Последнее обновление: 01/26/2025 06:04:25  Меню и поиск на этом сайте   ЗДЕСЬ  Дополнительная информация   ЗДЕСЬ!!
WMZ: Z191701361450
WMR: R209318204033


Без рекламы только Браузер Uran (скачать )
   Посещений:
МИОПАТИИ, СВЗАННЫЕ С RyR1



Возможнось генотерапии

Gene therapies for RyR1-related myopathies
Isabelle Marty, Mathilde Beaufils, Julien Faure, John Rendu
Current Opinion in Pharmacology Volume 68, February 2023, 102330

Myopathies related to variations in the RYR1 gene are genetic diseases for which the therapeutic options are sparse, in part because of the very large size of the gene and protein, and of the distribution of variations all along the sequence. Taking advantage of the progress made in the gene therapy field, different approaches can be applied to the different genetic variations, either at the mRNA level or directly at the DNA level, specifically with the new gene editing tools. Some of those have already been tested in cellulo and/or in vivo, and for the development of the most innovative gene editing technology, inspiration can be sought in other genetic diseases.

Рианодиновый рецептор 1 типа (RyR1) является основным внутриклеточным кальциевым каналом в скелетных мышцах. В ассоциации с дигидропиридиновым рецептором (DHPR), активируемым напряжением кальциевого канала, он составляет ядро комплекса высвобождения кальция (CRC), ответственного за высвобождение внутриклеточного кальция, вызывающего мышечное сокращение [1]. Функция RyR1 жестко регулируется пост-трансляционными модификациями, такими как фосфорилирование, S-нитрозилирование, окисление, а также регуляторными белками и внутриклеточными концентрациями ионов [2]. Мутации в гене RYR1 могут непосредственно изменять канализационную функцию белка (усиление или ослабление функции) или вызывать уменьшение количества белка [1,3], что приводит к изменению гомеостаза цитозольного кальция. С патогенными вариациями RYR1 связано множество различных миопатий, таких как Central Core Disease (CCD), Multi-mini core Disease (MmD), Centronuclear Myopathy (CNM), Congenital fiber type disproportion (CFTD), которые в настоящее время называют "с RyR1-связанными миопатиями" или RyR1-RM. Методы лечения RyR1-RM ограничены рядом особенностей гена и белка RYR1, среди которых размер гена (15 кб для транскрипта) и белка (более 5.000 аминокислот), образующего гомотетрамер более 2-х MDa. В настоящее время изучаются два варианта терапии: фармакологическая терапия с использованием химических молекул и генотерапия, схематически включающая ДНК- или РНК-направленную терапию, классифицированную Европейским агентством по лекарственным средствам и Управлением по контролю за продуктами и лекарствами США. Обе терапевтические стратегии имеют свои особенности, которые наделяют их сильными и слабыми сторонами. В целом, фармакологическая терапия проводится обычно с помощью небольшой химической молекулы, которую дают регулярно (каждый день или каждую неделю), перорально или путем внутривенного введения. Фармакологическая терапия направлена на часть или все нижележащие патофизиологические механизмы. Генотерапия обычно проводится с помощью большой молекулы ДНК/РНК, которую вводят пациентам один или несколько раз. Генотерапия направлена непосредственно на пораженный ген или его продукты, находящиеся выше различных патофизиологических механизмов, и поэтому ее действие охватывает широкий спектр последствий, которые теоретически можно обратить вспять одним и тем же лечением. Фармакологические подходы являются единственными методами лечения RyR1-RM, которые в настоящее время проходят клинические испытания. Недавно было завершено рандомизированное двойное слепое плацебо-контролируемое исследование (фаза I/II) с применением антиоксиданта (N-ацетилцистеина), которое, к сожалению, не уменьшило ранее выявленный повышенный окислительный стресс и не улучшило физическую активность пациентов [4]. В текущем исследовании используется так называемая молекула Rycal (S48168), регулирующая функцию канала RyR1 (идентификатор ClinicalTrials.gov NCT4141670, [5]), для уменьшения утечки кальция, возникающей в результате подмножества патогенных вариаций. В дополнение к фармакологической терапии генотерапия сегодня представляется привлекательным решением для этих генетических заболеваний. Действительно, использование фармакологии привлекательно тем, что его легко осуществить (например, когда молекула предоставляется перорально, как NAC или S48168), легко прервать в случае неблагоприятных побочных эффектов и независимо от точной мутации. Но она может иметь низкую эффективность (возможно, не все патофизиологические механизмы будут скорректированы) и необходимость длительного/постоянного лечения. С другой стороны, генотерапия представляется единым, высокоэффективным (поскольку мишень будет находиться выше всех последствий изменения) и окончательным методом лечения, но как таковой он должен быть полностью освоен, чтобы убедиться в его безопасности перед внедрением у любого пациента, поскольку он не может быть отменен в случае неблагоприятного побочного эффекта. Кроме того, необходимо учитывать биологический риск (например, при использовании вирусных векторов). Генотерапия очень быстро развивается, и данный обзор посвящен последним достижениям в этой области и их потенциальному применению к RyR1-RM. Первые продукты генотерапии уже поступили в продажу для лечения Spinal Motor Atrophy-SMA [6] и находятся в стадии клинических испытаний для лечения мышечной дистрофии Дюшенна-DMD [7]. Таким образом, вдохновение для генотерапии RyR1-RM ищут в этих двух нейродегенеративных заболеваниях, при этом все представленные в данном обзоре подходы для RyR1-RM находятся в лучшем случае на доклинической стадии на мышиных моделях. Понятие "лекарственные препараты для генотерапии" включает в себя как стратегии, изменяющие мРНК, такие как модуляция сплайс-вариантов и пропуск экзонов, так и терапии, изменяющие ДНК, такие как замена генов, редактирование генов и модуляция генов . Одним из важных вопросов при нервно-мышечных заболеваниях является возможность воздействия на все мышцы тела, и особенно на дыхательные мышцы (диафрагма и межреберные мышцы), которые являются одними из менее доступных для инъекций. В настоящее время эта проблема решается путем системной доставки вирусных векторов, таких как адено-ассоциированный вирус (AAV), но системная доставка требует использования высоких доз вирусного вектора, что увеличивает воздействие/риск побочных явлений, связанных с вектором.
RYR1, будучи очень большим геном, несовместим с возможностью современных вирусных векторов к упаковке. Первые подходы генотерапии, направленные на коррекцию патогенных вариаций RYR1, были разработаны на уровне мРНК, благодаря использованию siRNA или антисмысловых олигонуклеотидов (AON).
В двух моделях мышей с доминантными мутациями RYR1 специфический нокдаун мутантного аллеля in vivo был осуществлен с помощью мутант-специфичных siRNA, введенных в мышцу flexor digitorum brevis [8]. Несмотря на успех, этот подход ограничен встраиванием siRNA во все мышцы мишени и, таким образом, ограничен мышцами, доступными для инъекции и электропорации. Кроме того, восстановление функции мышц отражает эффективность нокаута мутантного аллеля и требует шагов по оптимизации для каждой мутации и пациента с использованием специфических для пациента siRNA.
Анти-смысловые олигонуклеотиды (AONs) также использовались для модуляции сплайсинга RYR1, что является успешной стратегией в случае патогенных вариаций, изменяющих сплайсинг и ответственных за наличие дополнительного экзона [9]. AONs модулируют распознавание сайтов сплайсинга путем связывания на уровне первичного транскрипта за счет комплементарности последовательностей. Возникающая стерическая помеха блокирует распознавание и прикрепление эффекторов сплайсинга к сайтам, тем самым предотвращая включение целевого экзона в конечную мРНК. Для повышения эффективности последовательность AON была слита с последовательностью U7 snRNP и интегрирована в вирусный вектор [9]. Такая стратегия была широко разработана для другой миопатии, DMD, и является одной из наиболее перспективных стратегий для этого заболевания, позволяющих пропустить экзон, содержащий преждевременный STOP-кодон, и восстановить рамку считывания, что приводит к производству более короткого, но функционального белка. Недавно долгосрочное клиническое исследование II фазы по пропуску экзона 53 дистрофина у подходящих пациентов [10] продемонстрировало эффективность этого подхода.
К сожалению, аналогичная стратегия может быть применена к пациентам с RyR1-RM только при наличии дополнительного экзона, вызванного вариацией, поскольку ни один из 106 экзонов гена RYR1, кроме двух альтернативных экзонов 70 и 83, не является незаменимым. Кроме того, пропуск многих экзонов приводит к нарушению рамки считывания или делеции важных функциональных/структурных доменов (рис. 1). На сегодняшний день не было идентифицировано ни одного усеченного и, тем не менее, функционального RyR1.
Поскольку экзоны могут быть пропущены, был разработан и обратный подход для принудительного сохранения целевых экзонов. Когда вариация упраздняет консенсусный донорский сайт сплайсинга, модифицированная U1 snRNP, приспособленная для связывания мутировавшей последовательности, может заставить механизм сплайсинга включить экзон в транскрипт. Поскольку фиксация U1 snRNP является первым шагом процесса сплайсинга, его связывание запускает рекрутирование всей сплайсесосомы. Этот подход возможен только для вариаций донорских сайтов сплайсинга и требует специфического дизайна модифицированного U1 для каждой вариации [11]. Согласно базе данных ClinVar RYR1 [12,13], вариации донорских сайтов сплайсинга составляют более 53% сплайс-вариантов и около 6% от общего числа вариантов (рис. 2).
Также была разработана терапия модуляции сплайсинга для увеличения распознавания сайтов сплайсинга с помощью AONs, нацеленных на регуляторные элементы сплайсинга, такие как сайленсеры (вызывающие молчание). Стерические помехи, возникающие из-за дуплекса AON с мРНК, препятствуют распознаванию элемента сайленсера, что приводит к увеличению сплайсинга экзонов. Эта стратегия используется при SMA для восстановления правильного транскрипта [14]. Возможно, будущие исследования раскроют подобный механизм для гена RYR1, но на сегодняшний день регуляторные элементы в этом гене не идентифицированы и не изучены.
Хотя были получены многообещающие первоначальные результаты с использованием AONs и siRNA, дальнейшие исследования не использовали эти инструменты при RyR1-RM, в отличие от SMA и DMD, где они представляют собой один из перспективных терапевтических вариантов.
Другая модификация сплайсинга, основанная на физиологически редком процессе сплайсинга, который происходит между двумя различными молекулами мРНК, называется транс-сплайсинг. Он происходит естественным образом у трипаносом, Caenorhabditis Elegans и с низкой частотой у Homo Sapiens [15] и позволяет соединять экзоны из более чем одного транскрипта пре-мРНК с образованием одной химерной молекулы мРНК. Таким образом, в терапевтической перспективе любой мутировавший сегмент мРНК может быть заменен экзогенным не-мутировавшим (рис. 3). Главным преимуществом транс-сплайсинга является возможность направить одну и ту же молекулу на многих пациентов, чтобы исправить все вариации, присутствующие в одном и том же регионе. Хотя при DMD были получены обнадеживающие результаты [16], его использование в настоящее время ограничено очень низкой эффективностью.
Генная замена RyR1-RM заключается во введении во все мышцы новой функциональной копии гена RYR1 с помощью вирусного вектора. Несмотря на свою привлекательность, эта стратегия сталкивается с большим количеством проблем, специфичных для гена RYR1. Из-за размера транскрипта RYR1 и грузоподъемности вирусов, используемых для терапии (AAV имеют ограниченную емкость упаковки 4,7 кб, [17]), в настоящее время невозможно рассматривать возможность интеграции кодирующей последовательности RYR1 полной длины в какой-либо вирусный вектор, кроме векторов, полученных из вируса простого герпеса, с емкостью упаковки до 150 кб [18]. Однако в настоящее время разрабатываются альтернативные стратегии экспрессии больших генов в AAV [17]. На основании текущих клинических испытаний DMD с использованием мини- или микродистрофина [19], можно рассмотреть возможность экспрессии усеченного белка RyR1. Тем не менее, функциональный усеченный RyR1 никогда не был идентифицирован, а необходимое сокращение последовательности RYR1 было бы слишком большим и разрушительным (с 15 кб до 4,7 кб). Другой альтернативой может стать разделение последовательности RYR1 на несколько частей, каждая из которых будет соответствовать AAV, и полагаться на слияние различных сегментов с помощью механизма транс-сплайсинга - стратегия, которая была успешно адаптирована к дистрофину при DMD [16,20,21]. Это может стать многообещающим подходом, если эффективность нацеливания вирусных векторов будет достаточно высокой, чтобы убедиться, что различные AAV присутствуют в одном и том же мышечном волокне. Параллельно с разработкой оптимизированных последовательностей для переноса генов, активная область исследований посвящена оптимизации вирусных векторов. Недавним прорывом стала разработка так называемого Myo-AAV, который с высоким сродством нацелен на скелетные мышцы, в то время как его сродство к печени снижено [22], что позволяет использовать меньшее количество вирусных векторов по сравнению с AAV9. Этот инструмент может стать недостающим звеном для разработки эффективной генотерапии с уменьшенными побочными эффектами (текущее клиническое исследование было остановлено после смерти 3 пациентов, страдающих Х-сцепленной миотубулярной миопатией, в результате гепатотоксичности, связанной с высокой дозой AAV8 [23]). Еще одним узким местом в терапии замены генов для RyR1-RM является сомнение в ожидаемых преимуществах при наличии доминантной мутации, поскольку доминантный негативный эффект мутантного аллеля не будет стерт. Таким образом, такая стратегия может быть интересна только для рецессивных нулевых вариантов, возникающих в результате сдвига рамки считывания, не-смысловых или сплайс-вариантов, приводящих к нонсенс-опосредованному распаду (NMD), и гипоморфных миссенс-мутантов (приводящих к уменьшению количества белка RyR1). В общей сложности он может быть применен к не менее 43% патогенных или вероятно патогенных вариантов RYR1 базы данных ClinVar и LOVD (рис. 2), даже больше, если учитывать рецессивные миссенс-варианты, и поэтому этот подход стоит того, чтобы потратить силы на его разработку.
После революционного открытия CRISPR/Cas9 [24] редактирование генов, позволяющее удалять, изменять, вставлять или заменять сегмент ДНК, быстро стало методом выбора для лечения генетических заболеваний, в частности RyR1-RM, для которого терапевтические возможности ограничены. Еще предстоит полностью освоить ряд этапов, прежде чем использовать редактирование генов CRISPR/Cas9 в качестве безопасного и эффективного терапевтического подхода, но эта область исследований быстро развивается и открывает большие перспективы для лечения нервно-мышечных заболеваний [25]. Что касается замены генов, то основной проблемой является интеграция инструментов CRISPR/Cas9 (нуклеазы Cas9 и направляющей одиночной РНК) в мышечные волокна, чему будет способствовать совершенствование вирусных векторов для терапии мышц [26]. Поскольку Cas9 намного меньше, чем RYR1, его интеграция в мышцы должна быть улучшена за счет использования Myo-AAV [22] или сконструированных вирусоподобных частиц [27].
Нуклеаза Cas9, будучи введенной в клетку, вызывает разрыв двойной нити в специфической локализации, определяемой guide RNA (gRNA). Этот двухцепочечный разрыв в мышечном волокне в конечном итоге приведет к инсерции-делетированию с помощью механизма репарации, так называемого "негомологичного соединения концов (NHEJ)", что приведет к замалчиванию целевого гена или пропуску экзонов в целевом гене мишени (репарация с помощью механизма гомологичного направленного восстановления-HDR здесь не рассматривается, поскольку неэффективна в неделящемся мышечном волокне). Этот подход был успешно использован в доказательстве концепции in vivo на мышах для пропуска экзонов в гене дистрофина, что привело к делеции мутантного экзона 23, вызывающего заболевание [28-30]; обзор Chemello et al. [25]. Как упоминалось ранее, пропуск экзонов в гене RYR1 может распространяться только на дополнительный экзон(ы), и, таким образом, эта стратегия может быть использована для ограниченного числа пациентов. Кроме того, она может быть использована для удаления мутантного аллеля при наличии доминантной мутации, подобно тому, как это было сделано с помощью siRNA [8].
Редактирование оснований - это усовершенствованная версия редактирования генов, которая позволяет напрямую преобразовывать одно основание мишень ДНК в другое программируемым образом, что идеально подходит для коррекции точечных мутаций. Оно осуществляется с помощью редактора оснований вместо нуклеазы, что позволяет редактировать одну пару оснований вместо создания двухцепочечного разрыва (DSB), поэтому механизмы репарации ДНК не задействованы [31,32]. Редакторы оснований существуют в различных подтипах: редактор оснований цитозина, способный менять С на Т, и редактор оснований аденина, способный менять А на G [33]. Технологические усовершенствования быстро позволили применить редактирование оснований in vivo для лечения нервно-мышечных заболеваний, таких как DMD [34,35]. Самым последним усовершенствованием в этой области стала технология редактирования праймеров [36], которая позволяет производить все изменения оснований в дополнение к небольшим вставкам и делециям [33]. Совершенствование системы редактирования праймеров идет такими темпами, что терапевтическое применение можно предвидеть в самом ближайшем будущем [37]. RyR1-RM может извлечь выгоду из такой технологии, и теоретически 97% вариаций RYR1 могут быть исправлены с помощью прайм-редактирования (рис. 2), и только делеции или вставки большого размера на сегодняшний день невозможно исправить...
Фрагменты разделов
Заключение


После бурного развития методов генетического скрининга для выявления вариаций в генах, вызывающих заболевания, наступила новая эра исследований - генотерапия. Первоначально немногочисленные отчасти из-за размера гена RYR1 и его продуктов, количество терапевтических вариантов коррекции вариаций, ответственных за RyR1-RM, быстро расширяется. Вариации в гене RYR1 распространены по всей последовательности, отвечают за доминантное или рецессивное заболевание, и только некоторые из них являются рецидивирующими (на основе LOVD)...