Травматическое повреждение спинного мозга (SCI) - это разрушительное жизненное событие, в результате которого около 90% пациентов получают значительную долгосрочную инвалидность, включая сенсомоторные нарушения, потерю независимости и снижение качества жизни (Ahuja et al., 2017). По оценкам, в мире насчитывается 27 миллионов человек, живущих с последствиями SCI (GBD 2016 Traumatic Brain Injury and Spinal Cord Injury Collaborators, 2019). Регенерацию центральной нервной системы (ЦНС) часто называют святым Граалем неврологии. Препятствия, которые необходимо преодолеть, огромны, включая физический барьер кистозных полостей, наличие многочисленных ингибирующих молекул, таких как хондроитинсульфатные протеогликаны, которые создают неблагоприятную среду, и ограниченную внутреннюю способность взрослых нейронов ЦНС к регенерации (Fawcett, 2019).

Генотерапия - это применение генетического материала для исправления мутаций, вызывающих заболевания, снижения уровня генов, способствующих развитию болезни, или доставки генов, кодирующих молекулы с терапевтическим потенциалом. Наиболее широко используемыми векторами для доставки генов являются вирусные векторы, включая аденовирусы, адено-ассоциированные вирусы (AAV) и лентивирусы (LV), последний из которых относится к роду ретровирусов (Cring and Sheffield, 2022). Невирусные векторы, включая липосомы и наночастицы, могут быть использованы вместо вирусных векторов благодаря их способности переносить более длинные генетические последовательности (Uchida et al., 2014). Другой подход - редактирование генома, революцию в котором произвела разработка технологии CRISPR-Cas9 в 2012 году (Dunbar et al., 2018). Подходы генотерапии, исследуемые в доклинических моделях SCI включают доставку генов в спинной мозг in vivo для повышения экспрессии промоторов аксонального роста или подавления ингибиторов с помощью коротких шпилечных РНК (shRNA) или малых интерферирующих РНК (siRNA) (Bo et al., 2011; Zavvarian et al., 2020). Это потенциально может преодолеть некоторые ограничения прямого введения лекарств и рекомбинантных белков. Например, уже давно установлено, что хондроитиназа ABC (ChABC) может разрушать хондроитинсульфатные протеогликановые цепи и способствовать восстановлению функций после инсульта на животных моделях (Bradbury et al., 2002), но из-за короткого периода полураспада фермента требуется повторное инвазивное дозирование. Поэтому в последние годы для доставки ChABC были изучены подходы генной терапии (Burnside et al., 2018).

В нескольких описательных обзорах обсуждался потенциал генотерапии для восстановления спинного мозга (Bo et al., 2011; Uchida et al., 2014; Zavvarian et al., 2020), но, насколько нам известно, систематического обзора и мета-анализа не существует.

В подавляющем большинстве исследований генотерапия применялась локально путем введения в место травмы (n = 41), интраспинальных (n = 20), интратекальных (n = 5) или комбинации в место травмы и интраспинальных инъекций (n = 1). Сроки введения препаратов варьировались от 1 недели до травмы (n = 1) до 3 недель (n = 1) после травмы, при этом наиболее распространенной временной точкой было 0 часов (n = 34). Следует отметить, что в пяти исследованиях не было четко указано время введения препарата.

В общей сложности в семи исследованиях генотерапия применялась в сочетании с биоматериалами (n = 4), такими как фибриновые гели (Tsai et al., 2017; Shi et al., 2019), стволовые клетки (n = 1) и ChABC (n = 2). Blits et al. (2003) имплантировали мостики между шванновскими клетками в очаг поражения одновременно с AAV-векторами, содержащими brain-derived neurotrophic factor и NT-3. Только в трех исследованиях в качестве иммунодепрессанта совместно назначался циклоспорин (Hwang et al., 2009; Lee et al., 2009, 2011).

Затем мы приступили к анализу вторичных результатов. Мы включили 24 исследования (28 сравнений) в мета-анализ данных по аксональному росту (рис. 3). В целом, генотерапия привела к улучшению роста аксонов по сравнению с контролем (SMD: 2,78, 95% ДИ: 1,92-3,65, P < 0,0001, Tau2 = 4,13, I2 = 85,5%). Только 3 исследования включали данные о вызванной механической гиперчувствительности задней лапы, и поскольку в нашем протоколе мы определили 10 баллов как минимум, мы не смогли проанализировать этот вторичный показатель.

Figure 3: Forest plot of axonal regrowth data.Effect sizes are expressed as standardized mean difference (SMD) and 95% confidence intervals (CIs). A positive SMD represents increased axonal regrowth. The overall estimated effect size was 2.78 (95% CI: 1.92-3.65). javascript:void(0) Figure 4: Funnel plots for assessing the risk of publication bias.(A, B) The asymmetric funnel plot in the locomotor score dataset is suggestive of publication bias (A) and the trim-and-fill analysis (B) estimated there were 2 "missing" unpublished studies (unfilled circles) on the left-hand side of the plot with negative effect sizes favoring control. (C, D) Similarly, there was also pronounced asymmetry in the funnel plot of the axonal regrowth outcome (C) with trim-and-fill analysis again estimating 2 "missing" studies (D). The dotted lines represent 95% confidence intervals.

Мы выявили 71 исследование, которые соответствовали критериям включения в наш систематический обзор и мета-анализ генотерапий в доклинических моделях SCI. В целом, наш мета-анализ показал, что лечение с помощью генотерапии приводит к значительному улучшению показателей опорно-двигательного аппарата и усилению аксонального роста по сравнению с контролем. Мы наблюдали значительную асимметрию на funnel plots для обоих показателей, что указывает на наличие предвзятости публикаций. Однако анализ "trim-and-fill" позволил оценить лишь незначительное количество "отсутствующих" исследований с отрицательным или нейтральным размером эффекта в обоих наборах данных. Далее мы сообщили, что средний балл риска необъективности составил 4 (IQR: 3-5) при оценке с помощью модифицированного контрольного списка CAMARADES. Хотя в подавляющем большинстве исследований использовалось blinding, а отчетность о сокрытии распределения и расчеты мощности отсутствовали.

Хотя генотерапия ассоциировалась с улучшением обоих показателей исхода, наблюдалась большая неоднородность применяемых методов лечения. В общей сложности 58 различных генов были выбраны в качестве мишеней, включая доставку промоторов аксонального роста мозгового нейротрофического фактора, NT-3 и NGF. В качестве альтернативного подхода в некоторых исследованиях ингибиторы регенерации аксонов, такие как Nogo (Liu et al., 2016) и его рецептор-негативный регуляторный белок роста 1 (Lv et al., 2012; Zhao et al., 2018), подавлялись с помощью siRNAs или shRNAs. Учитывая сложную патофизиологию SCI представляется маловероятным, что только генотерапия сможет вызвать существенное восстановление у пациентов (Griffin and Bradke, 2020). Однако только в 7 из 71 включенных исследований генотерапия применялась как часть комбинаторного подхода.

Потенциальным ограничением нашего мета-анализа был акцент на восстановлении двигательной активности. Поскольку для соответствия критериям включения исследования должны были оценивать двигательные показатели, мы могли исключить исследования, посвященные потенциалу генотерапии для регенерации сенсорных нервов и лечения невропатической боли. Это может объяснить, почему только три исследования оценивали вызванную механическую гиперчувствительность задней лапы, и поэтому было невозможно провести мета-анализ по этому показателю. Мы выбрали оценку локомоторных показателей (включая локомоторную рейтинговую шкалу Basso, Beattie and Bresnahan и шкалу Basso для мышей) в качестве основного показателя, поскольку это наиболее широко используемые поведенческие тесты для оценки функционального восстановления в доклинических моделях SCI (Watzlawick et al., 2019). Несмотря на простоту проведения и низкую стоимость, мы признаем, что недостатком локомоторных оценок является субъективность (Silva et al., 2014). Еще одним возможным ограничением в нашем мета-анализе было то, что все сравнения в нашем анализе подгрупп были недостоверными. Это можно объяснить недостатком мощности. В нашем анализе мы отметили высокую гетерогенность и несбалансированные подгруппы, что может увеличить количество исследований, необходимых для достижения достаточной мощности при анализе подгрупп (Cuijpers et al., 2021).

Важным результатом исследований, включенных в наш мета-анализ, стало то, что только в одном исследовании использовалась модель шейного SCI. Это резко контрастирует с клинической популяцией, в которой ~60% травматических повреждений приходится на шейный уровень (Ahuja et al., 2017). Около 32% пациентов имеют торакальный SCI, но в 93% включенных нами исследований использовалась торакальная модель. Поэтому мы рекомендуем в будущих исследованиях уделять больше внимания оценке эффективности генотерапии на шейных моделях, чтобы повысить трансляционный потенциал. Однако мы признаем, что при этом могут возникнуть проблемы, включая респираторную дисфункцию, более высокий уровень смертности и повышенные потребности в послеоперационном уходе (Sharif-Alhoseini et al., 2017). Еще одним ограничением, которое может повлиять на клинический перевод, является отсутствие исследований, в которых изучались бы подострые и хронические временные точки введения генотерапии. Хотя это увеличит стоимость исследований, эти временные точки также необходимо изучить, поскольку патофизиология существенно отличается от острой SCI.

Постоянной проблемой доклинических исследований является неадекватная отчетность об исследованиях и, в частности, меры по снижению предвзятости, такие как исследования в слепую и рандомизация. Для решения этой проблемы Национальный центр по замене, доработке и сокращению численности животных (NC3Rs) совместно с группой экспертов разработал Руководство по исследованиям на животных: Отчетность об экспериментах in vivo (ARRIVE) Guidelines (Percie du Sert et al., 2020). Хотя многие журналы поддержали эти рекомендации и начали требовать от авторов представления заполненного контрольного списка ARRIVE, рандомизированное контролируемое исследование рукописей, представленных в PLoS One, показало, что соблюдение рекомендаций все еще не соблюдается (Hair et al., 2019). Издательская группа Nature внедрила свой контрольный список для снижения риска предвзятости в доклинических исследованиях. Хотя это и привело к некоторым улучшениям по сравнению с подачей рукописей в журналы без такой политики, все же необходимы улучшения, включая представление расчетов мощности (NPQIP Collaborative Group, 2019). По аналогии с этим мы обнаружили, что очень мало исследований включали расчеты мощности и сообщали о сокрытии локализации (allocation concealment).

После десятилетий клинических испытаний в последние годы было одобрено несколько методов генотерапии, включая Zolgensma на основе AAV9 для лечения спинальной мышечной атрофии (Европейское агентство по лекарственным средствам: EMA/173982/2020, 2020). Безопасность нескольких типов вирусных векторов, особенно AAV (Nathwani et al., 2014; Colella et al., 2018), широко освещена. В то время как клинические испытания клеточных методов лечения SCI продолжаются уже несколько лет, генотерапия SCI еще не прошла клинические испытания. Консорциум под названием CHASE-IT, поддерживаемый International Spinal Research Trust, планирует провести клиническое испытание лентивирусов, опосредованных экспрессией mammalinized ChABC (International Spinal Research Trust, 2021). Однако одной только деградации ингибирующих хондроитинсульфатных протеогликанов в месте повреждения может быть недостаточно для успешной регенерации аксонов и восстановления функций. Как уже говорилось ранее, комбинаторные подходы, вероятно, являются ключом к успешному восстановлению SCI. Генотерапия может потребовать сочетания с клеточной терапией, биоматериалами и другими стратегиями, такими как реабилитация и эпидуральная стимуляция (Bo et al., 2011).

В заключение, наш систематический обзор и мета-анализ показывают, что генотерапия многообещающе проявляет себя в доклинических моделях SCI. Хотя был изучен широкий спектр генов, нет единого мнения о том, какой ген или гены наиболее эффективны в стимулировании аксонального роста. Вполне вероятно, что для успешного отрастания аксонов необходимо воздействовать на несколько генов в различных типах клеток, таких как поврежденные нейроны в ЦНС или первичные сенсорные нейроны и глиальные клетки в месте повреждения.