммунитетом против HCMV.349
Rabies virus mRNA vaccine
Вирус бешенства является зоонозной инфекцией, вызывающей примерно 59 000 смертей каждый год. Несмотря на эффективные вакцины, бешенство остается одним из самых тяжелых заболеваний во всем мире из-за недоступного лечения и сложной схемы вакцинации (требующей 4 дозы). Компания CureVac AG разработала мРНК-вакцину против вируса бешенства (RABV) CV7201, которая использует катионный белок протамин для инкапсуляции мРНК, кодирующей гликопротеин вируса бешенства, для лечения бешенства. CV7201 была термостабильной и успешно вызвала реакцию антител, определенную ВОЗ, у 70,3% участников при трехкратной вакцинации (NCT02241135).330 На основе CV7201 компания CureVac AG оптимизировала состав LNP и разработала CV7202, в которой используется тот же антиген мРНК, что и в CV7201. Оптимизированный LNP включает ионизируемый аминолипид, PEG-модифицированный липид, фосфолипид и холестерин.350 CV7202 показал хорошую переносимость в клиническом испытании (NCT03713086).351 Luis-Alexander Rodriguez использовал CNE для инкапсуляции saRNA, кодирующей РНК-зависимую РНК-полимеразу альфавируса и гликопротеин бешенства G.352
Dengue virus mRNA vaccine
Richner и др. использовали LNPs для инкапсуляции мРНК, кодирующей оболочку и мембранные структурные белки вируса Денге серотипа 1.353
Other mRNA vaccines
Spiropoulou et al. использовали LNP для инкапсуляции мРНК, кодирующей растворимый гликопротеин вируса Hendra, который защитил 70% сирийских хомяков от летального поражения вирусом NiV.354 Sigal et al. разработали мРНК-вакцину против вируса эктромелии, используя мРНК, кодирующую EVM158.355
mRNA cancer vaccines
Иммунотерапия является развивающимся и перспективным методом лечения рака путем стимулирования иммунной системы, включая блокаду иммунных контрольных точек (ICB), химерные антигенные рецепторные Т-клетки (CAR-T клетки) и вакцины.356 В отличие от ICB, вызывающих иммуносупрессию, и CAR-T клеток, непосредственно убивающих опухолевые клетки, противораковая вакцина инициирует и усиливает противоопухолевый иммунный ответ со стороны APCs, особенно DCs.357 Были разработаны платформы мРНК-вакцин против рака, которые достигли обнадеживающих результатов благодаря своей уникальной эффективности в продвижении цикла иммунитета против рака и безопасности. мРНК-вакцины против кастрационно-резистентного рака простаты и немелкоклеточного рака легких прошли клиническую оценку.358 Между тем, мРНК-вакцины против меланомы, глиобластомы, AML и почечно-клеточной карциномы (RCC) продемонстрировали активный ответ на иммунотерапию, что заслуживает интенсивного дальнейшего изучения в области мРНК-вакцин.359
Melanoma
Клинические испытания прошли три мРНК-вакцины на основе не-DC и семь мРНК-вакцин на основе DC. Среди них одна мРНК-вакцина не на основе DC360 и одна мРНК-вакцина на основе DC361 использовали полные мРНК из опухолевых клеток, а другие вакцины выбирали ТАА и кодировали их в мРНК. Примечательно, что все мРНК-вакцины на основе DC не смогли значительно улучшить клинический исход у пациентов с метастатической меланомой, и более чем у половины участников во время клинических испытаний наблюдалось прогрессирование заболевания, а интранодальная (i.n.) вакцинация не смогла повысить эффективность мРНК-вакцин на основе DC и имела более низкий уровень ответа, чем вакцинация внутрикожная (NCT01278940).226,361-365 TriMix-mRNA (содержащая мРНК, кодирующие иммуностимулирующие молекулы: CD40 L, CD70 и caTLR4) была использована для повышения эффективности вакцины на основе DC.362,364 Кроме того, компания BioNTech разработала персональную вакцину на основе мРНК для метастатической меланомы, у пациентов не было обнаружено поражений при рентгенологическом исследовании, и они оставались без рецидивов после 23 месяцев i.n. (NCT02035956)366 и вакцина использовала LNP для создания антимеланомной мРНК-вакцины, что привело к регрессии предполагаемого метастаза у пациента, вакцинированного внутривенно (NCT02410733).367 Из-за противоречивых данных дальнейшие исследования могут помочь подтвердить, что мРНК-вакцины могут служить в качестве иммунотерапии меланомы.
Glioblastoma
Вакцинация мРНК рассматривается как перспективная стратегия лечения глиобластомы.368 Вакцины на основе мРНК DC были созданы с использованием копий мРНК пациентов с глиобластомой и продлили выживаемость без прогрессирования в 2,9 раза по сравнению с соответствующим контролем (NCT00961844).369 Аналогично, предварительное кондиционирование места вакцинации мощным отзывным антигеном, таким как столбнячный/дифтерийный (Td) токсоид, может значительно повысить эффективность опухолевых антиген-специфических DCs, тем самым увеличивая двустороннюю миграцию DCs и значительно улучшая выживаемость пациентов с глиобластомой.370 Была разработана вакцина на основе мРНК DC для улучшения возврата (homing) мРНК-импульсных DC в лимфоидные органы (NCT00639639, соответствующие результаты еще не объявлены).
Acute myeloid leukemia
Разработаны две мРНК-вакцины на основе DC для снижения риска рецидива у пациентов с AML с полной ремиссией (NCT00510133 и NCT00965224). Электропорация DCs с мРНК WT1 улучшила безрецидивную выживаемость у респондеров вакцинации по сравнению с не-вакцинированными. В другом исследовании использовалась мРНК, кодирующая обратную транскриптазу теломеразы человека, и вакцинация внутривенными вакцинами привела к полной ремиссии у 11 из 19 пациентов с медианой наблюдения 52 месяца.74,371 Примечательно, что мРНК-вакцины могут не подходить для пациентов с процессивным AML, поскольку их действие зависит от иммунной системы, а AML может ослаблять иммунную систему пациентов.76
Renal cell carcinoma (RCC)
RCC по-прежнему характеризуется высоким уровнем смертности, и для лечения RCC были разработаны две мРНК-вакцины. Вакцины мРНК на основе DC показали умеренную эффективность (NCT00678119) для лечения RCC на поздних стадиях.372 Другая вакцина мРНК против RCC вводится пациентам непосредственно внутривенно, и специфический иммунный ответ вакцины, по-видимому, связан с долгосрочным выживанием пациентов с RCC.373
Tolerance to mRNA cancer vaccines
Опухоли обладают множеством механизмов для обхода эффективного иммуного надзора путем регуляции иммуносупрессивных молекул и соответствующих клеток под противоопухолевым давлением иммунотерапии, что приводит к индукции периферической толерантности и центральной толерантности и значительно снижает эффективность иммунотерапии.374 Для преодоления иммунной толерантности широко используются стратегии лечения ICBs, включая анти-PD-1 антитела,366 анти-CTLA-4 антитела,375 и PD-L1 siRNA.376 В отличие от ICBs, естественные клетки-киллеры (NK) могут быть благоприятны для преодоления механизма толерантности, который связан с тем, что NK-клетки уничтожают опухолевые клетки без презентации молекул MHC I.366,377. ТАА, как самоантигены, обладают центральной толерантностью из-за клонального удаления аутореактивных лимфоидных клеток во время онтогенеза.378 Неоэпитопы (neoepitopes) могут обойти центральную толерантность с высокой иммуногенностью, поскольку они никогда не присутствуют в нормальных тканях и вызывают накопление генных мутаций в раковых клетках (включая driver и passenger мутации ).379 Поэтому неоэпитопы были применены для преодоления центральной толерантности противораковых вакцин и решения проблемы гетерогенности опухоли. Персональная мРНК-вакцина показала относительно благоприятную клиническую эффективность, но некоторые пациенты были недоступны для вакцинации из-за прогрессирования заболевания, и лишь часть неоэпитопов успешно вызывала специфический иммунный ответ у пациентов.366 Недавно было начато несколько клинических испытаний для дальнейшей оценки противоопухолевой эффективности персональных мРНК-вакцин (NCT03313778, NCT02316457 и NCT03468244, соответствующие результаты еще не объявлены).380,381 В совокупности, исходя из сложности патогенеза опухоли, кодовая доставка нескольких терапевтических мРНК имеет большой потенциал для победы над раком.
The safety of mRNA vaccines
мРНК-вакцины обладают достаточной безопасностью и хорошей переносимостью, а их побочные явления (adverse events (AEs)), как правило, носят легкий или умеренный характер, включая реакции в месте инъекции, такие как боль, отек, эритема, и гриппоподобные заболевания, такие как усталость, миалгия, пирексия и озноб.382,383. В частности, антирабическая мРНК-вакцина CV7201 вызвала неожиданный паралич Белла 2 степени у здорового взрослого при внутримышечном введении,330 а CV9130 вызвала задержку мочи у трех пациентов с раком простаты, в то время как задержка мочи также является распространенным симптомом при раке простаты.384 Вакцинация CV9201 также вызвала приступ астмы 3 степени у одного пациента, аномальный тиреоид-стимулирующий гормон у девяти пациентов и повышение антинуклеарных антител у пяти пациентов.358 Вакцины DC редко вызывали AEs3 степени.361 Тяжесть AEs зависит от способа введения и дозы.352,385 Примечательно, что частота AEs при внутрикожной вакцинации выше, чем при внутимышечной, i.m.) и только 3 AEs в группе i.m. (37 участников).330 мРНК-вакцины являются практической платформой для повышения безопасности вакцин путем изменения антигенных последовательностей и модификации белковых структур. Антителозависимое усиление (АЗУ) - это явление, при котором предсуществующие антитела способствуют вирусной инфекции клеток хозяина и приводят к увеличению вирулентности.386 Для повышения безопасности мРНК-вакцины против вируса Зика и предотвращения потенциального риска АЗУ была использована мРНК, кодирующая мутацию белка Е без консервативного эпитопа петли слияния.387 Кроме того, мРНК, кодирующая RBD вместо родительского белка, снижала вредный иммунный ответ, индуцированный вакцинами.388
Adjuvants for mRNA vaccines
Адъюванты необходимы для терапии на основе мРНК, особенно для мРНК-вакцин, которые могут усиливать и направлять иммунный ответ и модулировать величину и тип определенных подмножеств Т-хелперов, подклассов IgG или мукозальных антител. Существует несколько адъювантов, одобренных FDA для использования у людей, включая соли алюминия, MF59, AS01, AS03, AS04 и CpG 10181.389 Для мРНК-вакцин источники адъювантов в основном включают следующие пять категорий: (1) самоадъювантная эффективность IVT мРНК; (2) иммуноактивирующий белок, кодируемый мРНК (например, CD70, CD40 L и TriMix-DC); (3) адъюванты прямого действия: патоген-ассоциированные молекулярные паттерны и опасность-ассоциированные молекулярные паттерны (например, TLRs, хеликазы, NODs и агонисты инфламмасомы); (4) мРНК, комплексированные со специфическими реагентами (протамин, липидный реагент); и (5) адъюванты, способствующие рекрутированию, пролиферации и перекрестной презентации DCs, такие как GM-CSF и Fms-подобный лиганд тирозинкиназы-3 (FLT3 L).390-392 Экзогенные мРНК обладают присущим им иммуностимулирующим эффектом благодаря их распознаванию различными рецепторами врожденного иммунитета, что позволяет им стимулировать врожденный иммунный ответ в пользу вакцинации, однако они вызывают деградацию мРНК и подавляют экспрессию антигена, что негативно сказывается на поддержании активности мРНК-терапевтических препаратов.78,393.
Модификации нуклеозидов повышают эффективность трансляции мРНК (Ψ, 5mC, Ψ/5mC или N1-метил-псевдоуридин/5-метилцитидин), а псевдоуридин/5-метилцитидин (Ψ/5mC)-модифицированная мРНК частично подавляла активацию врожденного иммунитета мРНК-вакцинами и увеличивала уровень кодирующего белка (люциферазы светлячка) до 100 раз in vitro и 20 раз в селезенке мышей. 394,395 Парадоксально, но исследования также показали, что Ψ-модификация усиливала иммуностимулирующую функцию мРНК и не повышала эффективность трансляции мРНК. 396,397 Такой противоположный вывод может быть связан с вариациями в оптимизации последовательности РНК, строгостью удаления загрязняющих dsRNA при очистке мРНК и уровнем врожденного иммунитета в целевых типах клеток. 6 Другая эффективная адъювантная стратегия заключается в кодировании мРНК иммуномодулирующих белков, используемых в качестве адъювантов, например, TriMix, который кодирует комбинацию трех иммуноактивирующих белков: CD70, CD40 лиганд (CD40 L) и конститутивно активный TLR4 (caTLR4). 398 Многочисленные исследования вакцин против рака показали, что мРНК TriMix связана со стимуляцией созревания DCs и генерацией мощных цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL). 399 DC, электропорированные мРНК, кодирующей костимуляторную молекулу 4-1BB лиганд (4-1BBL) и CD40 L, усиливали пролиферацию и функцию ВИЧ-специфических CD8+ Т-клеток и увеличивали секрецию цитокинов. 400 Другие костимулирующие молекулы, включая CD83 и рецептор фактора некроза опухоли superfamily member 4 (TNFRSF4; также известен как OX40), также могут быть закодированы мРНК и электропорацией DCs, что приводит к значительному повышению иммуностимулирующей активности DCs. 401,402 Недавно новая мРНК-вакцина против SARS-CoV-2 также включала костимулирующую молекулу CD40 L в качестве адъюванта для активации профессиональных APC. 403 Лиганды рецепторов распознавания образов действуют как адъюванты, вызывающие врожденный иммунитет и нацеленные на APC, тем самым влияя на адаптивный иммунный ответ. Pam3, липопептидный адъювант, распознаваемый TLR1 и TLR2, был включен в LNP, что усилило мРНК-опосредованную иммунотерапию рака путем стимулирования различных подклассов TLR. 404 Двуцепочечная РНК (dsRNA), образующаяся при репликации вирусов, может мощно индуцировать естественный иммунитет. Поли (I: C), синтетический аналог dsRNA, считается агонистом TLR3, который индуцирует выработку IL-12 и IFN I типа, способствует перекрестной презентации антигена молекулам MHC II класса и улучшает генерацию цитотоксических Т-клеток. 405 Однако адъюванты нуклеиновых кислот имеют определенные ограничения, связанные с нестабильностью и легкой деградацией после введения препарата, поэтому для их оптимизации обычно рассматриваются системы доставки. Недавно анионный адъювант двуцепочечной РНК, полученный из поли I:C, был соединен с chitosan для синтеза полиплексов, стимулирующих созревание DCs, способствующих презентации антигена и инициирующих цитотоксические Т-клетки, что показало определенную терапевтическую эффективность при лечении рака. 406 Монофосфорилатный липид А активирует иммунную систему через TLR4, не влияя на трансляцию мРНК. 407 Синтетические олигодезоксинуклеотиды CpG (ODNs) являются агонистами TLR-9, которые могут индуцировать выработку IFN I типа и провоспалительных цитокинов и вызывать клеточный и гуморальный иммунный ответ Th1-типа. 408,409. Вакцина против гепатита В HBsAg-1018 (HEPLISAV-B™), содержащая CpG-ODN в качестве адъюванта, была одобрена Управлением по контролю за продуктами и лекарствами США для использования у взрослых. 410 RNAdjuvant® (CureVac AG), агонист TLR-7/8/RIG-I на основе РНК, состоящий из одноцепочечной некодирующей РНК без cap, содержащей несколько последовательностей поли(U) повторов, является мощным адъювантом, стимулирующим Th1, который вызывает высокий уровень IFN-γ и играет роль в многочисленных исследованиях по лечению опухолей 411,412.
Другие адъюванты, способствующие набору, пролиферации и кросс-презентации DC, такие как GM-CSF, в сочетании с голой мРНК вызывали преимущественно Th1 иммунный ответ, в то время как одна только голая мРНК вызывала Th2 ответ.413. FLT3 L играет важную роль в вакцинации in situ, а совместно обнаруживаемый белок FLT3 L также улучшает терапевтический иммунитет, индуцированный голой мРНК.414,415 В целом, адъюванты играют важную роль в экспрессии мРНК-кодирующих антигенов и инициировании стойкого защитного иммунитета, и имеют огромные перспективы применения в терапии на основе мРНК.
mRNA-based protein replacement therapies
Терапия замещения белков находит широкое применение в замене отсутствующих или дефектных белков благоприятными белками.50 Терапия на основе мРНК стала новой опорой для терапии замещения белков, которая была широко исследована в различных областях, включая сердечные заболевания,416 заболевания легких,417 гематологические заболевания,418 болезни обмена веществ,419 рак,420 ортопедические заболевания,421 нейрогенные расстройства,422,423 атрофию мышц и т.д.50,424. Однако большинство препаратов на основе мРНК для замены белков находятся в доклиническом статусе, и только препараты на основе мРНК, кодирующие фактор роста эндотелия сосудов (VEGF, NCT03370887) и CFTR (NCT03375047), вошли в клиническую разработку. На сегодняшний день наиболее активные усилия были предприняты в области терапии сердечных заболеваний с заменой белка, в первую очередь сердечной недостаточности и инфаркта миокарда.416 Лечение мРНК VEGFA (AZD8601) защитило мышей от сердечной недостаточности и значительно снизило апоптоз клеток миокарда с повышенной плотностью капилляров,425 и соответствующая оценка эффективности продолжается в клинических испытаниях (NCT03370887).426 Однако тестирование терапии на основе мРНК также стимулировало ее применение в терапии различных заболеваний легких, особенно генетических заболеваний легких.417
Cystic fibrosis
Муковисцидоз является аутосомно-рецессивным заболеванием, ограничивающим жизнь, вызванным мутациями в гене CFTR. Трансфекция CFTR-мРНК заметно восстанавливает нарушенную функцию CFTR in vitro.427 Сообщалось, что назальное введение LNPs-CFTR-мРНК приводило к восстановлению до 55% чистого оттока хлоридов у здоровых мышей.428 Кроме того, MRT5005, как CFTR-протеин на основе мРНК, вступил в фазу I/II клинических исследований.148
Hematologic diseases
Доклинические исследования заместительной терапии белками на основе мРНК проводились при гематологических заболеваниях.429 Гемофилия - это группа кровотечений, связанных с дефицитом факторов свертывания крови, включая гемофилию А (дефицит фактора VIII) и гемофилию В (дефицит фактора IX).430 Замена белков на основе мРНК может корректировать гематологические заболевания путем доставки соответствующих факторов в шаблоне мРНК. LNPs, инкапсулированные в мРНК, кодирующие различные варианты FVIII (LNP F8), обеспечили быструю индукцию и длительную экспрессию FVIII у мышей с гемофилией А.431 мРНК FIX была доставлена к FIX-нокаутным мышам с помощью серии липидоидов, названных ТТ (соответствующие липидоподобные наночастицы, названные ТТ-LNPs), что восстановило функцию FIX у FIX-нокаутных мышей.432 Для лечения мышей с гемофилией B были разработаны так называемые липидные LUNAR LNPs, инкапсулирующие мРНК hFIX, способствующие быстрому импульсу FIX в течение 4-6 ч и стабильной продолжительности до 4-6 дней.433
Metabolic diseases
Применение мРНК также представляет собой перспективное решение для лечения метаболических заболеваний, которые в настоящее время не имеют эффективных методов лечения, таких как гепаторенальная тирозинемия, острая перемежающаяся порфирия, болезнь Фабри, гликогеновая болезнь хранения типа 1 A, синдром Криглера-Наджара типа 1 и дефицит орнитинтранскарбоксилазы.418,419. Гепаторенальная тирозинемия - редкое генетическое метаболическое заболевание, вызванное нарушением деградации тирозина из-за мутации фумарилацетоацетат-гидролазы, что может привести к множественным повреждениям органов.434 Cheng et al. разработали и оптимизировали нагруженные мРНК 5A2-SC8 дендримерные LNPs для переноса в организм. мРНК фумарилацетоацетат-гидролазы, в результате чего у нокаутных мышей FAH статистически значимо улучшилась функция печени, аналогично мышам дикого типа C57BL/6.166 Острая перемежающаяся порфирия вызывается гаплонедостаточностью деаминазы порфобилиногена, которая вызывает нейровисцеральные приступы, связанные с повышенной потребностью печени в геме.435. LNP-инкапсулированная мРНК была использована для дозозависимой экспрессии человеческой порфобилиноген деаминазы в гепатоцитах мыши.435 Эта заместительная терапия быстро нормализовала экскрецию предшественников порфирина с мочой и противодействовала приступам порфирии у мышей с дефицитом, кроликов и не-человекообразных приматов. Метилмалоновая ацидемия, генетическое метаболическое заболевание, вызванное главным образом потерей активности метилмалонил-КоА мутазы, приводит примерно к 20% смертности.436 Инкапсулированная мРНК была доставлена для системной экспрессии функциональной митохондриальной метилмалонил-КоА мутазы у мышей с метилмалоновой ацидемией, что привело к снижению уровня метилмалоновой кислоты в плазме на 75%-85%.437. Гибридная система доставки мРНК была использована для загрузки мРНК орнитин-транскарбоксилазы, что привело к восстановлению уровня аммиака в плазме и оротовой кислоты в моче и продлило выживание относительно дефицитных мышей.438 Болезнь Фабри - это лизосомное нарушение хранения, вызванное дефицитом α-галактозидазы А, приводящее к кардиомиопатии и конечной стадии болезни почек. Болезнь Фабри можно улучшить, используя наночастицы для устойчивой доставки мРНК α-галактозидазы А в организм мыши и не-человекообразных приматов.439 Мутация гена SERPINA1 приводит к дефициту альфа-1-антитрипсина (ААТ) и повреждает печень, где вырабатывается белок ААТ. Karadagi и др. идентифицировали мРНК, кодирующую человеческий ААТ, в первичных гепатоцитах человека и разработали из нее формулу LNP. Исследование in vivo показало, что секретируемый белок ААТ увеличился с 1,14 до 3,43 мкг/мл в среде из первичных гепатоцитов человека.440 Замена белка на основе мРНК также представляет собой альтернативу лечению опухолей. Гомолог фосфатазы и тензина, удаленный на хромосоме 10 (PTEN), является мощным геном-супрессором опухоли, который отсутствует или мутировал во многих видах рака человека. PTEN ингибирует путь PI3K-AKT и усиливает апоптоз клеток рака простаты.441 Гибридные полимер-липидные наночастицы использовались для системной доставки мРНК PTEN и значительно подавляли рост диссеминированного метастатического и интратибиального ортотопического рака простаты у PTEN-нулевых мышей.442 Аналогичным образом, полимер-липидные гибридные наночастицы были модифицированы редокс-реактивным полимером PDSA и применены для передачи мРНК p53 (другого гена, кодирующего опухолевый супрессор), и результаты показали, что NPs с мРНК p53 останавливали клеточный цикл и вызывали апоптоз, способствуя значительному ингибированию роста p53-нулевых HCCs и NSCLCs и улучшая чувствительность опухолевых клеток к ингибиторам рапамицина167. Кроме того, мРНК, кодирующая антиангиогенный белок, растворимую fms-подобную тирозинкиназу 1,443 также эффективно подавляла опухоли поджелудочной железы; комплекс мРНК липосома-протамин-IL-22BP сильно подавлял рост опухоли C26 как в модели перитонеального метастазирования, так и в модели подкожного ксенотрансплантата444.
mRNA encoding a peptide/protein
Функция пептида/белка, кодируемого мРНК, является ключевым фактором при выборе терапевтических препаратов, направленных на клетки, что напрямую влияет на терапевтический дизайн мРНК.445 Точная доставка необходима для нацеливания клеток с соответствующей протеинконвертазой или эндопротеазой на пептид, нуждающийся в посттрансляционной модификации для сборки в функциональные типы.446 Белки должны секретироваться вне клеток для осуществления своей функции. Таким образом, мРНК должны быть переданы клеткам с естественными функциями секреции; в противном случае необходимо вставить последовательность мРНК соответствующего сигнального пептида рядом с ORF секреторного белка.447 Закодированные пептидные/белковые антигены также могут вызывать гетерогенный иммунный ответ, даже если они участвуют в одной вакцине.448 Была создана трехвалентная вакцина с использованием трех мРНК, кодирующих разные белки, при этом эти три антигена способствовали разным уровням IgG.94 Аналогичным образом, Sahin и др. разработали мРНК, кодирующие неопептиды, при этом величина иммунного ответа варьировала от пептида к пептиду, что указывает на то, что мРНК-вакцина может быть улучшена путем отбора антигенов, вызывающих сильную реакцию; однако лежащий в основе механизм далеко не полностью ясен, и трудно обеспечить, чтобы все кодируемые пептиды/белки обладали высокой иммуногенностью.366 Более того, кодируемый пептид/белок оказывает большое влияние на его устойчивую экспрессию. Holtkamp et al. наблюдали, что флуоресцентный белок поддерживал высокий уровень экспрессии до 120 ч в формате мРНК, в то время как продолжительность экспрессии резко сокращалась при использовании иммунодоминантного пептида из OVA в аналогичном формате мРНК.46,379 Примечательно, что продолжительность экспрессии белка играет роль в терапевтической эффективности мРНК. Например, мигрирующие DCs в коже должны потратить 48 ч на доставку в место нахождения Т-клеток и еще пару часов на то, чтобы вызвать de novo CD8+ Т-клеточный ответ после доставки мРНК в DCs .449-451 Поэтому мРНК, кодирующая пептид/белок, теоретически должна присутствовать на поверхности мигрирующих DCs не менее 48 ч для мРНК-вакцин с подкожным или внутривенным введением. Следует отметить, что в большинстве онкологических мРНК-вакцин наблюдается резкое снижение экспрессии пептида/белка примерно через 24 ч после трансфекции DCs или иммунизации вакциной.46,452,453 Однако остается неясным, нужна ли более длительная продолжительность, что требует дальнейшего изучения взаимосвязи между кинетикой экспрессии пептида/белка и эффективностью мРНК-вакцины (или терапии).454
mRNA-based gene editing therapeutics
Редактирование генов стремительно развивается в различных областях благодаря быстрому развитию программируемых нуклеаз,423,424 особенно при раке, инфекционных заболеваниях, первичных дефектах иммунной системы, мышечной дистрофии и гематологических заболеваниях.455 мРНК широко используется для доставки программируемых нуклеаз.456 Три наиболее важные программируемые нуклеазы, нуклеазы с цинковыми пальцами (ZFNs),457 нуклеазы с эффектором, подобным активатору транскрипции (TALENs),458,459 и система нуклеаз с кластеризованными регулярно перемежающимися короткими палиндромными повторами (CRISPR)-ассоциированными белками (CRISPR/Cas),460 все достигли эффективной трансфекции и манипулирования вставками/делециями мутаций в форме мРНК. мРНК является привлекательным подходом в терапии редактирования генов благодаря своей скоротечной экспрессии без риска возникновения мутаций, и в настоящее время проводится несколько клинических испытаний на основе генетического редактирования мРНК.461 Здесь мы обсуждаем применение генного редактирования на основе мРНК, а также его будущие перспективы и проблемы.
CRISPR/Cas nuclease system
Развитие искусственных эндонуклеаз обеспечивает высокую скорость развития редактирования генов на основе мРНК. Препараты мРНК модулируют клеточную геномную информацию, кодируя искусственные эндонуклеазы, такие как ZFNs, TALENs, а в последнее время - нуклеазные системы CRISPR/Cas462. В целом, три эндонуклеазы, кодируемые мРНК, были разработаны для достижения вставок/удалений (indels) и мутаций путем введения целевого двухцепочечного разрыва ДНК с последующей репарацией ДНК посредством негомологичного соединения концов или гомологично направленных путей репарации.463 Системы CRISPR/Cas9 в настоящее время являются наиболее часто используемой технологией редактирования генов из-за их удобства в разработке и реализации среди трех инструментов редактирования генов.
mRNA-based T lymphocyte therapeutics
Т-лимфоциты являются интригующей мишенью благодаря их огромному потенциалу в борьбе с раком и инфекционными заболеваниями, а электропорация является основным способом трансформации эндонуклеазно-кодирующих мРНК в Т-клетки in vitro.464-466 Основное внимание уделяется эффективности, специфичности и безопасности инженерии Т-лимфоцитов посредством трансфекции мРНК, химически модифицированные sgRNAs и мРНК Cas9 увеличили эффективность редактирования генома посредством электропорации в первичные Т-клетки человека in vitro.467. Более того, доставка мРНК Cas9 улучшила редактирование генома и снизила токсичность по сравнению с редактированием на основе ДНК.468 Кроме того, эндонуклеаза TALEN достигла высокой специфичности и эффективного редактирования генома в первичных Т-клетках. Электропорация мРНК TALEN в первичные Т-клетки способствовала нокауту CCR5 (корецептора ВИЧ) более чем на 50% при низкой активности вне мишени.459 Кроме того, после электропорации мРНК TALEN и пяти направляющих РНК из системы CRISPR/cas9 нокаут TCR в первичных Т-клетках достиг 81%.469
mRNA-based autologous T cell therapeutics
Инженерия Т-лимфоцитов путем электропорации мРНК ex vivo обеспечивает эффективную платформу для лечения как вирусных инфекций, так и рака без проблем безопасности, связанных с вирусными носителями.470 Как правило, Т-клетки приобретают способность распознавать опухолевые антигены благодаря трансгенной экспрессии CAR или высокоаффинного Т-клеточного рецептора и впоследствии проявляют терапевтическую эффективность после инфузии.471 Адоптивный перенос аутологичных Т-клеток является многообещающей иммунотерапией рака, но требует высокого количества и качества аутологичных Т-клеток, таких как CAR-T-клетки.472 Тем не менее, генетическая модификация является мощным подходом для решения этих проблем. Для развития крупномасштабного производства Т-клеток сторонние донорские Т-клетки были электропоражены константной мРНК TCRa (TRAC) TALEN. Более того, исследователи нарушили ген TRAC, чтобы избежать реакции "трансплантат против хозяина".458 Для дальнейшего повышения эффективности CAR Т-клеток был введен химиотерапевтический препарат алемтузумаб (alemtuzumab), который снижал уровень генов CD52 и синергически способствовал приживлению путем обеспечения лимфодеплеции и иммуносупрессии, а также наделил TCR/CD52-дефицитные CD19 CAR Т-клетки (dKO-CART19) мощной противоопухолевой активностью в ортотопической мышиной модели CD19+ лимфомы458. Недавно система CRISPR/Cas стала потенциальным инструментом геномного преобразовани для CAR Т-клеточной терапии. CAR и CRISPR были доставлены с помощью лентивирусной и электропорационной мРНК, соответственно, для создания CAR Т-клеток с дефицитом молекул HLA класса I, PD1 и TCR, а с помощью CRISPR/Cas9 мРНК-измененные аллогенные CAR Т-клетки показали эффективную противоопухолевую активность in vitro и in vivo.473. Была разработана гибридная ΔU3-sgRNA, которая была включена в ΔU3-3'-длинный терминальный повтор самоактивирующегося лентивирусного вектора, что привело к целевому расщеплению локуса TRAC и обогащению высокооднородных (более 96%) популяций CAR+ (более 99%) TCR- и мощной антилейкемической активности Т-клеток CAR19, лишенных TCR, в модели химерной опухоли человека и мыши.474 Вместе системы CRISPR/Cas9 преодолевают алло-распознавание и обеспечивают альтернативную стратегию аутологичным Т-клеткам. Успешная геномная инженерия была достигнута путем электропорации мРНК, кодирующей CD19-CAR, с 94% экспрессией CAR в более 80% жизнеспособных Т-клеток.475,476 CTLs, электропорированные мРНК, кодирующей CAR против CD19, проявили значительную CD19-специфическую противоопухолевую активность после введения в хвостовую вену.477 Многократные инфузии РНК CAR Т-клеток, направленных против CD19, привели к улучшению выживаемости и устойчивому противоопухолевому ответу в надежной модели ксенотрансплантата лейкемии, которой предшествовала лимфодеплецирующая химиотерапия.478 В отличие от редактирования генов, Zhao и коллеги electroporated аутологичные Т-клетки с мРНК, кодирующей CAR против избыточной экспрессии мезотелина при раке поджелудочной железы, раке яичников и мезотелиоме.
Надежная противоопухолевая эффективность была продемонстрирована в модели ксенотрансплантата диссеминированной мезотелиомы человека при многократных инъекциях.479 Однако неэффективное перемещение в опухоли препятствовало ex vivo лечению Т-клетками на основе мРНК в клинических испытаниях.480. Исследования показали, что миграция Т-клеток улучшается, если трансфицировать инфильтрирующие опухоль Т-клетки мРНК, кодирующей хемокиновый рецептор CXCR2.481 Недавно дальнейшее клиническое применение электропорации CAR-T-клеток с мРНК было поддержано путем создания клинического производства, а мРНК, кодирующая хондроитинсульфатный протеогликан для лечения пациентов с меланомой, полностью соответствует требованиям GMP, что говорит о потенциальной ценности дальнейшего клинического применения.482 В настоящее время несколько исследований CAR T-клеток на основе мРНК прошли клиническую оценку безопасности и эффективности (NCT01837602, NCT02624258 и NCT03060356).473 Недавно были разработаны невирусные векторы для доставки мРНК ex vivo в человеческие Т-клетки с учетом цитотоксичности электропорации. Olden и др. исследовали серию катионных полимеров pHEMA-g-pDMAEMA для доставки мРНК в CD4+ и CD8+ первичные человеческие Т-клетки in vitro, что привело к 25% эффективности трансфекции при высокой жизнеспособности клеток.483 Для разработки систем доставки мРНК на основе липидов/полимеров были использованы методы библиотечного скрининга, которые обеспечивают быстрый и простой метод распознавания потенциальных систем доставки мРНК для доклинических и клинических инженерных Т-лимфоцитов. Billingsley и др. синтезировали библиотеку из 24 ионизируемых липидов и сформировали их в LNPs, причем наиболее эффективные LNPs обеспечили экспрессию CAR мРНК, сравнимую с электропорацией.161 McKinlay и др. создали библиотеку олигонуклеотидных транспортеров, содержащих различные липидные домены, которые способствовали эффективному высвобождению мРНК с помощью амфифильных CARTs и достигли девятикратного увеличения трансляции мРНК (80%) в лимфоцитах in vitro по сравнению с Lipofectamine 2000.484
mRNA-based CD4+ T cell therapeutics
На сегодняшний день существует только одно завершенное исследование I фазы по изучению CD4+ Т-клеток, модифицированных в гене CCR5 мРНК ZFN у ВИЧ-инфицированных пациентов (NCT02388594).485 Остаются проблемы, связанные с цитотоксической доставкой генов вирусным методом или методом электропорации, сложными и дорогостоящими манипуляциями и внецелевой эффективностью системы редактирования генов. Обнадеживает то, что предпринимаются очень активные усилия по изучению невирусной и in vivo доставки мРНК для эффективного и безопасного редактирования генов, на что стоит обратить внимание в будущем.485
mRNA-based stem cell therapeutics
Редактирование генома на основе мРНК также успешно применяется в стволовых клетках для лечения многих заболеваний.486 Ранее белок, мРНК и ДНК ZFN были доставлены в линию клеток человека и эмбриональные стволовые клетки мыши с помощью ретровирусного вектора и нарушили целевой ген с частотой 15%, 15% и более 50%, соответственно, что указывает на универсальность ретровирусных векторов.487. Kohn et al. далее исследовали эффективность, специфичность и мутационные признаки мРНК ZFN, мРНК TALEN и мРНК CRISPR/Cas9, которые были введены электропорацией в первичные гемопоэтические стволовые и клетки предшественники человека, и анализ показал, что мРНК ZFN обладает более высокой специфичностью, чем мРНК двух других эндонуклеаз488. ZFN мРНК позволила CD34+ приживляться в NOD-PrkdcSCID-IL2Rγ нулевых мышах с сохранением многоклеточного потенциала по сравнению с редактированием TALEN мРНК.488 Для плазмидной gRNA и мРНК Cas9 их совместная допоставка показала сходную острую цитотоксичность с отдельной доставкой плазмиды, что подчеркивает необходимость дальнейшей оптимизации доставки CRISPR/Cas9 в первичные гемопоэтические стволовые клетки человека.489 Подходы к редактированию генома, которые инновационно трансфицируют гемопоэтические стволовые и прогениторные клетки специфической для макак CCR5 ZFN мРНК ex vivo, впервые модифицировали многослойные и долговременно репопулирующие клетки в большой животной модели и привели к постоянному отслеживанию in vivo геномно-редактированных гемопоэтических стволовых клеток в специфической для мутации манере.490 Стратегии трансфекции стволовых клеток стоит исследовать для ex vivo и in vivo доставки эндонуклеазной мРНК для облегчения клинического применения.
Доставка мРНК в стволовые клетки ex vivo была исследована для различных целей. Электропорация использовалась для переноса мРНК, кодирующей EGFP, в мезенхимные стволовые клетки и эмбриональные стволовые клетки человека H9 (H9 hES), в обоих случаях эффективность трансгена достигла 90%.491,492 Для обеспечения отличной альтернативы pDNA, катионные носители были исследованы для доставки мРНК, кодирующей CXCR4, в мезенхимные стволовые клетки и привели к 80% положительной экспрессии целевого белка.493 Кроме того, многие исследователи сосредоточились на повышении эффективности трансфекции мРНК стволовых клеток. Транскрипция мРНК in vitro была проведена для характеристики распределения вариантов гистонов в эмбриональных стволовых клетках человека.494 Исследователи успешно трансдифференцировали в инсулин-продуцирующие клетки для лечения диабета, используя мРНК дуоденального фактора транскрипции 1 in vitro для трансформации поджелудочной железы мыши в мезенхимные стволовые клетки.432 Недавно мРНК ВИЧ-1 Tat была доставлена в мезенхимные стволовые клетки костного мозга (МСКК), что подтвердило ингибирующее действие белка ВИЧ-1 Tat на функцию кроветворной поддержки МСКК.495
mRNA-based pluripotent stem (iPS) therapeutics
Редактирование генома индуцированных плюрипотентных стволовых (iPS) клеток открывает большие перспективы в клеточной терапии и моделировании заболеваний.496,497 Много усилий было приложено для редактирования генома iPSCs с помощью системы CRISPR/Cas9.498-500 Переходная доставка мРНК или белка Cas9 предпочтительна для клинического применения iPS без риска мутаций. Доставка Cas9 в виде мРНК имеет ряд преимуществ перед прямой доставкой белка, включая значительное производство молекул белка из одной молекулы мРНК и универсальную инженерию мРНК. Был представлен рабочий процесс, использующий временную доставку мРНК CRISPR/Cas9, для поддержки высокопроизводительной разработки iPSC, подвергнутых генной правке. Впоследствии iPSCs могут быть дифференцированы в репрезентативные специфические типы клеток эмбриональных линий для дальнейших исследований или потенциального клинического применения. Кроме того, этот метод был применен и к другим инструментам генного редактирования, таким как мРНК ZFN и мРНК TALEN.501 Однако нестабильность РНК и эффективность вне мишени являются сложными для клинического применения.502 Следовательно, будущие усилия будут направлены на безопасные и эффективные стратегии доставки мРНК для дальнейших терапевтических целей.
Combination therapeutics based on mRNA drugs
В последнее время комбинированная терапия стала мощным средством лечения злокачественных опухолей, способствующим синергетической эффективности.503 ICB,504 CAR T клетки 265 и противораковые вакцины - три важных иммунотерапевтических метода лечения рака. ICB могут ослабить торможение активации и функции Т-клеток,504 но стойкий клинический эффект достигается лишь у меньшинства пациентов.505 Комбинация ICB и противораковых вакцин привлекла значительное внимание.506 Противораковая вакцина может расширить эффективность ICB, вызывая специфический для опухоли ответ CD8+ Т-клеток для лечения пациентов, у которых нет предсуществующих CTL и ответа на ICB507,508 и повысить эффективность мРНК-вакцины против рака.366,509,510. Недавно мРНК-вакцины были усилены CAR-T-клетками более чем на 2 порядка за счет имитации динамики вторичного ответа после первоначальной реакции Т-клеток, что значительно увеличило медиану выживаемости и способствовало полному отторжению солидных опухолей у 6 из 10 мышей по сравнению с однократным введением CAR-T-клеток.511 Очевидно, что терапия на основе мРНК в основном сосредоточена на иммунотерапии опухолей и инфекционных заболеваний, изучение ее потенциала и механизма при других заболеваниях является следующим приоритетом. Несомненно, терапия на основе мРНК стала мощным и универсальным средством борьбы с болезнями.
Conclusion and prospects
За последние 30 лет терапевтические препараты на основе мРНК достигли больших успехов, добившись значительного улучшения стабильности, функции и производства мРНК.2 Препараты на основе мРНК используют клетки как фабрики для производства антигенов или функциональных белков с многообещающей эффективностью и достаточной безопасностью.512. В настоящее время большое количество исследований посвящено различным способам применения мРНК-терапевтических препаратов, и проводится ряд клинических испытаний. мРНК-вакцины привлекли значительное внимание в связи с важной ролью мРНК-вакцин в борьбе с пандемией SARS-CoV-2.513 Для вакцин против инфекции гуморальный иммунный ответ играет важную роль в эффективности мРНК-вакцин, особенно величина IgG.514. Вакцина с мРНК полностью защищала мышей от вируса гриппа с необнаруживаемыми титрами ингибирования гемагглютинации.94 Примечательно, что мукозальный иммунитет также вносит значительный вклад в защиту от инфекционных заболеваний, поскольку многие инфекции начинаются со слизистых оболочек.513,515,516 Patel и др. провели систематический обзор клинических испытаний вакцин против ротавируса в соответствии с рекомендациями PRISMA, который показал последовательную связь между сывороточным IgA и защитой от вакцины.517 Между тем, мукозальный иммунитет может обеспечить более широкую защиту, чем гуморальный иммунитет. Вакцина против вируса гриппа с более высоким уровнем назального IgA обеспечивала более надежную защиту, чем с более низким уровнем IgA, хотя эти две вакцины имели схожий уровень сывороточного IgG,518 а Tamura и др. также наблюдали более высокую перекрестную реактивность назального IgA против гетерологичных вирусов гриппа по сравнению с IgG.519 Более того, иммунитет слизистых оболочек может играть важную роль в предотвращении передачи инфекции, а сывороточный IgG, возможно, предотвращает тяжелые инфекционные заболевания, но не передачу болезни.515,520,521 Это жизненно важна вакцина для предотвращения передачи COVID-19, вызванной бессимптомными носителями, чтобы противостоять текущей пандемии, которая продемонстрировала огромный успех. В настоящее время разработана интраназальная вакцина, регулирующая мукозальный иммунитет против SARS-CoV-2, однако роль мукозального иммунитета в предотвращении передачи SARS-CoV-2 неясна, что требует дальнейших исследований для выявления взаимосвязи между мукозальным иммунитетом и мРНК-вакцинами276. Интересно, что многие мРНК-вакцины вызывают Th-1 иммунный ответ через сигналы интерферона, что может быть связано с доставкой мРНК в цитоплазму и трансляцией антигенных белков, которые в основном обрабатываются на молекулах MHC I и специфически активируют ответ CD8+ Т-клеток.522 В целом, мРНК-вакцины показали высокую эффективность в защите от инфекционных заболеваний посредством гуморального иммунитета слизистой оболочки, но клеточный иммунитет нуждается в детальной оценке в будущем.
В последние десятилетия, особенно в последние несколько лет, мы стали свидетелями больших научных достижений в области терапии на основе мРНК. В настоящее время клинические исследования препаратов на основе мРНК направлены на создание вакцин против инфекционных заболеваний, иммунотерапию рака, терапию замены терапевтических белков и лечение генетических заболеваний. Возможности и проблемы терапии на основе мРНК сосуществуют, и существует большое количество вопросов, требующих разъяснения. (1) Как лучше доставлять макромолекулы мРНК? (2) Как можно улучшить присущую ей нестабильность и деградацию путем разработки антигена на основе структуры и оптимизации системы доставки? (3) Как можно регулировать активацию иммунной системы? По сути, для клинического применения терапевтических препаратов на основе мРНК необходимы технологии доставки, способные обеспечить стабилизацию мРНК в физиологических условиях. Совершенствование технологии оптимизации структуры мРНК и разработка прецизионных наночастиц для терапии на основе мРНК также являются решающими моментами для развития мРНК-препаратов как мощных и универсальных средств борьбы с заболеваниями. Основываясь на высоком интересе и потенциале, мы с полной уверенностью прогнозируем ускорение темпов изучения и развития мРНК-терапии в следующем десятилетии, что, возможно, обеспечит множество решений для профилактики и лечения неизлечимых в настоящее время заболеваний.
|