Благодаря простоте систем CRISPR-Cas класса II, в которых для связывания и разрезания мишени достаточно одного белка Cas, их легче использовать в исследовательских целях, и они уже зарекомендовали себя как эффективный и мощный инструмент для редактирования генома как в прокариотических, так и в эукариотических клетках. Были разработаны различные технологии, каждая из которых подходит для конкретного применения, в зависимости от цели научного исследования [2,7]. Следует отметить, что белковая инженерия нуклеаз CRISPR в основном используется для усовершенствования CRISPR как метода генетической модификации и манипуляции, предлагая разнообразные методы редактирования на разных уровнях.

Наиболее часто используемой нуклеазой CRISPR для редактирования ДНК является РНК-направляемая Cas9 [48]. Этот белок способствует редактированию генома, стимулируя двухцепочечные разрывы (DBS) в целевом геномном локусе с помощью single-guide RNA (sgRNA). sgRNA - это версия естественно существующего комплекса направляющих РНК (комплекс crRNA-tracrRNA), сконструированная в единую и непрерывную последовательность. Эта молекула используется для того, чтобы белок Cas9 связывал и расщеплял обе нити целевой последовательности, вызывая DSB. После расщепления Cas9 целевой локус подвергается репарации повреждений ДНК либо через подверженное ошибкам негомологичное соединение концов (NHEJ), либо через высокоточный путь прямой гомологичной репарации (HDR). В отсутствие гомологичного шаблона активируется путь NHEJ, и концы, происходящие от DSB, соединяются, оставляя шрамы в виде мутаций вставки/делеции (indels). Путь NHEJ может быть использован для создания генных нокаутов, поскольку indels, возникающие в кодирующей области целевого гена, могут привести к сдвигу рамки считывания и преждевременной остановке кодонов [49]. Альтернативный путь репарации ДНК, HDR, поддерживает целостность восстановленной последовательности ДНК и активируется, когда в ядре присутствует гомологичный фрагмент ДНК. HDR может быть использован для точных изменений в целевом локусе при условии использования экзогенного ремонтного шаблона. Гомологичный ремонтный шаблон может быть либо одноцепочечным олигонуклеотидом ДНК (ssODN), либо двухцепочечной молекулой с гомологичными рукавами, фланкирующими последовательность вставки (рис. 1).



Figure 1. The CRISPR-Cas9 system mechanism on a target gene. The Cas9 protein is guided by a single-stranded RNA that is complementary to the site of interest, in a specific genomic region. The DNA is cleaved by Cas9, and the occurred DSBs can be repaired by two distinct repair pathways: the error-prone non-homologous ending joining (NHEJ), which will induce indels into the repaired DNA (left) and the homologous dependent repair (HDR) that requires a donor repair template that is incorporated in the target DNA sequence (right).

Первый обеспечивает простой и эффективный метод создания небольших изменений в геноме, включая однонуклеотидные замены, которые могут быть использованы для исследования случайных генетических вариаций [50]. Хотя механизм HDR является наиболее точным из широко используемых методов репарации ДНК, он все еще характеризуется пониженной эффективностью, особенно для некоторых типов клеток человека, таких как индуцированные плюрипотентные клетки (iPSCs) или эмбриональные стволовые клетки (ESCs). По этой причине было разработано несколько методик для повышения эффективности HDR, наиболее распространенными из которых являются ингибирование факторов, участвующих в NHEJ, и усиление таких факторов, как CtIP и RAD18, участвующих в HDR. Соответственно, репрессия Ku70/80 или ДНК-лигазы IV, которые представляют собой ключевые молекулы пути NHEJ, или даже маркировка Cas9 минимальным N-концевым фрагментом CtIP может стимулировать HDR. В отличие от NHEJ, исследования показали, что путь HDR в основном активен в делящихся клетках, и его эффективность зависит не только от типа и состояния клеток, но и от геномного локуса и выбранного ремонтного шаблона [49].

С тех пор как были охарактеризованы различные системы CRISPR-Cas, было выявлено множество ортологов Cas9, и была проведена оценка их использования в качестве потенциальных инструментов редактирования генома. Наиболее распространенной sgRNA-направляемой эндонуклеазой является SpCas9, происходящая из Streptococcus pyogenes [2,7,51]. Эта система представляет собой CRISPR-Cas подход, который позволяет подавлять целевые гены, репрессировать или активировать транскрипцию, преобразовывать одну пару оснований, позволяет эпигенетические изменения и другие манипуляции с геномом (рис. 2).



Figure 2. A typical workflow of a CRISPR-Cas9 editing strategy. The basic steps include the selection of the suitable Cas9 endonuclease and the design of the appropriate sgRNA molecule, their cloning into vectors and the subsequent delivery of the construct into eukaryotic cells to mediate changes into the target DNA. The final step corresponds to the experimental verification of the target DNA editing.

SpCas9 распознает относительно простой PAM, 5'-NGG-3' и индуцирует DSB на несколько оснований выше последовательности PAM [2]. Однако из-за своего большого размера (1368 аминокислот) ген SpCas9 и соответствующая ему молекула sgRNA не могут быть вставлены вместе в специальные вирусные векторы, такие как адено-ассоциированный вирус (AAV), для их эффективной доставки в клетки in vivo [52,53]. В качестве альтернативы, ортологи SaCas9 и CjCas9 могут быть использованы для редактирования генома при использовании AAV в качестве клонирующих векторов. Благодаря своему небольшому размеру SaCas9 (1053 аминокислоты) и особенно CjCas9 (984 аминокислотных остатка) являются более подходящими вариантами для осуществления методов CRISPR-Cas9 с использованием векторов AAV.

Хотя Cas12a и Cas9 развивались по независимым путям, эти эндонуклеазы имеют функциональное и структурное сходство. На сегодняшний день проведено несколько исследований по использованию Cas12a для манипуляций с ДНК в нескольких типах клеток, что делает систему CRISPR-Cas12a альтернативным инструментом молекулярного редактирования генома [54]. Как и в системах CRISPR-Cas9, Cas12a создает DSB в определенном геномном локусе, а последующая активация репарационного механизма клетки-хозяина приводит к исправлению возникшего DSB, либо посредством NHEJ, либо HDR. Активность Cas12a по процессингу pre-crRNA делает этот белок привлекательным выбором в случаях регуляции нескольких генов, что в случае с Cas9 является чрезвычайно сложной задачей (Таблица 2) [55]. Эта автоматическая обработка собственной crRNA была использована для одновременного изменения многих генетических элементов, обеспечивая конститутивную, индуцируемую и мультиплексную генную инженерию путем доставки одной плазмиды, содержащей несколько CRISPR gRNAs. Помимо впечатляющей способности Cas12a осуществлять высокоспецифичное расщепление dsDNA, он также демонстрирует универсальную активность для деградации ssDNA при активации с помощью ssDNA, комплементарной направляющей crRNA, что дает возможность манипулировать всеми типами ДНК [56].

Таблица 2. Разнообразные ортологи Cas, идентифицированные среди изученных видов бактерий. Каждый из них происходит из конкретного организма и характеризуется определенной последовательностью PAM.

Было сконструировано несколько нуклеаз Cas9 и Cas12 с пониженной активностью вне мишени при сохранении нормальной активности на мишени. Структурно-направленный мутагенез каталитических доменов Cas9 привел к созданию инженерии белков Cas9, используемых для дополнительных функций [2]. Точнее, мутация аспартат-аланин в каталитическом домене RuvC (D10A) или изменение гистидина на аланин в домене HNH (H840A) привели к появлению ферментов "nicking" Cas9, названных Cas9n, которые осуществляют одноцепочечные вырезки, а не DSBs, снижая потенциальные вне-целевые эффекты Cas9 дикого типа [57,58]. Мутация D10A инактивирует домен RuvC, что приводит к расщеплению только целевой нити, а мутация H840A вызывает инактивацию домена HNH и приводит к образованию nickase, разрезающей нецелевую нить. Следует отметить, что для двойного nicking с помощью Cas9n требуется две сгРНК, каждая из которых нацелена на комплементарную нить ДНК (рис. 3а). Поскольку в эукариотических клетках nicking обычно восстанавливаются с высокой точностью, поэтому Cas9n можно использовать для высокоспецифичного редактирования генома с помощью HDR [7]. В отличие от Cas9 дикого типа, который производит тупые DSB, Cas9n создает 5' или 3' нависания (створки) вдоль мишени [8].



Figure 3. Schematic demonstration of the engineered CRISPR-Cas9 systems. (a) The nuclease domains of the Cas9 protein can be mutated independently to generate DNA nickases (Cas9n) that are able to introduce nicks, rather than DBS. DSBs can be introduced through the usage of a pair of sgRNA-Cas9n complexes. (b) The Cas9 protein is engineered into catalytically inactive Cas9 (dCas9). The dCas9 can be fused with specific effector proteins to mediate expression alterations of the gene of interest (GOI).

Введение точечных мутаций в оба домена RuvC и HNH (D10A и H840A, соответственно) блокирует нуклеолитическую активность Cas9, не влияя на его сродство связывания и способность связываться с ДНК-мишенью [59]. Полученный мутантный белок, названный мертвым Cas9 (dCas9), значительно расширил спектр действия нуклеаз Cas9. Использование нуклеазы, специфичной к последовательности, в качестве молекулы, осуществляющей доставку других эффекторных белков к определенному локусу в геноме, может привнести новые возможности изменения ДНК. Более точно, присоединение других функционально активных белковых доменов к белку dCas9 привело к образованию химерных белков dCas, способных проявлять функцию эффекторного белка к определенным участкам ДНК (Рисунок 3b) [60]. Эта методология привела к появлению новых технологий CRISPR, известных как CRISPR активация (CRISPRa) и CRISPR интерференция (CRISPRi), соответственно. Наконец, белки dCas могут быть объединены с другими эффекторными белками, включая домены для исследования структуры хроматина и трехмерного хроматина, ферменты редактирования оснований (цитидин- или аденин-деаминазы), используемые для модификации ДНК, исправления генетических мутаций или нокаута генов [61-65].

Что касается последних, сайт-специфические редакторы оснований стали ценными инструментами для исправления специфических мутаций, связанных с фенотипами заболеваний, или введения мутаций для подавления или изменения функции конкретных генов, что дает новое понимание терапевтических подходов, соответствующих этим заболеваниям [66]. Например, dCas-направленные редакторы оснований корректируют SNP, связанные с наследственными заболеваниями, такими как талассемия [67,68], синдром Марфана [69] и фенилкетонурия [70]. Кроме того, для редактирования оснований ДНК были разработаны различные подходы. В частности, метод CRISPR-SKIP используется для внесения точечных мутаций в акцепторные сайты сплайсинга, что приводит к пропуску экзонов. Последующая трансляция образовавшейся модифицированной мРНК приводит к образованию новых изоформ белка с измененными свойствами [71]. Другим характерным подходом, разработанным путем слияния dCas9 с редакторами оснований, является метод CRISPR-Pass, в котором происходит коррекция нонсенс-мутаций аденозиновыми редакторами. Метод CRISPR-Pass может быть использован как противовирусный инструмент, способный мутировать вирусные геномы для блокирования репликации и синтеза белка вирусов, включая ВИЧ, HBV, вирус папилломы человека и вирус Эпштейна-Барр [72].

Несомненно, вклад ортологов Cas в инструментарий геномной инженерии активизировал усилия по редактированию генома, позволяя молекулярно расщеплять различные геномные мишени. Однако распознавание Cas9 специфических последовательностей PAM остается препятствием для выбора мишени, поскольку эти мотивы ограничивают участки ДНК, пригодные для редактирования. Инженерия ортологов Cas9 привела к получению новых вариантов Cas9 с измененными характеристиками, которые могут быть использованы для расширения диапазона редактирования генома. Более конкретно, Cas9-NG представляет собой модифицированный вариант Cas9, который распознает NGN PAMs, что позволяет целенаправленно воздействовать на большее число локусов генома. Способность Cas9-NG распознавать PAMs менее строгим образом позволяет нам эффективно редактировать геномы. Аналогичным образом, каталитическая активность варианта SpG Cas9 зависит от последовательности PAM и представляет собой весьма перспективный инструмент редактирования генома [73]. Другие системы, включая VQR- и EQR-Cas9, а также xCas9, могут распознавать сайты, содержащие NG PAM. Следует отметить, что геномный редактор VQR-Cas9 специфичен для мотива NGA, тогда как вариант xCas9 включает широкий спектр распознающих PAM-сайтов, таких как NG, GAA и GAT [74]. И наоборот, вариант VRER SpCas9 может расщеплять мишени с PAM-последовательностью TGCG [75].

Расцветающие технологии CRISPR-Cas в скором времени позволят модернизировать не только исследования по редактированию генома и эпигенома, но и функциональные исследования важнейших генов на уровне РНК. С момента появления CRISPR-Cas систем было разработано множество разнообразных технологий для точного редактирования молекул ДНК и РНК. В частности, появившиеся инструменты CRISPR-Cas для редактирования РНК позволили нам изменять экспрессию генов путем редактирования соответствующих молекул мРНК, без необходимости изменения последовательности гена [76,77]. Развитие этих технологий открыло дорогу новой эре в геномике/эпигеномике и транскриптомике/эпитранскриптомике, которая завершилась утверждением подходов CRISPR-Cas как в фундаментальных исследованиях, так и в клиническом применении.

Помимо инновационной технологии систем CRISPR-Cas, для осуществления разрывов в ДНК используются еще три нуклеазы для редактирования генома: эндонуклеазы самонаведения (HEs), нуклеазы с цинковым пальцем (ZFNs) и нуклеазы с эффектором активатора транскрипции (TALENs) [78]. HEs, также известные как мегануклеазы, кодируются генами homing эндонуклеаз (HEGs), которые представляют собой высокоспецифичные ферменты для расщепления ДНК, распознающие асимметричные длинные последовательности ДНК (~20-30 bps) и, естественно, были обнаружены у микроорганизмов. Механизм основан на экспрессии HEGs в живых клетках, которые встроены в мобильный элемент. Кодируемый фермент расщепляет интересующую мишень и создает DSB, который может быть восстановлен с помощью HDR или NHEJ, что приводит к мутации гена в результате нокаута или вставки экзогенной ДНК [79,80].

ZFNs, первые пользовательские ДНК-нуклеазы, представляют собой программируемые синтетические белки, которые связываются с определенными участками ДНК и используют ДНК-эндонуклеазы для создания DSBs, что облегчает геномную инженерию [25,81]. Эти разрывы восстанавливаются либо по пути HDR, либо по пути NHEJ. Эти ферменты представляют собой слияние двух доменов: повторов цинковых пальцев, которые создают массивы из шести или более пальцев, способных распознавать примерно 9-18 п.н., и ДНК-расщепляющей области эндонуклеазы рестрикции Fok1, естественно встречающейся в бактериях, которая димеризуется и расщепляет участки ДНК [82]. Далее, TALENs - это белки, которые были обнаружены у патогенных для растений бактерий рода Xanthomonas, и их роль заключается в активации генов растений и поддержании вирулентности [25,78,83].

Таким же образом TALENs представляют собой ферменты рестрикции, способные разрезать определенные последовательности ДНК (~14-20 п.н.) и включающие два важнейших и различных домена: ДНК-связывающий и каталитический регион, который аналогичен ДНК-расщепляющему домену ZFNs. Интересующие участки ДНК могут быть подвегнуты целенаправленному воздействию и разрезаны для нокаута или knock in (KI) генов с помощью TALENs [84]. Оба метода требуют вставки последовательности ZFN/TALEN в плазмиды, которыми трансфицируются клетки. Последовательность ZFN/TALEN транскрибируется и транслируется в белки, которые проникают в ядро и связываются с ДНК для расщепления целевой последовательности. Кроме того, ферменты репарации могут генерировать ген KO, или в синтетическую ДНК а синтетическая ДНК может быть встроена для получения KI гена [81,85].

Напротив, революционная технология РНК-интерференции (RNAi) полностью отличается от нуклеазно-зависимых стратегий редактирования генома. Хотя нуклеазы, редактирующие геном, способствуют образованию DSBs в геномных регионах, RNAi осуществляет пост-транскрипционное глушение генов путем разрезания молекул мРНК [86,87]. Впервые этот механизм был выявлен в 1998 году при воздействии на dsRNA модельного организма Caenorhabditis elegans, что привело к подавлению экспрессии генов [88]. RNAi представляет собой консервативный биологический процесс у эукариот для прямого контроля генов и обычно работает для защиты от вирусов. Эта система включает два важных типа РНК: малые интерферирующие РНК (siRNA) и микроРНК (miRNA). Естественно, siRNA образуются из более длинных dsRNA, в то время как микроРНК производятся из ds-предшественников микроРНК. Обе молекулы имеют длину около 21 нт и взаимодействуют с Dicer, эндонуклеазным белком, который распознает молекулы ds РНК и расщепляет их на короткие сегменты [89]. Более того, эти малые РНК связываются с Argonauts и другими белками, создавая комплекс РНК-индуцированного сайленсинга, известный как RISC [90,91]. siRNA имеют идеальную комплементарность к определенным участкам мРНК, таким образом направляя RISC к соотв. цели, чтобы активировать Argonauts для разрушения созданных ими участков ds мРНК [91]. В случае микроРНК, которые также могут направлять RISC к мРНК, только часть последовательности микроРНК комплементарна и составляет пару с мишенью. Неточное соответствие микроРНК позволяет целенаправленно воздействовать на сотни молекул, что приводит к деградации мРНК или ингибированию трансляции [92,93].

Редактирование генома расцвело с развитием мощных методов биоинженерии, а именно ZFNs, TALENs и CRISPR-Cas, которые позволяют постоянно вносить изменения в определенный геномный участок организма-мишени [81]. Предыдущие методы редактирования ДНК были получены с помощью гомологичной рекомбинации путем доставки шаблона ДНК с 5'- и 3'-гомологичными рукавами в целевой геномный регион, а нуклеазы хозяина использовались для восстановления разрывов ДНК. Однако этот подход оказался трудоемким, а разработанная конструкция требует доставки длинного ДНК-шаблона и неэффективна в различных клетках млекопитающих. Таким образом, создание специальных нуклеаз, способных специфически распознавать и расщеплять ДНК-мишени, стало настоящим прорывом в геномной инженерии, который произвел революцию в биомедицинских исследованиях и клинической медицине [94].

Хотя ZFNs и TALENs являются преобразующими инструментами, которые расширили возможности манипулирования генами и организмами, у обоих есть ограничения и недостатки, которые система CRISPR-Cas стремится преодолеть [95,96]. В частности, мотивы цинковых пальцев ZFN расположены в виде массива, что влияет на специфичность соседних цинковых пальцев. Следовательно, разработка и выбор нужных доменов цинковых пальцев являются сложной и трудоемкой задачей, а специфичность мишени системы трудно предсказать (табл. 3). Аналогично, TALEN основаны на взаимодействии белка с ДНК, что влияет на специфичность метода. Напротив, инженерные инструкции TALENs более гибкие и простые, чем ZFNs, поскольку каждый домен TALEN распознает только один нуклеотид с четко определенной целевой специфичностью [97,98].

Table 3.

Main differences between HEs, ZFNs, TALENs, and CRISPR-Cas genome editing systems.

Среди методов редактирования генов новейшая технология CRISPR-Cas обеспечивает ряд преимуществ, становясь одним из наиболее перспективных инструментов для манипуляций с геномом. Более точно, доставка in vivo или in vitro как ZFNs, так и TALENs может привести к токсичности или летальности из-за связывания в нецелевых сайтах, что вносит разрывы в нежелательные регионы [79,97].

Система CRISPR-Cas основана на сопряжении оснований РНК-ДНК, что позволяет избежать взаимодействия белка с ДНК и дает много преимуществ по сравнению с ZFNs и TALENs, включая более простой дизайн для любой ДНК-мишени, легкость в обращении, высокую эффективность, ограниченное количество внецелевых участков, низкую стоимость и возможность одновременного изменения различных геномных участков путем добавления нескольких gRNAs (Таблица 3). Что касается редактирования транскриптома, то если сравнивать RNAi, традиционный пост-транскрипционный механизм подавления генов, с системой CRISPR-Cas, то последняя использует sgRNAs, которые могут устранить все варианты транскрипта гена с меньшим количеством вне-целевых эффектов [79,98]. Несомненно, превосходные возможности системы CRISPR-Cas обещают расширить наши знания о генной инженерии и проложить путь к необычайным достижениям в области биомедицины.

Всего за несколько лет CRISPR-Cas системы завоевали прочные позиции в современных научных исследованиях и науках о жизни и способствовали выдающимся прорывам в биотехнологии и современной медицине. Этот универсальный инструмент редактирования генома уже широко применяется в нескольких областях, включая сельское хозяйство, биоэнергетику, биотехнологию и медицину [99]. В сельском хозяйстве редактирование генов с помощью технологии CRISPR-Cas имеет большое значение, поскольку оно может быть использовано для производства CRISPR-модифицированных продуктов питания или создания устойчивых к болезням и засухоустойчивых культур для сокращения пищевых отходов и продления срока хранения продуктов [100]. Кроме того, использование системы CRISPR-Cas может быть ценным для биоэнергетики. Например, методы редактирования генов могут быть использованы для повышения устойчивости дрожжей к суровым условиям при производстве биотоплива. Более того, использование системы CRISPR-Cas для нокаута генов транскрипционных факторов, контролирующих образование липидов в водорослях, может привести к увеличению производства липидов для биодизеля [101,102].

Примечательно, что технология CRISPR-Cas в основном применяется в современных биомедицинских исследованиях, позволяя использовать множество способов манипулирования генами, клеточными линиями и моделями животных, поэтому технология была использована во многих подходах генотерапии [103-105]. Редактирование животных моделей имеет большое значение для понимания заболеваний человека и разработки новых терапевтических средств. В частности, инновационный подход CRISPR-Cas может быть использован для создания широкого спектра трансгенных моделей животных, включая рыбок данио, C. elegans и мышей на разных стадиях развития (Таблица 4) [106].

Table 4.

Применение системы CRISPR/Cas9 в моделях животных и клеточных линиях человека для изучения различных видов рака.

Создание трансгенных животных с CRISPR KO и KI для тестирования конкретных генов или панелей генов может дать новые знания о клеточных механизмах, провоцирующих заболевания человека, контролировать прогрессирование болезни и прогнозировать эффективность лекарственной терапии [107]. Кроме того, CRISPR-редактирование в животных моделях является первым шагом для разработки эффективных генотерапий, основанных на замене мутантных генов на гены дикого типа. Например, CRISPR KI был использован для введения гена пигментного ретинита (RP) в мышиные модели для изучения возможности обратного развития слепоты у мышей [108,109]. Другой подход к лечению серповидно-клеточной болезни был представлен в мышиных моделях, в которых β-глобин был отредактирован для повышения уровня фетального гемоглобина [110].

Системы CRISPR-Cas способствовали развитию биологии регуляции стволовых клеток, поскольку их можно исследовать на уровне всего генома. Первая попытка была предпринята в 2013 году, когда CRISPR-Cas9 был применен к моделям стволовых клеток больных муковисцидозом для коррекции мутации гена CFTR [111]. В дальнейшем метод применялся в различных моделях стволовых клеток для коррекции генетических мутаций, связанных с такими заболеваниями человека, как бета-талассемия, гемофилия и синдром Fragile X [112,113]. Кроме того, система CRISPR-Cas9 была использована для манипулирования органоидными культурами для изучения генетических дефектов при заболеваниях. Так, CRISPR-Cas9 используется для нокаута генов полицистина1 и полицистина2 (PKD1 и PKD2) эмбриональных стволовых клеток человека и генерирует мутантные органоиды почек с явными аномалиями [114,115]. Более того, редактирование CRISPR-Cas9 было применено к гемопоэтическим стволовым клеткам для изучения реакции у пациентов с ВИЧ [116]. В частности, известно, что определенная мутация в гене хемокинового ко-рецептора типа-5 (CCR5) ответственна за бессимптомное носительство ВИЧ. CRISPR-Cas9 был использован для создания устойчивых к ВИЧ клеток путем разрушения гена CCR5 в стволовых клетках пациентов с ВИЧ [117,118]. Дополнительные исследования показали, что разрушение CCR5 не оказывает токсического воздействия на клетки, поэтому отредактированные ВИЧ-устойчивые клетки могут эффективно восстанавливать иммунную систему и защищать от ВИЧ-инфекции [119]. Таким же образом клетки костного мозга были извлечены у пациентов с серповидно-клеточной болезнью, и система CRISPR-Cas9 отключила ген B-клеточной лимфомы 11A (BCL11A), который отвечает за изменение γ-глобина в цепь β-глобина, что привело к увеличению производства фетального гемоглобина в эритроцитах (Таблица 5) [120-122].

Table 5.

Applications of the CRISPR/Cas9 system used in clinical trials.

Использование CRISPR-Cas для создания клеток с особыми свойствами позволяет глубже понять стадии развития клеток или тканей, что, несомненно, способствовало развитию клеточной терапии. В частности, с помощью слияния dCas9 и транскрипционных белков-посредников, которые направляются специфической РНК, можно вводить в клетки для целенаправленного воздействия на интересующие гены и действовать как транскрипционные активаторы или репрессоры [123]. Например, сконструированная система CRISPR-dCas9 была использована для нацеливания на ген Granulin (GRN), фактор роста, способствующий прогрессии опухоли при раке печени [124,125]. Введение dCas9, слитого с генами эпигенетических супрессоров, таких как Krüppel-Associated Box Transcriptional Repression Domain (KRAB), DNA Methyltransferase (DNMT3a) и Histone 3 Lysine 27 Methyltransferase (EZH2), и gRNAs, нацеленных на GRN, приводит к снижению уровня его мРНК в клетках гепатомы Hep3B (Таблица 4) [126]. Дальнейшие исследования, посвященные раку мочевого пузыря, показали, что связывание dCas9 с фоточувствительным модулем CRY2-CIB1 (Cryptochrome 2-Calcium and Integrin Binding 1) может активировать экспрессию белков p53 и E-cadherin, подавляя биологическую функцию опухолевых клеток T24 [126,127]. Кроме того, Т-лимфоциты - это человеческие клетки, которые были генетически отредактированы для экспрессии искусственного химерного антигенного рецептора (CAR), способного распознавать специфические злокачественные опухоли и активировать иммунную систему для поражения и уничтожения раковых клеток [128]. Развитие CRISPR-опосредованного редактирования генома считается прорывом в иммунологии и закладывает основу для совершенствования терапевтических стратегий CAR-T. Следует отметить, что усовершенствования CRISPR-редактирования генома по сравнению с ранее существовавшими методами редактирования генома позволят повысить безопасность CAR-T клеточной терапии и усилить противоопухолевую активность CAR-T клеток [129,130]. Например, система CRISPR-Cas была использована для разрушения рецептора PD-1, который обычно связывается со своим лигандом PD-L1 и подавляет функцию Т-клеток. Было показано, что CRISPR KO может ограничить экспрессию PD-1 на поверхности CAR-T клеток, что в конечном итоге приводит к повышению способности убивать опухоли и предотвращать рак (Таблица 5) [131,132].

Развитие различных методов, основанных на системах CRISPR-Cas, заложило основу для изучения генетической информации на разных уровнях, поскольку эти технологии позволили нам опосредовать нокауты в жизненно важных генах, изменять эпигеномный профиль ДНК и исправлять последовательность мутировавших генов, ответственных за наследственные заболевания. Попытка использовать CRISPR-Cas системы в клинической практике оказалась многообещающей, так как позволила по-новому взглянуть на терапию, предполагая, что эти системы могут быть использованы для разработки новых терапевтических подходов для лечения многих заболеваний человека.