Адено-ассоциированный вирус (AAV) представляет собой исключительно универсальную основу для биоинженерии рекомбинантных векторов переноса генов благодаря своей низкой генетической сложности, которая облегчает клонирование, упаковку и доставку терапевтических кассет экспрессии генов. Перспективность AAV усиливается богатством природных вирусных изолятов с различными свойствами, которые могут быть изменены или улучшены, включая тканевую специфичность, эффективность экспрессии трансгенов и защиту от уже существующих или индуцированных анти-AAV антител. Такое перепрофилирование обычно достигается высокопроизводительным способом, включающим генерацию и итеративный, нисходящий отбор библиотек синтетических капсидов AAV, которые были диверсифицированы с помощью таких методов, как перетасовка семейств ДНК, реконструкция предков или пептидный дисплей (1, 2). В качестве альтернативы, специфические свойства вектора могут быть установлены рациональным восходящим подходом путем внесения целевых изменений в капсид, примером чего является выделение иммунораздражающих вариантов AAV в работах лабораторий Asokan и Agbandje-McKenna (3, 4).

Хотя сила этих методов неоспорима, также очевидно, что для того, чтобы действительно использовать весь потенциал биоинженерии AAV, необходимы дальнейшие усовершенствования. Одна из причин заключается в том, что даже при проведении строгой селекции библиотечные экраны часто дают набор потенциально интересных кандидатов в капсиды AAV, и не одного кандидата, который оправдывает последующую углубленную проверку. Для облегчения идентификации наиболее оптимального синтетического варианта капсида AAV в недавней нашей и других работах предложено решение в виде штрих-кодирования ДНК/РНК ведущих кандидатов, что позволяет проводить их одновременное сравнение и стратификацию в одном эксперименте на одном и том же животном (животных) (5-10). Другой проблемой для традиционных подходов направленной эволюции AAV являются заболевания, требующие одновременной трансдукции нескольких тканей в организме, в идеале с использованием минимально инвазивного способа доставки вектора. Клинически значимыми примерами являются моногенные наследственные заболевания мышц, которые проявляются в младенчестве и детстве и часто вызывают высокую заболеваемость и смертность, такие как Х-сцепленная миотубулярная миопатия (XLMTM) (11), гликогеновая болезнь хранения II типа (болезнь Помпе) (12) или мышечная дистрофия Дюшенна (DMD) (13).

Таким образом, в этой области срочно требуются капсиды AAV, которые после системного введения эффективно и избирательно воздействуют на скелетные мышцы, диафрагму и сердце, пораженные при этих заболеваниях, и при этом не затрагивают такие крупные мишени, как печень. Сложность в выделении таких капсидов с многоцелевой (мультитаргетной) способностью к трансдукции и специфичностью заключается в том, что молекулярная эволюция в большинстве случаев осуществляется как отбор по мишени. В этом случае библиотека капсидов итеративно отбирается в одной клетке или типе ткани при отсутствии средств для активного устранения вариантов, которые также трансдуцируют нежелательные эффекты вне мишени. Пока эти проблемы не решены, текущие клинические испытания в основном опираются и оценивают существующие серотипы AAV дикого типа (WT), такие как AAV8 для доставки гена MTM1 для лечения XLMTM или AAV9, кодирующий GAA, для лечения болезни Помпе. Другие изучают AAV8, AAV9 или AAVrh74 для лечения DMD посредством экспрессии мини-/микродистрофина или CRISPR-опосредованного пропуска экзонов и восстановления рамки считывания дистрофина (14).

Увы, эти и другие WT AAV являются неоптимальными для генотерапии мышц из-за их широкого тропизма и смещения в сторону печени, что вынуждает использовать высокие дозы для достижения надежной экспрессии и терапевтического эффекта в пораженных типах мышц. Это, в свою очередь, создает проблемы для производства векторов и ставит под угрозу безопасность пациентов, о чем свидетельствуют дозозависимые токсические эффекты, наблюдаемые в различных типах клеток и органов, включая печень и спинных корешковых ганглиев, у крупных млекопитающих и людей (15-17). Это включает в себя неблагоприятные события в нескольких недавних клинических испытаниях, таких как IGNITE или C3391001 (DMD) и ASPIRO (XLMTM), в которых введение высоких доз от 2 х 10¹⁴ до 3 х 10¹⁴ геномов вектора AAV (vg) на килограмм вызвало повреждение почек или печени и в конечном итоге привело к летальному исходу у нескольких детей. Доклиническое использование того же вектора AAV, что и в ASPIRO, но в еще более высоких дозах - до 8 х 10¹⁴ vg/кг - было признано безопасным у не-человекообразных приматов, что подчеркивает видоспецифические различия в токсичности AAV и необходимость изучения основных механизмов у людей, возможно, включающих роль предсуществующих заболеваний печени и желчных путей или анти-AAV иммунных реакций (18).

Кроме того, исследование долгосрочной стабильности и безопасности AAV-опосредованной экспрессии человеческого фактора VIII у собак показало дозозависимую интеграцию вектора в геном хозяина, в том числе вблизи генов, контролирующих рост клеток (19). Склонность векторов AAV к нарушению целостности генома хозяина усугубляется при применении CRISPR, о чем свидетельствуют данные долгосрочной оценки векторов AAV8-CRISPR у мышей с DMD, показавшие непреднамеренные изменения генома в печени, селезенке, почках, мозге и семенниках (20).

Существующие ограничения естественных серотипов AAV и искусственно отобранных вариантов капсида, полученных в результате молекулярной эволюции, создают высокий спрос на синтетические и улучшенные векторы AAV для генотерапии мышц (и других заболеваний), которые были бы более специфичными, безопасными и эффективными, чем существующие варианты AAV, оставаясь при этом совместимыми с крупномасштабным клиническим производством. Ранее мы сделали первый важный шаг, определив пептид-представляющий вариант AAV9 AAVMYO [также называемый AAV9P1 (21, 22), где P1 обозначает 7-мерный пептид RGDLGLS, отображенный на AAV9], который надежно трансдуцирует скелетные мышцы, диафрагму и сердце мышей при периферическом введении и превосходит многочисленные эталоны, включая золотые стандарты в генотерапии мышц (6). Аналогично, Tabebordbar и др. (23) недавно сообщили о другом наборе вариантов AAV9 с RGD (аргинин-глицин-аспарагиновая кислота) -содержащими пептидами, которые были названы MyoAAV и также обеспечивали надежную трансдукцию мускулатуры при системном введении у мышей, а также у не-человекообразных приматов. Примечательно, что некоторые из ведущих пептидов в этом последнем исследовании в значительной степени совпадают с пептидом P1, использованным в наших предыдущих работах (6, 21, 22), и особенно имеют общий мотив RGDL (аргинин-глицин-аспарагиновая кислота-лейцин), что подтверждает его критическую роль в нацеливании на мышцы.

Здесь мы поставили перед собой цель использовать наш опыт и создать биоинженерию следующего поколения синтетических миотропных AAV векторов, которые сохранят все достоинства AAVMYO, т.е. высокую эффективность в полосатых мышцах и высокий выход векторов, при этом демонстрируя дальнейшее существенное снижение смещения мишеней после периферического внутривенного введения. Для этого мы использовали полу-рациональный комбинаторный биоинженерный подход, включающий скрининг de novo двух перетасованных библиотек капсидных AAV в мускулатуре мыши, комбинацию лучших хитов с миотропным пептидом из AAVMYO и массовую параллельную проверку in vivo путем штрихового кодирования векторов и глубокого секвенирования в двух штаммах мышей. Это привело к выбору двух несущих пептид химерных капсидов AAV под названием AAVMYO2 и AAVMYO3, которые мы затем оценили в пораженных мышцах в мышиных моделях миотубулярной миопатии или DMD. Два оригинальных варианта AAV, о которых здесь сообщается, представляют собой интересных кандидатов для генотерапии мышечных заболеваний человека и расширяют быстро растущую коллекцию миотропных синтетических AAV, о которых сообщали мы (6) и другие (23-26). Одновременно они демонстрируют возможности намеренного объединения нескольких, отдельно оптимизированных характеристик в одной частице AAV и, таким образом, иллюстрируют большой потенциал полурациональной биоинженерии рекомбинантных вирусов для клинического использования...

В этой работе мы применили комплексный подход к биоинженерии AAV-векторов, который объединяет две основополагающие технологии и компоненты в одной частице, а именно: химерные капсидные каркасы и специфичный для мышц пептид повтрного целенаправленного воздействия (ретаргетинга), недавно идентифицированный нами путем анализа пептидной библиотеки в контексте AAV9 (6). Ранее мы и многие наши коллеги уже подтвердили эффективность каждой отдельной стратегии, однако настоящая работа продвигает вперед области диверсификации, инженерии и скрининга AAV, демонстрируя уникальный синергизм, который может быть достигнут благодаря их комбинации. Насколько нам известно, данное исследование представляет собой первый комбинаторный подход, объединяющий итеративные (повторяющиеся) скрининги библиотек для перетасовки капсида AAV in vivo с рациональным дизайном путем включения пептида-мишени, идентифицированного независимо с помощью скрининга пептидных библиотек.

Наш главный вывод заключается в том, что лучшие хиты, полученные в результате раздельного применения различных методов эволюции капсидов AAV (в данном случае перетасовки семейств ДНК и демонстрация пептидов), могут быть соединены полурациональным образом, создавая синтетические вирусные белковые оболочки, которые, в свою очередь, могут быть стратифицированы in vivo с помощью ДНК/РНК штрих-кодирования. Хотя мы использовали повсеместно активный промотор CMV для всех экспериментов по скринингу in vivo, эффективность и специфичность этих капсидов в мускулатуре может быть еще больше увеличена путем включения мощных промоторов, специфичных для мышц, как показано здесь, или синтетических генетических элементов, таких как специфичные для мышц цис-регуляторные энхансеры (53).

Этот вывод имеет ряд важных последствий для векторов AAV и генотерапии, поскольку он демонстрирует потенциал объединения нескольких методов эволюции капсида и, таким образом, существенно расширяет наш инструментарий для биоинженерии векторов. Ключевым фактором успеха данной работы стал наш оригинальный многоступенчатый процесс эволюции и отбора AAV, в котором мы сначала выявили перетасованные капсиды с повышенной специфичностью, но низкой эффективностью в отношении мишени по сравнению с эталоном AAV9, а затем еще больше увеличили оба параметра на втором, рациональном этапе путем приживления синтетического миотропного пептида к отобранным кандидатам. Насколько нам известно, этот последовательный и комбинаторный процесс представляет собой концептуальное достижение, отличающее нашу работу от предыдущих попыток отбора миотропных капсидов, включая нашу собственную (6), которые обычно фокусировались на одной технологии диверсификации AAV, такой как перетасовка семейств ДНК (25, 26, 54), и отображение пептидов в одном серотипе WT (23) или замена доменов между двумя серотипами (24).

Одновременно наша работа иллюстрирует способность синтетических капсидов выступать в качестве каркасов для отображения пептидов, что не только подтверждает наши выводы с перетасованным капсидом AAV-DJ, но и дополняет и расширяет богатство данных, полученных в прошлом с WT AAV (1, 2). В совокупности это предполагает значительную пользу от проведения в будущем отбора пептидных библиотек на химерной капсидной основе AAV, что является пока еще недостаточно разработанным подходом с далеко идущим потенциалом и за пределами мускулатуры, который заслуживает дальнейшего изучения и применения в будущем. Особенно перспективными вариантами представленной здесь стратегии, которые мы предполагаем, являются, например, отображение нескольких различных ретаргетинговых пептидов в двух отдельных петлях предварительно выбранного перемешанного капсида AAV, подобно недавней работе лаборатории Gradinaru, которая улучшила мутант AAV9, представляющий пептиды, путем вставки второй, независимой последовательности в альтернативную петлю капсида (55). Другой интересный подход к изучению и расширению комбинаторной стратегии, которая была представлена здесь, заключается в предварительном отборе перемешанных или иным образом сконструированных капсидов для уклонения от нейтрализующих анти-AAV антител до модификации полу-рационального пептида, с целью обеспечения стратегий повторного использования вектора in vivo в той же ткани, что обычно невозможно при использовании WT AAV, таких как AAV9, в качестве единого каркаса.

До сих пор, селективная прививка одного, предварительно выбранного пептида к ведущим капсидам из нашего отдельного скрининга и получение превосходных частиц, эта работа является примером перспектив полу-рациональной биоинженерии AAV и ее способности сопровождать подходы скрининга сверху вниз, основанные на селекции. Эта комбинаторная стратегия имеет большой потенциал для точной настройки специфичности и эффективности капсида и, таким образом, для получения вариантов, которые одновременно действуют в нескольких тканях и в разной степени. Это иллюстрирует наше представление о том, что добавление миотропного пептида к двум капсидам, которые по своей природе были мышечно-специфичными, привело к почти полному отсоединению от печени (типичная основная вне-целевая мишень для AAVs), сохраняя при этом широкую эффективность в мышцах, которую мы обнаружили для пептида P1 в контексте AAV9 (6). Это дальнейшее улучшение специфичности в мышцах in vivo, достигнутое здесь по сравнению с ранее представленным нами капсидом первого поколения AAVMYO, видно из многочисленных наборов данных в данной работе (рис. S5 - S10), и оно становится особенно очевидным при прямом сравнении AAVMYO с AAVMYO3, показанном на рис. S12. Капсиды AAVMYO2 и AAVMYO3 привели к увеличению относительной доли векторных геномов и экспрессии трансгена в скелетных мышцах по сравнению с сердечным, по сравнению с анализируемыми природными серотипами или AAVMYO (рис. 4 и 8 и рис. S5), что может представлять особый интерес для заболеваний, требующих экспрессии трансгена как в скелетной мускулатуре, так и в сердце, при этом снижая риск избыточной экспрессии в сердечной ткани. В дополнение к нашей предыдущей работе с оригинальным капсидом AAVMYO мы продемонстрировали, что производительность мышц in vivo может быть максимально усилена путем одновременной оптимизации вектора как на уровне трансдукции (капсид), так и на уровне транскрипции (промотор) (рис. 4).

Возможность направлять векторы AAV, предназначенные для генотерапии мышц, из печени, как это было проверено здесь с капсидами AAVMYO2 и AAVMYO3, имеет решающее значение и обнадеживает, учитывая вышеупомянутые серьезные побочные эффекты, включая летальные исходы в недавних клинических испытаниях HD AAV, поскольку это обещает лучший профиль безопасности у будущих реципиентов человеческого вектора. Дополнительный оптимизм придает наше наблюдение, что такие синтетические капсиды могут оставаться полностью совместимыми с установленными процессами производства AAV. В сочетании с устранением печени как типичного поглотителя основной части введенного вектора, это помогает ослабить давление на крупномасштабное производство AAV клинического класса и, таким образом, способствует будущему распространению и применению вектора.

Любопытно, что в настоящей работе мы обнаружили, что пептид P1 ведет себя по-разному на нескольких других капсидных каркасах, что подчеркивает сохраняющиеся пробелы в нашем понимании сложной биологии AAV и настоятельно поддерживает продолжение фундаментальных исследований, как необходимое условие для настоящей рациональной векторной инженерии в будущем. Это также относится к двум биоинженерным капсидам, которые мы представили в данной работе, AAVMYO2 и AAVMYO3, поскольку их биология остается загадочной на данном этапе, включая их неизвестный клеточный рецептор (рецепторы) и их активность у других видов помимо мыши. Примечательно, что недавно мы получили несколько экспериментальных доказательств, подтверждающих наше предыдущее представление (6) о том, что пептид P1 и другие RGD-содержащие последовательности взаимодействуют с различными типами интегринов на поверхности клеток-мишеней и используют их для трансдукции (56, 57). Это подтверждает и последняя работа лаборатории Sabeti, которая также идентифицировала интегрины как клеточные рецепторы для своих собственных вариантов капсида AAV9-RGD (23).

Некоторые из последних капсидов продемонстрировали эффективность и специфичность в мускулатуре здоровых не-человекообразных приматов, в то время как другие показали лучшие результаты у мышей (23). Хотя это вселяет оптимизм в отношении клинической применимости этих вариантов капсидов, включая химерные AAVMYO2 и AAVMYO3, о которых сообщается здесь, это также поднимает общие вопросы о лучшей доклинической модели для выбора миотропных или других капсидов AAV. Возможно, не-человекообразные приматы (NHP) ближе к человеку, чем мыши, но это не гарантирует, что рецепторы (интегрины) и другие внутриклеточные факторы хозяина, на которые нацелены различные варианты AAV с наличием RGD, полностью консервативны и одинаково функциональны у всех видов приматов, включая человека. Более того, сигнатуры экспрессии клеточных генов, включая поверхностные рецепторы, будут различаться между здоровой и больной мускулатурой, что подразумевает возможность того, что, независимо от вида, отбор у здоровых животных может дать капсиды, которые будут работать по-другому при применении у людей с мышечным заболеванием. Дополнительным примером проблем, связанных с определением и использованием оптимальной животной модели для отбора in vivo или оценки капсидов AAV для последующего использования у человека, являются последние данные, представленные на ежегодной конференции Американского общества генной и клеточной терапии (ASGCT;https://annualmeeting.asgct.org/abstracts) в 2022 году. Например, лаборатория Sabeti продемонстрировала, что два варианта, представляющие пептиды AAV, ранее отобранные лабораторией Gradinaru (55) для трансдукции ЦНС у мышей и показавшие, что они также функционируют у мартышек (обезьян Нового Света), не смогли трансдуцировать ЦНС другой модели NHP, т.е. у макак (обезьян Старого Света) (реферат 443). Второй пример был представлен компанией AskBio, которая сообщила о впечатляющей эффективности синтетического капсида AAV2i8 (24) в человеческом сердце в текущем клиническом испытании для лечения не-ишемической сердечной недостаточности III класса по NYHA. Трансдукция человеческого сердца была в 30 раз выше, чем та, которая наблюдалась в доклинических исследованиях на свином сердце, несмотря на то, что свиньи широко рассматриваются и используются как физиологически наиболее подходящая крупная животная модель для заболеваний сердца человека и разработки соответствующих векторов AAV (реферат 1213). Наконец, как недавно показали Chen и др. (58), можно разработать синтетические капсиды AAV у грызунов, которые также хорошо работают в различных моделях NHP, в данном примере в периферической нервной системе мышей, крыс, мартышек и макак. С одной стороны, капсиды, которые широко активны среди мелких и крупных видов животных, дают преимущества в отношении доклинической характеристики, включая исследования токсичности, и поэтому являются желательными. С другой стороны, совокупность этих последних данных также поднимает важные вопросы об оптимальных животных моделях и биологических причинах, лежащих в основе заметно отличающейся биоактивности разработанных капсидов AAV, которые функционируют исключительно в мелких или крупных животных, соответственно, чьи характеристики различаются между штаммами в пределах одного вида мышей или NHP, или которые плохо транслируются от животных к человеку.

Для начала решения этих сложных и всеобъемлющих вопросов, интригующей задачей на будущее является сравнение ведущих кандидатов на основе AAV9 или перетасованного костяка (бэкбона) с идентичной дозой и у здоровых и больных, мелких и крупных животных, например, с использованием технологии штрих-кодирования, для получения дальнейших знаний о последовательности и структурных компонентах, определяющих мышечный тропизм у разных видов вплоть до человека и в нормальных и пораженных тканях.

Примечательно, что в данной работе мы уже проверили миотропные свойства этих биоинженерных капсидов на здоровых мышах четырех различных штаммов, т.е. C57BL/6, NMRI, 129PAS и CB17/lcrTac/Prkdcscid, и они также поддерживались в двух моделях мышечных заболеваний, полученных из C57BL/6 и 129PAS, что подтверждает широкую применимость этих оригинальных AAV. Соответственно, мы предполагаем, что два оригинальных варианта AAV, созданные и охарактеризованные здесь, представляют собой захватывающие инструменты для применения на мыши, где требуется высокоспецифичный, простой и надежный перенос генов во всю мускулатуру при системной доставке как для фундаментальных исследований, так и для доклинической оценки терапевтических концепций на здоровых или больных животных. По причинам, изложенным выше, эти капсиды или будущие производные с перестановкой аминокислот, окружающих мотив RGD, вероятно, обладают таким же большим потенциалом для генотерапии мышц у людей, включая пациентов с DMD или XLMTM. Хотя в предстоящей работе будет рассмотрен и решен вопрос о переносимости на другие виды, включая больных людей, главное преимущество настоящей работы заключается в том, что она уже иллюстрирует огромный потенциал для получения уникальных векторов генотерапии путем сочетания нескольких технологий направленной эволюции AAV, инженерии капсидов и грузов, а также высокопроизводительного скрининга in vivo с помощью NGS и штрихового кодирования в последовательном и полу-последовательном порядке.