Посещений: 
БОКОВОЙ АМИОТРОФИЧЕСКИЙ СКЛЕРОЗ И СПИНАЛЬНАЯ МЫШЕЧНАЯ АТРОФИЯ
Гентерапевтические подходы
Gene Therapy in ALS and SMA: Advances, Challenges and Perspectives Jan Lejman,Kinga Panuciak,Emilia Nowicka et al.
 Int. J. Mol. Sci. 2023, 24(2), 1130; https://doi.org/10.3390/ijms24021130
|
Gene therapy is defined as the administration of genetic material to modify, manipulate gene expression or alter the properties of living cells for therapeutic purposes. Recent advances and improvements in this field have led to many breakthroughs in the treatment of various diseases. As a result, there has been an increasing interest in the use of these therapies to treat motor neuron diseases (MNDs), for which many potential molecular targets have been discovered. MNDs are neurodegenerative disorders that, in their most severe forms, can lead to respiratory failure and death, for instance, spinal muscular atrophy (SMA) or amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Despite the fact that SMA has been known for many years, it is still one of the most common genetic diseases causing infant mortality. The introduction of drugs based on ASOs—nusinersen; small molecules—risdiplam; and replacement therapy (GRT)—Zolgensma has shown a significant improvement in both event-free survival and the quality of life of patients after using these therapies in the available trial results. Although there is still no drug that would effectively alleviate the course of the disease in ALS, the experience gained from SMA gene therapy gives hope for a positive outcome of the efforts to produce an effective and safe drug. The aim of this review is to present current progress and prospects for the use of gene therapy in the treatment of both SMA and ALS.
|
Генотерапия - это терапевтический инструмент, который может обеспечить пожизненный терапевтический эффект. Она основана на доставке функционального генетического материала в клетки, в которых будет непрерывно синтезироваться соответствующий продукт. Преимущество этой терапевтической стратегии перед другими заключается в том, что она не требует многократных доз вводимого препарата [1]. Целенаправленная на РНК терапия определяет роль в открытии лекарственных средств.
РНК-модифицирующая терапия основана на использовании антисмысловых олигонуклеотидов (ASOs) и малых интерферирующих РНК (siRNAs), а вирусные векторы являются примерами уникальных методов, используемых в описываемой стратегии лечения [1,2]. ASOs представляют собой одноцепочечные аналоги дезоксинуклеотидов. Они могут изменять экспрессию генов путем регуляции трансляции белков, связывания РНК или вмешательства в механизм сплайсинга. Существуют различные классы ASOs, в том числе: одноцепочечные ASOs первого класса, деградирующие специфическую РНК или модулирующие ее метаболизм под действием фермента RNaseH, и двуцепочечные синтетические олигонуклеотиды второго класса, деградирующие РНК через РНК-индуцированный комплекс сайленсинга (RISC) [3]. В настоящее время препараты на основе ASOs используются для лечения различных заболеваний, например: mipomersen - для гомозиготной семейной гиперхолестеринемии, fomivirsen - цитомегаловирусного ретинита, miravirsen - гепатита С (HCV), eteplirsen - мышечной дистрофии Дюшенна, Spinraza - для спинальной атрофии мышц [2,4,5]. Основными недостатками препаратов на основе ASOs являются короткий период полураспада, необходимость пожизненного повторного дозирования и неспособность преодолевать гематоэнцефалический барьер [1,3]. Малые интерферирующие РНК представляют собой РНК-дуплексы, которые, включая нити, ведущие к комплексу РНК-индуцированного сайленсинга, вызывают сайленсинг генов, называемый РНК-интерференцией. Малые интерферирующие РНК могут быть сконструированы таким образом, чтобы быть полностью комплементарными мРНК гена-мишени [2]. Терапия малыми интерферирующими РНК чаще всего применяется для лечения рака, но она также дает многообещающие результаты при лечении генетических и неврологических заболеваний [5,6]. Связывание ASOs и siRNA с целевыми РНК имеет много общего и может быть использовано для подавления генов через различные внутриклеточные механизмы, приводящие к замалчиванию генов [4]. Вирусные векторы могут быть использованы в генотерапии благодаря их способности доставлять терапевтические гены в центральную нервную систему. В этом методе используются аденовирусы, ротавирусы и вирус простого герпеса (HSV). Они должны обладать низкой иммуногенностью и низкой генотоксичностью, а их эффективность зависит от типа векторов. Большое значение имеют аденоассоциированные вирусы (AAV), которые являются перспективными непатогенными векторами, используемыми для лечения нейродегенеративных заболеваний. AAV - это одноцепочечная ДНК, принадлежащая к семейству Parvoviridae и имеющая несколько серотипов. После системного введения одного из них - AAV9 - наблюдалась высокая экспрессия в шейном отделе спинного мозга, гиппокампе, моторной коре, мозжечке и substantia nigra, что указывает на возможность использования этого метода при заболеваниях нервной системы [2,7]. К числу заболеваний, при которых в лечении motor neuron diseases (MNDs) используются вышеупомянутые методы, относятся SMA и ALS [1,2] (рис. 1).
 Figure 1. Different strategies used in gene therapy.
Motor neuron diseases (MNDs) are a group of neurodegenerative disorders, which, among others, include amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and spinal muscular atrophy (SMA). The two diseases differ in etiology, age of onset, survival rates and progression rates. However, both lead to a common symptom of motor neuron degeneration, resulting in muscle wasting, progressive respiratory failure and premature death. For this reason, therapies used for one of these diseases may become a starting point for the development of new forms of treatment for the other. Currently, gene therapy is a strategy with a promising prognosis for the treatment of genetically inherited and sporadic forms of both disorders [1,2].
2. Спинальная мышечная атрофия
Спинальная мышечная атрофия (SMA) - аутосомно-рецессивное нейродегенеративное заболевание, обусловленное дефицитом белка выживания мотонейронов (SMN). Нарушение выработки полноразмерного белка SMN является результатом мутации или делеции гена SMN1, расположенного на хромосоме 5q13.2 [8].
Белок SMN играет ключевую роль в патогенезе SMA. Он участвует в поддержании клеточного гомеостаза. SMN отвечает за правильное формирование сплайсосомы и биосинтез рибонуклеопротеидов [9]. Он может обеспечивать сборку charge (загружнных) молекул РНК с различными белками, необходимыми для эффективного транспорта или локальной трансляции [10]. SMN модулирует экспрессию многих элементов, участвующих в репарации ДНК или обладающих антиапоптотическим действием [11]. Дефицит белка SMN приводит к дегенерации α-мотонейронов в передних рогах спинного мозга и, как следствие, к постепенной атрофии мышц [12]. Кроме того, известно, что при более тяжелых формах SMA поражаются дополнительные типы клеток и тканей, вызывающие симптомы, не связанные с двигательными нейронами. Количество хондробластов в гипертрофированной зоне пластинки роста значительно снижается, что приводит к нарушению развития костей [13]. Дефекты ангиогенеза и созревания сосудов, обусловленные дефицитом SMN, усиливают гипоксию двигательных нейронов, тем самым участвуя в патогенезе SMA [13,14]. SMA - прогрессирующее и гетерогенное заболевание. Возраст начала заболевания, тяжесть клинической картины и продолжительность жизни определяют пять типов SMA. Независимо от подтипа, бремя заболевания SMA значительно и влияет на пациентов сложным образом. Без соответствующей терапии она приводит к мышечной слабости, параличу и, как следствие, в тяжелых случаях - к смерти в результате дыхательной недостаточности [15,16].
Полное отсутствие белка SMN при потере обоих генов SMN1 и SMN2 является летальным дефектом. Большее количество копий SMN2 обычно ассоциируется с более высоким уровнем SMN и более легким течением заболевания. SMN2 - это ген, практически идентичный по последовательности SMN1. Ключевым отличием является замена С-Т в положении 6 в экзоне 7 (C6U), что приводит к альтернативному сплайсингу и исключению экзона 7 чаще всего (80-85%). В процессе трансляции усеченного транскрипта SMN2 образуется нестабильный и частично функциональный белок SMNΔ7 (рис. 1). При аномальной структуре гена SMN1 полноразмерный SMN, образующийся в результате трансляции SMN2, не способен полностью предотвратить появление симптомов SMA [16].
Механизмы, связанные с изменением сплайсинга SMN2 путем восстановления включения экзона 7, являются мишенью генотерапии, применяемой в настоящее время для лечения SMA [17]. Из позитивных регуляторов сплайсинга SMN2 наиболее известными в настоящее время являются серином/аргинином-богатый сплайс-фактор 1 (SRSF1) и гомолог бета-трансформатора 2 (Tra2B), которые связываются непосредственно с экзоном 7, усиливающим сплайсинг, в областях SE1 и SE2. Сообщается, что гетерогенный ядерный рибонуклеопротеин A1 (hnRNP A1) и src-связанный субстрат при митозе 68 (Sam68) обладают ингибирующей активностью в отношении сплайсинга SMN2. Исключение экзона 7 может происходить за счет связывания интронной последовательности N1 сайленсера (ISS-N1) или последовательности hnRNP A1 с SE2. Замена C6U также приводит к связыванию A1 или Sam68 hnRNA с SE1 вместо положительного регулятора [18-20]. К другим факторам, участвующим в регуляции сплайсинга, относятся SRp30c, TDP-43, TIA1, hnRNP Q и hnRNP G [21]. Другой причиной пропуска экзона 7 может быть повышенная активность регуляторной последовательности, расположенной на 3' конце экзона 7 и называемой терминальной стебельчатой петлей 2 (TSL2). Она негативно регулирует сплайсинг, возможно, конкурируя с U1 snRNP за сайт связывания [22]. Модификация сплайсинга экзона 7 SMN2 путем воздействия на его регуляторы имеет доказанную терапевтическую пользу [22,23].
На данном этапе следует упомянуть и о других эффективных подходах, которые успешно применяются у пациентов со SMA. Подходы CHOP-INTEND (Children's Hospital of Philadelphia Infant Test of Neuromuscular Disease) и HINE (Hammersmith Infant Neurological Examination) используются для оценки эффекта лечения у пациентов со SMA. Согласно шкале CHOP-INTEND, функциональная оценка заключается в анализе спонтанных или преднамеренных движений и наблюдении за мелкой моторикой. Для этого пациенту необходимо выполнить 16 поз. Тест оценивается от 0 до 64 баллов (0-4 балла за каждый пункт). В основном он используется для оценки наиболее тяжелых типов SMA [24]. HINE - это клинический неврологический тест для детей в возрасте от 2 до 24 месяцев, который позволяет оценить способность ходить или сидеть, что может дать важную прогностическую информацию для будущего моторного развития. Тест состоит из трех частей: (1) неврологический осмотр (26 пунктов, оцениваемых по шкале от 0 до 3; общее количество баллов - 78), оценивающий функцию черепных нервов, позу, движения, напряжение, рефлексы и реакции; (2) моторные вехи (8 пунктов без оценки) и (3) поведение (3 пункта без оценки). Общий балл может быть классифицирован как оптимальный (более 73) или субоптимальный. Также существуют модификации этого опросника для оценки двигательной функции людей с более легкими формами SMA [25]. Motor Function Measure (MFM) - еще один оценочный инструмент для численного измерения двигательных навыков пациентов со SMA 2-го и 3-го типов. MFM тестирует как мелкую, так и грубую моторику, т.е. поднятие головы, изменение положения из лежачего в сидячее, удержание монет, разрывание листа бумаги или рисование петель. Каждое задание оценивается от 0 до 3 баллов [25]. Другим инструментом, используемым для оценки пациентов со SMA 2-го и 3-го типов, является расширенная функциональная шкала Хаммерсмита (HFMSE). Элементы оценки, включенные в HFMSE, оказались чрезвычайно полезными в клинической практике в качестве инструмента оценки реабилитации, а также в клинических исследованиях для определения прогрессирования заболевания. Максимальное количество баллов, которое можно получить, составляет 66 [26].
2.1. Nusinersen
Управление по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных средств США (FDA) и Европейское медицинское агентство (EMA) одобрили нусинерсен для лечения SMA в качестве одного из первых препаратов в декабре 2016 года и в июне 2017 года соответственно. Данный препарат относится к группе ASOs и приводит к включению экзона 7 в транскрипты мРНК SMN2 путем сайленсинга сплайсинга в интроне 7 SMN2. Последовательность ISS-N1 расположена в экзоне 7, ниже по течению от 5'ss. Эта последовательность ингибирует включение экзона 7 путем связывания с сайтом 10-24 интрона 7. Было показано, что применение нусинерсена может повышать уровень белка SMN за счет блокирования ISS-N1 и, как следствие, блокирования hnRNP, что приводит к включению экзона 7 в транскрипцию SMN2. Увеличение количества функционального белка SMN замедляет прогрессирование заболевания [17,27]. Препарат вводится интратекально с частотой четыре раза в течение двух месяцев в начальном периоде нагрузки и каждые четыре месяца в поддерживающем периоде в дозах, направленных на центральную нервную систему, и не пересекает гематоэнцефалический барьер при подкожном или внутривенном введении. Для того чтобы доказать эффективность нусинерсена, потребовалось провести большое количество исследований [18,23].
Первое клиническое исследование, доказавшее эффективность нусинерсена, - исследование ENDEAR (ISIS = 396443) - началось в 2014 году. В исследование был включен 121 младенец в возрасте до 7 месяцев с двумя копиями SMN2. В промежуточном анализе исследования Hammersmith Infant Neurological Examination (HINE) младенцы, получавшие нусинерсен, по сравнению с контрольной группой продемонстрировали значительное улучшение в достижении моторных вех (41% против 0%, p менее 0,001). Кроме того, вероятность бессобытийной выживаемости, т.е. использования вспомогательной вентиляции легких или продолжительность времени до смерти, была выше в группе детей, получавших нусинерсен (p = 0,005) [28-31].
Вторым клиническим исследованием является продолжающееся исследование NURTURE (ISIS396443), начатое в 2015 году. К настоящему времени в исследование включено 25 младенцев в возрасте до 6 недель с генетически документированными 2 и 3 копиями SMN2. Результаты анализа 25-месячного периода в сравнении с ожидаемыми результатами естественного течения оказались удовлетворительными. В течение этого периода все пациенты оставались живы и не нуждались в постоянной вентиляции легких. Кроме того, было показано, что в среднем в возрасте 34,8 мес 92% пациентов могли ходить с помощником, из них 88% - самостоятельно. Все пациенты выжили [28,29,32].
В клиническом исследовании CHERISH было проанализировано 126 детей со SMA 2-го типа. При анализе результатов по шкале Hammersmith Functional Motor Scale-Expanded (HFMSE) через 15 месяцев лечения в группе детей, получавших нусинерсен, средний прирост составил 4 балла, а в контрольной группе - снижение на 1,9 балла (p менее 0,001). При окончательном анализе через такое же время 57% детей достигли трехбалльного прироста по шкале HFMSE [25-27,30].
Рассмотренные выше клинические исследования показали эффективность и безопасность нусинерсена. Наиболее частым осложнением лечения этим препаратом являются инфекции верхних дыхательных путей. К менее распространенным симптомам относятся головная боль, боль в спине, легочный ателектаз. В связи с возможностью почечной токсичности и риском развития тромбоцитопении перед приемом препарата рекомендуется провести тест на протромбиновое время, количество тромбоцитов и белок в моче [33].
Эффективность и безопасность более высоких доз нусинерсена в настоящее время изучается в клиническом исследовании DEVOTE (NCT04089566). Это исследование состоит из трех частей. В А включены пациенты с поздним началом SMA (более 6 месяцев). Участники получают 3 х 28 мг нагрузочной дозы и 2 х 28 мг поддерживающей дозы. Часть В - рандомизированное двойное слепое активно-контролируемое исследование с участием младенцев и пациентов с поздней формой SMA. Контрольные испытуемые получают 4 нагрузочные дозы и 2 поддерживающие дозы, соответствующие одобренной FDA дозе 12 мг. Участники экспериментального исследования получают 2 нагрузочные дозы по 50 мг и 2 поддерживающие дозы по 28 мг. Влияние более высокой дозы нусинерсена на двигательные функции пациентов изучается путем оценки по шкале CHOP-INTEND в начале и на 183-й день исследования. Участники части С получают утвержденную дозу 12 мг в течение как минимум одного года, затем однократную болюсную дозу 50 мг и две поддерживающие дозы по 28 мг. Это открытая часть, в которой изучается безопасность и переносимость более высоких, чем утвержденные, доз препарата. За DEVOTE следует открытое исследование ONWARD (NCT04729907), в котором изучаются долгосрочные эффекты более высоких доз нусинерсена.
Кроме того, в последнее время в литературе уделяется особое внимание поиску новых биологических маркеров, которые могут быть использованы для оценки состояния пациентов. Кроме того, исследования показывают, что миРНК могут выступать в качестве первичных модуляторов SMN-опосредованных молекулярных путей. Кроме того, молекулы воспаления могут представлять собой новые потенциальные терапевтические мишени, а также надежные биомаркеры, полезные для стратификации пациентов, прогнозирования прогрессирования заболевания и мониторинга ответа на терапию, а следовательно, и для более эффективного лечения больных SMA. В этой связи следует упомянуть исследование Bonanno et al. [34], в котором было показано, что нусинерсен также снижал уровень специфических для скелетных мышц миРНК у 21 пациента со SMA 2-го и 3-го типов, связанных с патогенетическим процессом при нервно-мышечных заболеваниях. Снижение уровня этих миРНК коррелировало с улучшением двигательной функции пациентов, оцененной по шкале HFMSE [34]. В другом исследовании, включавшем 21 педиатрического пациента со SMA 1, 2 и 3 типов и 12 взрослых со SMA 2 и 3 типов, Bonanno et al. [35] показали, что терапия нусинерсеном может оказывать благоприятное воздействие на периферическую иммунную систему. Через 6 месяцев лечения в сыворотке крови пациентов было отмечено снижение уровня про-воспалительных цитокинов Th1/Th17-пути. Интересно, что в указанных исследованиях молекулы miR-133a и IL-23 были определены как потенциальные прогностические биомаркеры терапии нусинерсеном, а IL-10 - как потенциальный биомаркер для контроля за ходом лечения [34,35].
2.2. Gene Replacement Therapy
Вторым препаратом, одобренным для терапии SMA, является Zolgensma (AVXS-101, Onasemnogene Abeparvovec). В 2019 году FDA разрешило применение препарата Zolgensma у детей в возрасте до 2 лет, у которых диагноз SMA подтвержден генетическими тестами. Это ген-заместительная терапия (GRT), которая была создана благодаря знанию генетической основы заболевания [36]. Для доставки трансгена под контролем вездесущего промотора в клетки двигательных нейронов используется капсид нереплицирующегося аденоассоциированного вируса (scAAV9). Примечательно, что, в отличие от нусинерсена, Zolgensma преодолевает гематоэнцефалический барьер, и для системной экспрессии белка SMN достаточно одного введения в течение 1 ч внутривенной инфузии [28].
Аденоассоциированные вирусы (AAV) - это неразвивающиеся вирусы, происходящие из рода Parvoviridae. Их нуклеиновая кислота находится в виде одноцепочечной ДНК [37,38], а в геноме имеются две открытые рамки считывания - гены cap и rep, фланкированные с обоих концов инвертированными терминальными повторами. Ген cap продуцирует VP1, VP2 и VP3 - структурные белки, формирующие капсид. Ген rep, напротив, кодирует белки, участвующие в репликации, транскрипции, интеграции и инкапсидации AAV [37]. Однако гены rep и cap пока не включены ни в одну терапию на основе AAV.
На сегодняшний день выделено более 12 различных серотипов AAV. Они различаются по клеточному тропизму (в зависимости от типа капсидных поверхностных белков), по эффективности трансдукции и по способности к иммунному ответу. Все AAV способны трансдуцировать делящиеся и неделящиеся клетки и сочетают низкую иммуногенность и патогенность с длительной экспрессией трансгенов при клиническом применении. Более того, многие AAV успешно трансдуцируют нейроны и глиальные клетки, что позволило использовать векторы, полученные на их основе, при нейродегенеративных заболеваниях [8,39].
В этом контексте можно выделить серотип AAV2, специфичный для эндотелиальных клеток головного мозга, и серотип AAV9, который после системного введения приводит к высокой экспрессии в нейронах моторной коры, мозжечка, substantia nigra и шейного отдела спинного мозга [7,8,40].
Однако они имеют и ряд ограничений. Одним из них является то, что AAV склонны к снижению своей эффективности под влиянием вырабатываемых нейтрализующих антител. Кроме того, рецепторы различных серотипов AAV присутствуют во многих органах, что ограничивает их целевую специфичность [8]. Тем не менее, такой специфичности экспрессии генов при доставке AAV можно добиться, используя органоспецифичный промотор [41,42]. Следует отметить, что по сравнению с LV-векторами AAV характеризуются более высоким профилем безопасности и уровнем экспрессии трансгенов. Кроме того, AAV обладают большим распространением вектора и лучшей стабильностью своего генома в основном в виде вне-хромосомных эписом, что снижает вероятность инсерционного мутагенеза [43,44].
В первой фазе клинических испытаний в рамках исследования START терапия была проведена у 15 пациентов со SMA 1-го типа. Участники были разделены на две группы. Одна когорта (12 человек) получала более высокую дозу - 2,0 х 1014 vg/kg, а другая группа (3 человека) получала более низкую дозу - 6,7 х 1013 vg/kg (NCT02122952). Средний возраст пациентов в когорте, получавшей большую дозу, составил 3,4 месяца, а в когорте, получавшей меньшую дозу, - 6,3 месяца. Все пациенты в обеих группах дожили как минимум до 20 месяцев и не нуждались в постоянной механической вентиляции легких. Это оказалось существенным отличием по сравнению с исторической когортой, в которой только 8% пациентов пережили порог в 20 месяцев жизни без постоянной вентиляции. По сравнению с исторической когортой пациенты имели более длительный бессобытийный период, быстрее достигали вех, у них улучшилась двигательная функция. У пациентов, получавших более высокую дозу препарата, баллы в тесте нейромышечных расстройств для детей Детской больницы Филадельфии (CHOP-INTEND) за три месяца увеличились в среднем на 15,4 балла. В общей сложности 92% детей из когорты, получавших повышенную дозу, могли сидеть без посторонней помощи, 92% могли принимать пищу перорально и говорить, 75% переворачивались и 17% ходили самостоятельно [45]. Более поздний анализ показал, что у детей, получавших раннюю GRT, на момент введения Zolgensma наблюдался более высокий прирост CHOP-INTEND, чем у пациентов старшего возраста [46].
В исследовании третьей фазы-STR1VE проверялась безопасность и эффективность Zolgensma у пациентов с мутацией SMN1 с одной или двумя копиями SMN2 из различных центров мира (NCT03306277). Результаты, полученные у 22 пациентов в США (STR1VE-US), в сравнении с исследованиями из когорт с естественной историей заболевания подтвердили эффективность GRT. 91% пациентов в возрасте 14 месяцев не нуждались в постоянной вентиляционной поддержке, а 59% пациентов в возрасте 18 месяцев сидели без посторонней помощи в течение 30 с и более. Также было доказано, что терапевтический эффект от лечения Zolgensma перевешивает риски, связанные с возможными побочными эффектами [47].
В настоящее время проводятся клинические испытания интратекального введения Zolgensma с целью изучения долгосрочной безопасности и эффективности или изучения терапевтического потенциала при использовании других путей введения [NCT05089656]. В до-клинических исследованиях интратекальное введение AAV9, несущего кДНК SMN человека, мышам и не-человеко-образным приматам приводило к сходной нацеленности на двигательные нейроны при использовании в 10 раз меньшей дозы по сравнению с внутривенным введением [48].
Серьезные побочные эффекты, которые могут возникнуть после введения препарата, соответствуют тем, которые наблюдаются при использовании других методов терапии на основе AAV9. Сообщалось о повышении уровня печеночных ферментов и рвоте, которая была обратима при приеме адекватных доз преднизона или преднизолона [49]. Повышение уровня тропонина I и тромбоцитопения также наблюдались после лечения Zolgensma. Имеются также сообщения о тромботической микроангиопатии, связанной с приемом Zolgensma [50,51]. Приведенные наблюдения подчеркивают важность мониторинга функции печени и почек не менее чем через 3 месяца после введения GRT [45].
Результаты исследований на мышиных моделях показывают, что длительная GRT AAV9-SMN может оказывать противоположный эффект, вызывая позднюю нейротоксичность в тех же нейронах, где она обеспечивает раннюю функциональную коррекцию дефицита SMA, через позднюю двигательную дисфункцию, связанную с потерей проприоцептивных синапсов и нейродегенерацией. Это также показывает, что как сильный избыток, так и недостаток SMN оказывают пагубное влияние на сенсомоторные цепи. Учитывая вероятную необратимость стойкой перегрузки SMN в нейронах, вызванной AAV9-SMN GRT, осознание неожиданных сценариев терапии приведет к более глубокой оценке затрат и преимуществ генотерапии по сравнению с другими доступными вариантами [50].
2.3. Risdiplam
Рисдиплам (Evrysdi™) - пероральный модификатор SMN2-направленного сплайсинга. Он был одобрен FDA 7 августа 2020 г. для лечения пациентов с мутацией SMN1 в возрасте 2 месяцев и старше [52]. В настоящее время он одобрен для лечения SMA как у детей, так и у взрослых всех возрастов [53]. Рисдиплам представляет собой небольшую молекулу, связывающую непосредственно экзонный усилитель сплайсинга 2 (ESE2) с экзоном 7 и сайтом сплайсинга (5'ss) интрона 7 в транскрипте SMN2. Это приводит к вытеснению hnRNPG, облегчая связывание U1 snRNP с 5'ss. Таким образом, риздиплам способствует включению экзона 7, повышая тем самым уровень FL-SMN [54]. В исследованиях in vitro и in vivo риздиплам также воздействовал на гены FOXM1 и MADD, что может влиять на регуляцию клеточного цикла, апоптоз и вызывать неблагоприятные эффекты на животных моделях [52,55]. Рисдиплам также способствует активации сплайсинга SMN2, связываясь с модуляторами сплайсинга комплекса пре-мРНК SMN2 - белком, связывающим far upstream element binding protein 1 (FUBP1) и регуляторным белком сплайсинга KH-типа (KHSRP) [56]. Преимущество риздиплама заключается в том, что он проникает через гематоэнцефалический барьер, повышая уровень белка SMN как в центральной нервной системе, так и в периферических органах [57]. Эта малая молекула назначается перорально одновременно или после приема пищи. Доза зависит от массы тела, а возраст пациента может влиять на фармакокинетику препарата [52].
Первая часть открытого многоцентрового клинического исследования FIREFISH (NCT02913482) была предназначена для оценки безопасности, переносимости, фармакокинетики и фармакодинамики различных доз риздиплама. В это клиническое исследование был включен 21 младенец со SMA 1-го типа, четверо из которых получали низкую дозу (конечная доза на 12-м месяце - 0,08 мг риздиплама на килограмм массы тела в сутки), а 17 - высокую (конечная доза на 12-м месяце - 0, 2 мг на килограмм в сутки). В общей сложности 19 младенцев получали лечение в течение минимум 12 месяцев, а средняя продолжительность лечения составила 14,8 месяца. Более высокие уровни SMN в крови наблюдались в когорте, получавшей более высокую дозу препарата. Семь младенцев из когорты, получавшей высокую дозу, и ни один младенец из когорты, получавшей низкую дозу, не смогли сидеть без поддержки в течение не менее 5 с [58]. В естественной истории развития SMA с инфантильным началом средний возраст выживания составляет 8 месяцев [59]. В 16 месяцев 14 пациентов из когорты, получавшей более высокую дозу препарата, имели оценку CHOP-INTEND 40 баллов или выше, а двое младенцев достигли вехи оценки ходьбы HINE-2 - подпрыгивание [58]. Вторая часть исследования подтвердила эффективность и безопасность более высокой дозы. В исследование был включен 41 пациент, 38 из них были живы на 12-м месяце, троим потребовалась вспомогательная вентиляция легких. Способность сидеть без посторонней помощи была достигнута у 12 детей [60].
В исследование SUNFISH (NCT02908685) были включены пациенты с более поздним началом симптомов. Рисдиплам назначался людям в возрасте от 2 до 25 лет со SMA 2-го или 3-го типа. Первая часть исследования заключалась в увеличении дозы препарата. Через 24 месяца двигательная функция значительно улучшилась, в результате чего показатель Motor Function Measure (MFM) был выше, чем у сопоставимой когорты [61]. Во второй части исследования эффект от применения риздиплама в дозе, подобранной в первой части, сравнивался с плацебо. Через 12 месяцев терапии по сравнению с группой плацебо пациенты, получавшие риздиплам, достигли значительно большего исходного улучшения по показателям Motor Function Measure 32 (MFM32), HFMSE, SMA Independence Scale (SMAIS) и Revised Upper Limb Module (RULM) [62].
JEWELFISH (NCT03032172) - многоцентровое исследование с открытой этикеткой, в котором изучались фармакокинетика, фармакодинамика, эффективность и безопасность риздиплама в группе пациентов с подтвержденным диагнозом 5q-аутосомно-рецессивного SMA. Возраст пациентов в исследовании составлял от 6 месяцев до 60 лет, и они ранее получали RG7800 (RO6885247), нусинерсен, олезоксим или Zolgensma. Через 12 месяцев терапии наблюдалось повышение уровня SMN в крови пациентов [63].
В настоящее время проводится исследование RAINBOWFISH (NCT03779334), в которое набираются досимптоматические дети с генетически подтвержденным SMA в возрасте от рождения до 42 месяцев. Исследование направлено на оценку эффективности, безопасности, фармакодинамики и фармакокинетики. Первичной конечной точкой является доля сидячих младенцев после 12 месяцев лечения, а вторичные конечные точки включают долгосрочную оценку двигательной активности и других этапов развития [64]. Данное исследование позволит получить ценную информацию об эффектах лечения и выборе оптимального метода проведения терапии риздипламом в досимптомной фазе у маленьких детей со SMA и поддержит лиц, принимающих решения, в вопросе важности и ценности досимптомной терапии при SMA [64] (табл. 1).
Таблица 1. Сравнение одобренных препаратов для терапии SMA.
Наиболее частыми побочными реакциями, возникавшими в ходе клинических испытаний, были лихорадка, диарея, сыпь, запор, тошнота, рвота, головная боль, язвы и раны во рту, боль в суставах или инфекции мочевыводящих путей [55,65,66].
2.4. Challenges and Future Directions
Другими малыми молекулами для перорального введения, протестированными на пациентах со SMA, были RG7800 (RO6885247) и branaplam (LMI070, NVS-SM1). Подобно нусинерсену и риздипламу, они повышают уровень SMN за счет изменения сплайсинга SMN2. Клиническое исследование RG7800 фазы 1 было прекращено из-за развития у пациентов ретинотоксичности [66]. В ходе испытаний бранаплам показал токсическое действие на нервную систему, почки и сосуды [67]. Участники клинических испытаний RG7800 и бранаплама были включены в исследование JEWELFISH.
Интересным представляется также подход, представленный d'Ydewalle et al., усилия которых были направлены на попытку увеличить экспрессию SMN. В качестве посредника для этого они использовали длинную не-кодирующую РНК (lncRNA), производную от антисмысловой нити SMN (SMN-AS1), которая подавляет экспрессию SMN. Деградируя SMN-AS1 с помощью ASO, они увеличили экспрессию SMN в клетках пациента, культивируемых нейронах и центральной нервной системе мышей. В результате это позволило улучшить выживаемость мышей с тяжелой формой SMN и может успешно стать основой для дальнейших исследований по использованию комбинаторных ASO в лечении нейрогенетических заболеваний [68].
Испытываются также антисмысловые фосфородиамидатные морфолиноолигомеры (PMO). PMO более стабильны in vivo и присутствуют в мышцах дольше, чем ASO. Исследования на мышиной модели тяжелой SMA показали, что PMO, введенные в боковой желудочек, способствуют включению экзона 7 [69].
Дельта-нейрокальцин (NCALD) относится к семейству кальциневринов и негативно регулирует эндоцитоз. Защитный эффект снижения уровня NCALD на фенотип SMA был подтвержден на животных моделях SMA. Недавно было показано, что комбинированное лечение, включающее подкожное введение SMN-ASO и внутрижелудочковое введение NCALD-ASO, улучшает двигательную дисфункцию у мышей с SMA [70]. PLS3 содержит два взаимодействующих потенциала: 1С, избыточная экспрессия которого усиливает аксональный coronin в модели SMA у рыбок данио, и гомолог кальциневрина В 1, который дополнительно поддерживает подавление эндоцитоза и экспансию SMA у мышей [71].
Другими мишенями для генотерапии могут быть ген ZPR1 (ZPR1 Zinc Finger) и PLS3 (Plastin 3). Испытания на мышиных моделях SMA показывают, что избыточная экспрессия белков PLS3 или ZPR1 может облегчить течение заболевания [72,73].
3. Amyotrophic Lateral Sclerosis
Боковой амиотрофический склероз (ALS) является одним из наиболее распространенных MNDs. По данным Mehta et al., заболеваемость ALS в США в 2014 году составила 5 на 100 тыс. человек и не изменилась по сравнению с 2013 годом [74]. Кроме того, при мета-анализе, представленном Marin et al., стандартизованная заболеваемость ALS в мире составляет 1,68 на 100 тыс. человек в год [75]. Прогноз лечения малообещающий - выживаемость составляет от 2 до 5 лет. Только 5% пациентов доживают до 20 лет с момента постановки диагноза. Заболевание проявляется прогрессирующей утратой функции двигательных нейронов и глиальных клеток в спинном и головном мозге. Паралич возникает как следствие прогрессирования ALS. Нейромышечная слабость чаще поражает мужчин, обычно после 50 лет [76-78]. В базовой классификации можно выделить семейную форму (fALS), встречающуюся в 5-10% случаев, и спорадическую форму (sALS), к которой относятся все остальные пациенты. Более совершенная классификация включает: (i) первичный боковой склероз с поражением верхнего двигательного нейрона (ii) ALS с поражением конечностей при сочетании поражения нижнего и верхнего двигательных нейронов (iii) чистое поражение нижнего двигательного нейрона - прогрессирующая мышечная атрофия (iv) ALS с бульбарным поражением [76].
Другая классификация используется для фенотипической дифференциации. Она заключается в выделении групп в зависимости от того, в какой части тела появляются симптомы. Большинство пациентов отмечают симптомы, начинающиеся в конечностях - фасцикуляции, судороги. Некоторые из них отмечают дисфагию как бульбарный симптом, и только у 5% наблюдаются симптомы со стороны дыхательных мышц или мышц туловища. При дыхательной недостаточности поражается, в частности, диафрагма, что проявляется одышкой и гипервентиляцией. Большинство пациентов умирает от дыхательной недостаточности [78]. Несмотря на многие десятилетия клинических испытаний, эффективного лечения не существует. Однако применяемые в настоящее время препараты позволяют незначительно увеличить время выживания. К ним относятся riluzole and edaravone [79]. Первый из них, рилузол, был одобрен для лечения ALS более 20 лет назад. Его действие основано на ингибирующем влиянии на высвобождение глутамата, что в свою очередь приводит к инактивации вольтажных натриевых каналов и нарушению последующих этапов связывания нейротрансмиттера. Хотя точный механизм его действия при ALS неизвестен, многие исследования показали его значительный эффект в замедлении времени до трахеостомии и продлении выживаемости за счет предотвращения разрушения нервных клеток [80-82]. В свою очередь, эдаравон, действуя как антиоксидант и поглотитель свободных радикалов, снижает чрезмерный окислительный стресс и подавляет гибель клеток. Таким образом, он продлевает функционирование и задерживает ухудшение двигательных функций, особенно у пациентов на ранних стадиях ALS [81,83,84]. Следует отметить, что в мае 2022 года FDA также одобрило пероральную форму эдаравона для применения у пациентов с ALS, что, несомненно, гораздо удобнее, чем внутривенное дозирование препарата. Кроме того, недавно завершилось глобальное исследование 3-й фазы, оценивавшее безопасность эдаравона в группе из 185 пациентов. Согласно полученным результатам, через 48 недель наблюдались такие связанные с лечением нежелательные явления, как падения, мышечная слабость и запоры. Хотя о серьезных событиях (таких как дисфагия, дыхательная недостаточность) сообщили 25,9% пациентов, ни одно серьезное нежелательное явление не было связано с исследуемым препаратом, что подтверждает хорошую переносимость эдаравона в течение 48 недель лечения [83,85]. В основе ALS лежат сложные молекулярные механизмы, которые могут стать терапевтической мишенью для лечения. В ДНК больных были обнаружены различные патогенные варианты генов, кодирующих РНК-связывающие белки (RBPs), например, TAF15, ATXN2, FUS и TDP-43 [86]. Геннотерапия с использованием рилузола и эдаравона - единственных двух известных препаратов, замедляющих прогрессирование болезни при ALS, для двух форм заболевания - одной, вызванной мутациями в гене C9orf72, и формы, связанной с супероксиддисмутазой 1 (SOD1) Cu/Zn, - может стать перспективным методом лечения в случае неудачи фармакологических подходов.
Роль гена SOD1 основана на защите клетки от реактивных форм кислорода, и он же является первым и наиболее изученным геном, ассоциированным с ALS. Белок, образующийся из него, существует в виде гомодимера, в котором каждый мономер характеризуется высокой структурой с дисульфидными мостиками, повышающими их стабильность. Однако структура белка может дестабилизироваться. Это связано с мутациями в гене SOD1, которые могут приводить к разрушению гомодимерной структуры белка, усиливая тем самым токсическую функцию белков SOD1. Показано, что у 12% пациентов с семейной формой заболевания имеются мутации в гене SOD1, причем иногда они могут встречаться и при sALS. Хотя возможные механизмы токсичности мутировавшего SOD1 в двигательных нейронах до сих пор не до конца понятны, сам ген SOD1 положил начало новой эре исследований ALS. Это связано с тем, что на его основе была создана первая трансгенная модель мышей SOD1-G93A, которая до сих пор используется в клинических испытаниях [79,87-89].
Вторая упомянутая мутация основана на экспансии гексануклеотидного повтора (HRE) GGGGCC (G4C2) в первом интроне гена C9orf72. Она обнаруживается примерно в 40% всех случаев fALS и в большом числе кажущихся спорадическими случаев, что делает ее наиболее распространенной одиночной мутацией, диагностируемой при этом заболевании. Существует ряд возможных механизмов, с помощью которых эта мутация может способствовать развитию ALS. В этом контексте можно выделить следующие: снижение экспрессии гена C9orf72, приводящее к потере функции; перемещение РНК, содержащей повторы, в цитоплазму, где она может транслироваться в белки с дипептидными повторами (DPR); двунаправленная транскрипция HRE в РНК, содержащую повторы G4C2 и C4G2, которые агрегируются в ядре клеток и секвестрируют РНК-связывающие белки рис. 2 [90]. Хотя было показано, что белок C9orf72 высоко экспрессируется в нейронах, до сих пор неясно, какой из этих механизмов является наиболее важным в патогенезе ALS. Несмотря на это, модуляция гена C9orf72 играет важную роль в исследованиях ALS с использованием ASOs и редактирования генома [79,91,92].
 Figure 2. Pathomechanisms of C9orf72-associated ALS. (A) HRE can inhibit the transcription of C9orf72, resulting in loss of function. (B) Expansion can also be transcribed bidirectionally in either sense or antisense transcripts, which accumulate in RNA foci sequestering RNA-binding proteins (RBPs). (C) The HRE can be translated through a repeat-associated AUG-independent (RAN) translation mechanism producing toxic dipeptides (DPRs) generated from both the sense and antisense reading frames. Five DPRs have been described: glycine-alanine (GA), glycine-arginine (GR), proline-alanine (PA), proline-arginine (PR) and glycine-proline (GP).
3.1. RNA Interference
Выявленные мутации, связанные с ALS, могут вызывать дисрегуляцию процессинга мРНК [93]. Проведено несколько испытаний терапевтического подхода к лечению ALS с использованием siRNA. Основной проблемой исследований является оптимизация доставки и биораспределения нуклеиновых кислот in vivo. В одном из первых исследований было показано, что siRNA, доставленная в спинальные моторные нейроны с помощью AAV-2-опосредованного ретроградного транспорта из мышц, способствовала снижению уровня SOD1 в мышиной модели ALS [94]. Дальнейшие исследования действия siRNA, направленной против SOD1 и переносимой различными вирусными векторами, привели к задержке появления симптомов заболевания и продлению выживаемости исследуемых мышей [95-98]. В другой попытке Rizvanov et al.. [99] вводили siRNA локально в седалищный нерв мышиной модели. Лечение специфической siRNA привело к снижению уровня мРНК SOD1 человека в поясничном отделе спинного мозга на 48% [99]. Исследовались также нечеловеческие приматы, которым вводили rAAVrh10-miR-SOD1. Было достигнуто значительное и безопасное замалчивание SOD1 [100]. В 2017 г. для опосредованного пропуска экзонов пре-мРНК hSOD1 с помощью экспрессии экзон-2-таргетирующих антисмысловых последовательностей, встроенных в модифицированную микронуклеиновую РНК U7 (AAV10-U7-hSOD), были использованы родственные аденовирусу (AAV10) вирусные векторы серотипа rh10 (AAV10). Снижение уровня SOD1 было получено путем альтернативного сплайсинга, исключающего экзон 2 SOD1. AAV10-U7-hSOD вводили внутривенно и внутрижелудочково. Эффекты, наблюдаемые у мышей, такие как предотвращение потери веса и нарушения нервно-мышечной функции, а также увеличение выживаемости, подтверждают эффективность этой технологии [101]. Терапевтический подход с использованием RNAi может стать еще одной формой генотерапии ALS, но для этого необходимо преодолеть такие трудности, как нестабильность in vivo, недостаточная специфичность siRNA и потенциальная токсичность технологий, основанных на RNAi [102].
3.2. Antisense Oligonucleotides
Уроки терапии SMA привели к использованию селективных антисмысловых олигонуклеотидов (ASOs), нацеленных на РНК, в терапевтических подходах к лечению семейных типов ALS. Эти короткие одноцепочечные нуклеиновые кислоты могут воздействовать на геном, изменяя сплайсинг или вызывая деградацию мРНК путем активации рибонуклеазы H (РНКазы H).
В 2006 году Smith et al. [103] вводили крысам внутрижелудочковые ASOs, нацеленные на SOD1. Исследование показало хорошее распределение ASOs в центральной нервной системе, эффективное подавление мРНК SOD1 крыс и снижение уровня белка SOD1 в нервных тканях. Это также ассоциировалось с замедлением течения заболевания и продлением выживаемости [103]. Исследование 1-й фазы подтвердило безопасность и хорошую переносимость интратекальных ASOs у человека. Консервативные дозы (3 мг), использованные в исследовании, не облегчали симптомы заболевания [104,105]. Многообещающие результаты показали исследования 1-2-й фазы препарата Tofersen (BIIB067). Эти ASOs снижали синтез белка SOD1 за счет опосредованной РНКазой Н деградации мРНК SOD1. Клинические испытания показали, что более высокие дозы препарата эффективны для снижения уровня SOD1 в центральной нервной системе. Экспериментальные исследования позволяют предположить, что доза Тоферсена в 100 мг замедляет снижение показателей функциональной рейтинговой шкалы бокового амиотрофического склероза (ALSFRS-R) [106], что привело к проведению исследования 3-й фазы. В течение 28 недель применяемый препарат снижал концентрацию SOD1 в спинномозговой жидкости и легких цепей нейрофиламентов в плазме крови по сравнению с плацебо. Однако он не улучшил клинические конечные точки (изменение оценки по шкале ALSFRS-R) и был связан с такими нежелательными явлениями, как миелит [107]. В настоящее время потенциальные эффекты более раннего и более позднего введения тоферсена оцениваются в рамках продления фазы лечения, финансируемой компанией Biogen [108,109].
Также были выявлены ASOs, способные отменять патологию и обращать вспять токсичность, опосредованную экспансией РНК C9orf72. Лечение ASOs с целью уменьшения количества РНК, содержащих HRE, представляется рациональным и перспективным подходом в лечении C9orf72-ассоциированного ALS [110-112]. В исследовании Jiang et al. [113] трансгенным мышам ALS однократно вводили ASOs, которые избирательно связываются со смысловыми расширениями РНК. При этом наблюдалось снижение уровня смысловой РНК и смысловых DPRs и улучшение поведенческих нарушений [113]. Результаты этих исследований в конечном итоге привели к проведению I фазы клинических испытаний ASOs BIIB078 для взрослых пациентов с C9orf72-ALS (NCT03626012). Недавно были разработаны стереочистые олигонуклеотиды, нацеленные на последовательность SS1b на стыке экзона 1b и интрона 1 C9orf72. Они селективно деградируют смысловую экспансию G4C2, содержащую транскрипты, не уменьшая при этом изоформу варианта 2, лишенную этого повтора. Следует также добавить, что они предотвращают глутаматную токсичность. Этот тип олигонуклеотидов может быть использован для лечения C9orf72-ассоциированного ALS [114-116].
Мутация p.P525L в гене FUS обычно ассоциируется с ранним началом и агрессивным течением ALS. В 2019 году 26-летнему пациенту с этой мутацией была введены персонализированные ASOs. Первая инъекция была сделана, когда у пациента возникло затруднение дыхания, связанное с заболеванием, и он умер менее чем через год после начала терапии [104]. Jacifusen (ION363) - ASO, который в настоящее время вошел в 3-ю фазу клинических испытаний и имеет потенциал стать уникальной терапией для пациентов с FUS-ALS. В исследовании участвуют 77 пациентов, получающих Jacifusen или плацебо (NCT04768972) [117-119].
Целенаправленное воздействие ASOs на ATXN2 также представляется перспективной терапевтической стратегией. Доставка таргетных ASOs к ATXN2 в нейронные дифференцированные iPSC, полученные от пациентов с C9orf72-ALS, устраняла аномальную цитоплазматическую локализацию ядерных белков. Введение ATXN2-ASO в боковой желудочек после рождения быстро прогрессирующей мышиной модели ALS TDP-43 привело к устойчивому и выраженному снижению мРНК ATXN2, а также к продлению выживаемости и улучшению походки [120]. В настоящее время пероральный препарат BIIB100 проходит клинические испытания для лечения взрослых пациентов с ALS (NCT03945279) Таблица 2.
Таблица 2. Клинические испытания терапии антисмысловыми олигонуклеотидами при боковом амиотрофическом склерозе.
3.3. Viral Vectors in ALS
До настоящего времени доставка генов в центральную нервную систему была ограничена для большинства терапевтических молекул из-за существования гематоэнцефалического барьера. Однако даже этот барьер может быть преодолен, что было продемонстрировано Duque et al. при использовании AAV9 в исследованиях на животных [111]. В настоящее время наиболее часто используются векторы, полученные на основе лентивирусов, и адено-ассоциированные вирусные (AAV) векторы [38,79,121,122].
3.3.1. Lentiviral Vectors
Лентивирусы относятся к семейству Retroviridae. Среди них можно выделить две группы: приматоподобные, в которых вектор основан на вирусе иммунодефицита человека (ВИЧ), и неприматоподобные, например, на основе вируса инфекционной анемии лошадей (EIAV) [123].
В зависимости от упаковочной плазмиды, используемой для получения лентивирусных векторов (LV), можно выделить несколько поколений. Последнее, третье поколение, характеризуется упрощенным геномом, организованным в виде генов gag, env и pol, которые кодируют вирусную оболочку, структурные белки вирусного капсида и белки, необходимые для синтеза вирусной ДНК. Кроме того, присутствуют два длинных терминальных повтора - элементы, определяющие обратную транскрипцию, интеграцию в генетический материал хозяина и экспрессию генов [117]. Однако одной из главных особенностей использования этих вирусов в качестве векторов генной терапии, несомненно, является устранение в них многих регуляторных и вспомогательных генов. К их числу относятся, например, tat и vpr, отвечающие за онкогенез и апоптоз соответственно [124].
По сравнению с другими векторами, LV отличаются способностью трансдуцировать делящиеся и не делящиеся клетки (в том числе нейроны), возможностью естественного проникновения через неповрежденную ядерную мембрану и высокой способностью к клонированию (8-10 кб) [79,102,123,125,126]. Кроме того, интегрируясь в хромосомы клетки-хозяина, LV может вызывать длительную и стабильную экспрессию без воспаления, а его тропизм может быть изменен путем генетических манипуляций с гликопротеинами, необходимыми для трансдукции вектора [79,126].
Наиболее часто используется подтип с гликопротеином оболочки вируса везикулярного стоматита (VSV-G), который характеризуется высокой эффективностью трансдукции и стабильностью [60,100]. Возможность его использования была проверена Raoul et al. При двусторонней спинальной инъекции LV VSV-G, вызывающей сайленсинг SOD1, опосредованный РНК-интерференцией, у трансгенных мышей SOD1-G93A семейной модели ALS (fALS), удалось добиться задержки начала и прогрессирования заболевания [96].
Несмотря на многочисленные преимущества, LV не лишены недостатков, ограничивающих их применение. Это ограниченная область трансдукции (примерно 500-700 мкм от места инъекции), большие размеры (диаметр 100 нм) и низкие титры вирусов [127]. Однако их интеграция в геном делает их перспективными для генотерапии ex vivo, что было продемонстрировано Suzuki et al. в исследованиях SOD1 на крысах [128].
3.3.2. Adeno-Associated Virus Vectors
В рамках генотерапии ALS перспективным представляется серотип AAV9. Недавние исследования с использованием этого вектора позволили доставить shRNA к SOD1 у мышей SOD1-G93A, что привело к увеличению медианы их жизни [97]. Кроме того, был снижен синтез мутантного SOD1, что замедлило прогрессирование заболевания [129]. Этот подход был опробован в до-клинических исследованиях, но был приостановлен в связи с изменением приоритетов компании [129-131]. Однако это не исключает эффективности выбранного метода терапии, подтверждение которой требует дальнейших исследований.
Заслуживает внимания и серотип AAVrh10, который, благодаря трансдукции в центральную нервную систему, может эффективно доставлять туда микроРНК, которая, связывая мРНК SOD1, тем самым снижает продукцию мутантных белков у пациентов с этой формой ALS. Таким образом, это улучшит выживаемость и функционирование двигательных нейронов, что приведет к терапевтическому эффекту для людей с SOD1-ассоциированной формой ALS. Это было продемонстрировано Wang et al., которые с помощью этого препарата увеличили выживаемость мышей с мутацией SOD1 [89,130]. Аналогичные эффекты были представлены Borel et al. [100] В своем исследовании они получили увеличение средней продолжительности жизни мышей с SOD1-G93A на 21% [100].
Следует также отметить исследование Biferi et al., молекулярная стратегия которых, основанная на индуцировании постоянного снижения уровня мутантного SOD1 у мышей SOD1-G93A, привела к терапевтическому эффекту. Для этого они использовали векторы AAVrh10, опосредующие пропуск экзонов пре-мРНК hSOD1. Это приводило к образованию преждевременного терминирующего кодона и, как следствие, увеличивало выживаемость исследуемых мышей и предотвращало ухудшение нервно-мышечной функции у них [101].
В настоящее время безопасность, переносимость и эффективность интратекального введения AAVrh10 анти-SOD1 микроРНК пациентам с SOD1 мутациями ALS проверяется в многоцентровом клиническом исследовании APB-102 [132,133].
В дополнение к исследованиям на животных у двух пациентов с fALS недавно была применена однократная интратекальная инфузия AAV, кодирующего микроРНК, направленную против SOD1.
У пациента 1 эта доза снижала уровень SOD1 в спинном мозге по сравнению с контрольной группой, но не влияла на уровень SOD1 в спинномозговой жидкости. Кроме того, невозможно было однозначно интерпретировать поведение двигательных нейронов с обеих сторон пояснично-крестцового отдела спинного мозга. Хотя у этого пациента восстановилась минимальная разгибательная функция левой руки, другие клинические признаки, характерные для ALS, ухудшились. Поэтому нельзя было сделать вывод о том, сыграло ли ингибирование SOD1 какую-либо роль в улучшении клинического течения заболевания. У пациента 2 терапия AAV-векторами, напротив, не принесла клинического эффекта. В данном исследовании единственным теоретическим преимуществом было то, что генная супрессия, опосредованная вирусными векторами, позволяет получить устойчивый эффект от одной дозы терапии. Однако это связано с возможностью возникновения побочных эффектов. Хотя это исследование не показало удовлетворительных результатов, оно не уничтожило роль AAV-векторов в генотерапии ALS у человека [134].
Альтернативным подходом может быть использование AAV-векторов для терапевтической доставки человеческого гена DOK7. Это связано с тем, что его экспрессия вызывает активацию мышечно-специфической киназы MuSK, которая, в свою очередь, ингибирует деградацию двигательных нервных окончаний в нервно-мышечных соединениях. Это было продемонстрировано Miyoshi et al., которые с помощью AAV-вектора, кодирующего ген DOK7, добились торможения атрофии мышц в мышиной модели ALS SOD1-G93A. Это привело к улучшению двигательной активности и продлению жизни исследуемых мышей [135].
Однако нейротрофические факторы, обладающие нейропротекторными и нейрорегенеративными свойствами, могут действовать и на больных ALS [136,137].
Поэтому Gross et al.[137] провели исследование с использованием рекомбинантного AAV серотипа-2-neurturin (AAV2-NRTN) для оценки его безопасности, переносимости и эффективности в модели ALS на мышах SOD1-G93A. После введения AAV2-NRTN в шейный отдел спинного мозга в двигательных нейронах шейного отдела и в нервно-мышечных соединениях наблюдалась экспрессия NRTN и, соответственно, нейропротекторный эффект. Это нашло отражение в замедлении снижения силы хвата передних конечностей у исследуемых мышей. Поскольку увеличения заболеваемости не наблюдалось, этот результат дает основания для дальнейшего продолжения исследований в этом направлении [138].
Кроме того, человеческий инсулиноподобный фактор роста 1 (hIGF1) может быть использован в качестве нейротрофического фактора в терапевтических целях при ALS. Это было проверено в работе Lin et al., которые вводили внутримышечно самокомплементарный AAV9, кодирующий hIGF1, мышам модели ALS hSOD1-G93A. Они отметили, что это значительно уменьшило потерю двигательных нейронов передней части поясничного отдела спинного мозга и замедлило истощение мышц у исследуемых мышей. Следует отметить, что в данном исследовании IGF1 отсрочил начало заболевания и продлил продолжительность жизни мышей с ALS. Несомненно, этот эксперимент способствует дальнейшим исследованиям [139].
Как уже видно, использование вирусных векторов в генотерапии ALS достаточно широко. Несмотря на то, что во многих исследованиях на животных с использованием этих векторов были получены многообещающие результаты, многие проблемы еще предстоит решить. Мы полагаем, что постоянное совершенствование серотипов создаваемых векторов позволит в скором времени внедрить их в клиническую терапию пациентов с ALS.
3.4. Genome Editing
Подход, который недавно был опробован для лечения как генетических, так и не-генетических заболеваний, - редактирование генома [140,141]. К его методам относятся нуклеаза цинковых пальцев, нуклеаза транскрипционного активатора-подобного эффектора и нуклеаза Cas9, связанная с кластеризованными регулярно перемежающимися короткими палиндромными повторами (CRISPR) [141]. В контексте ALS наиболее перспективной представляется последняя из них, поскольку ее функциональность все чаще проверяется в клинических испытаниях.
Для использования CRISPR-Cas сначала строится малая направляющая РНК (sgRNA), близкая к последовательности протоспейсерного смежного мотива (PAM). В результате на следующем этапе нуклеаза Cas способна связываться с целевой последовательностью ДНК, которую распознает sgRNA. По сути, такая схема приводит к двунитевому разрыву (DSB) в ДНК клетки, вызывая инсерции или делеции оснований, что приводит к сдвигу рамки считывания. Эти разрывы, в свою очередь, сопровождаются двумя различными процессами репарации: негомологичным концевым соединением (NHEJ) и гомологичной рекомбинацией (HR). Первый из них, NHEJ, представляет собой быстрый, но подверженный ошибкам процесс, который часто приводит к инсерциям и делециям в точке разрыва, в результате чего ген, кодирующий белок, оказывается выключенным. В отличие от этого, HR индуцирует инсерции или заменяет фрагменты ДНК на донорский шаблон, причем относительно безошибочно Рисунок 3 [142-146].
 Figure 3. Techniques of CRISPR-Cas9 genome editing system.
Depending on the Cas protein subtype, we can distinguish several types, including saCas9, c2c2, RCas, dCas or Cas9 from Streptococcus pyogenes (SpCas9) [147]. Each of these proteins has a unique PAM sequence and a different size, adapted to all kinds of applications. It is also worth adding that these proteins have specific targets for cutting DNA and RNA, and, therefore, they can induce single-stranded cuts, leading to the activation or inhibition of transcription [147].
В последние годы было проведено большое количество исследований, посвященных использованию редактирования генома в контексте заболеваний мотонейронов. Одним из них стало исследование Gaj et al. [148], в котором была представлена возможность нарушения экспрессии мутантного SOD1 в мышиной модели ALS G93A-SOD1. Для этого эксперимента авторы использовали CRISPR-Cas9, который доставлялся in vivo с помощью вектора AAV. В результате проведенного редактирования генома удалось снизить уровень мутантного белка SOD1 в грудном и поясничном отделах позвоночника в 2,5 раза. В результате у исследуемых мышей улучшилась двигательная функция и уменьшилась атрофия мышц. Стоит добавить, что на финальной стадии у испытуемых мышей было обнаружено примерно на 50% больше двигательных нейронов, и примерно на 37% болезнь была отсрочена [148].
Аналогичные эффекты были достигнуты Duan et al., которые применили модификацию мутантного SOD1 у трансгенных мышей G93A-SOD1. Используя систему AAV-SaCas9-sgRNA, они добились делеции гена SOD1 и увеличения продолжительности жизни исследуемых мышей на 54,6% [149].
Недавно Deng et al., продемонстрировали, что редактирование генома с помощью CRISPR-Cas9 предотвращает прогрессирование заболевания у мышей с SOD1. Более того, они не обнаружили у мышей с редактированием генома признаков других заболеваний после двухлетнего возраста. Это является еще одним доказательством эффективности такого перспективного терапевтического подхода, как CRISPR-Cas9 [150].
В свою очередь, в исследовании Pribadi et al. система CRISPR-Cas9 была использована для полного удаления экспансивной мутации большого повтора в составе C9orf72 в индуцированных плюрипотентных стволовых клетках пациента (iPSC), обладающих способностью дифференцироваться в другие типы клеток, например нейроны. Это действие предотвратило образование очагов РНК и гиперметилирование промотора - два фенотипа мутации C9orf72. Однако это не привело к существенному изменению экспрессии C9orf72 на уровне мРНК или белка. Тем не менее, эта работа открывает дальнейшие возможности использования CRISPR-Cas9 для вырезания экспрессии мутантного повтора C9orf72 в терапии ALS [143,151].
Аналогичное исследование на основе C9orf72 было проведено Lopez-Gonzalez et al. В своей модели они представили данные о значительно более высокой экспрессии Ku80 (белка репарации ДНК) в нейронах пациентов, полученных из iPSC с C9orf72, а также о повышении уровня других проапоптотических белков, таких как Bax и PUMA. Для подавления их экспрессии использовали делецию удлиненных повторов G4CA с помощью CRISPR-Cas9. В результате их эксперимент оказался успешным, поскольку подавил чрезмерно активированный путь репарации ДНК [152].
Несмотря на надежды, возлагаемые на возможности развития техники CRISPR-Cas, необходимо помнить обо всех ее ограничениях, которые до сих пор представляют проблему для исследователей.
Одним из них является то, что направляющая РНК системы не обязательно должна быть полностью совместима с последовательностью мишени для ее расщепления. На практике это означает возможность нецелевого воздействия, что может выражаться в возникновении непредсказуемых мутаций [153]. Для преодоления этого ограничения уже предпринято немало усилий. Возможные не-целевые эффекты могут быть снижены уже на начальном этапе исследования путем выбора правильной мишени и соответствующего конструирования sgRNA. В этом контексте важным является содержание гуанина-цитозина в sgRNA, которое, как было установлено, оказывает существенное влияние на частоту возникновения вне-целевых эффектов [154]. Кроме того, можно использовать усеченную таргетную РНК, что является эффективной и целесообразной возможностью повысить эффективность нуклеазы Cas9, поскольку она распознает более короткие последовательности мишени без снижения эффективности [155].
Другой проблемой при использовании редактирования генома является доставка sgRNA и Cas9. Для этого в основном используются вирусные векторы LV и AAV, которые, несмотря на свою эффективность, обладают ограниченным тканевым тропизмом и грузоподъемностью. Кроме того, несмотря на то, что векторы сконструированы таким образом, чтобы затруднить репликацию и избежать вирулентности, могут возникать нежелательные пагубные эффекты. В этом случае выходом могут стать невирусные векторы [155].
Несомненно, технология CRISPR-Cas является одной из наиболее перспективных в контексте будущей клинической терапии ALS. Несмотря на то что на данном этапе она достаточно ограничена созданием небольших моделей животных, результаты проведенных исследований побудили к дальнейшей работе в этом направлении. Не исключено, что в ближайшие годы этот метод будет еще более усовершенствован, что позволит не только снизить экспрессию мутантных белков у больных ALS, но и продлить и улучшить их жизнь.
Результаты вышеупомянутых исследований собраны и обобщены в табл. 3.
Table 3. Summary of research on gene targeting therapeutics mediated by viral vectors.
4. Conclusions
В течение многих лет MNDs считались неизлечимыми. Эффективное лечение стало возможным благодаря генной терапии. Таргетное воздействие на генетическую основу с помощью ASOs, GRT или малых молекул оказалось решающим в лечении SMA. Хорошие результаты у пациентов после применения одобренных в настоящее время нусинерсена, золгенсмы или риздиплама дают оптимистическую перспективу для дальнейших исследований. Особое значение, как выяснилось, имеет патология той же группы - ALS, при которой в настоящее время проходят клинические испытания несколько препаратов. Нацеливание на наиболее распространенные мутации, связанные с ALS, дает положительные результаты. Ведутся исследования по поиску вещества, которое могло бы лечить как спорадическую, так и семейную формы заболевания. В настоящее время усилия исследователей направлены на их поиск
|