CRISPR, аббревиатура от clustered regularly interspaced short palindromic repeats, - это семейство генов, которые впервые появились у прокариотических организмов, таких как бактерии и археи, для защиты от инфекционных фагов.¹ Аналогично эукариотической адаптивной иммунной памяти, последовательности CRISPR происходят от бактериофагов, которые ранее заражали прокариоты; бактерии используют свои последовательности CRISPR и нуклеазы, называемые белками, связанными с CRISPR (Cas), для обнаружения и уничтожения знакомых бактериофагов.¹ Сегодня исследователи используют механизмы прокариотических систем CRISPR для разработки технологий редактирования генов, опосредованных CRISPR-Cas, которые используют белки Cas и направляющие РНК для блокирования, разрезания или редактирования целевых генов.¹

Cas9, происходящий из бактерии Streptococcus pyogenes, был первым Cas-белком, который ученые использовали для редактирования генов.¹ Технология CRISPR-Cas9 использует одну направляющую РНК (sgRNA) для нацеливания и разрезания ДНК. Исследователи создают sgRNA, специфичные для конкретной цели, объединяя две молекулы РНК из бактериальной системы CRISPR: последовательность, распознающую определенное место в ДНК (crRNA), и последовательность, которая действует как связующий каркас для Cas9 (tracrRNA). ¹ Модифицируемая последовательность crRNA позволяет ученым запрограммировать систему CRISPR-Cas9 на нацеливание на любую интересующую последовательность ДНК, если она находится рядом со специфической для Cas последовательностью ДНК, называемой протоспейсерно-примыкающим мотивом (PAM).^1,2 PAM инициирует связывание Cas9 с ДНК, crRNA проникает в двойную спираль и гибридизируется с целевой ДНК, а Cas9 разрушает размотанную двухцепочечную целевую ДНК непосредственно перед PAM. Механизмы репарации, а именно гомологично-направленная репарация (HDR) и негомологичное соединение концов (NHEJ), восстанавливают разрыв, который может изменить биологическую функцию целевого гена.³

Например, исследователи могут использовать различные механизмы репарации в своих интересах, чтобы намеренно вставить желаемое изменение последовательности с помощью шаблонно-зависимой HDR или внести случайные изменения с помощью шаблон-независимой NHEJ. Если ученые предоставят клеточному механизму репарации шаблон (матрицу) для целевого гена, содержащий мутацию, например, мутацию, связанную с заболеванием, процесс HDR включит мутацию в геном после расщепления Cas9.^1,2 В отличие от этого, более подверженный ошибкам путь NHEJ восстанавливает разрез Cas9 без шаблона, внося случайные вставки и делеции (indels), которые в конечном итоге нарушают экспрессию гена или приводят к потере функции.^1,2 Любой из этих подходов позволяет исследовать, как глушение или редактирование целевого гена влияет на его последующие пути.¹

Инфографика CRISPR-Cas9 вызывает тупой двухцепочечный разрыв ДНК в целевом гене, который становится субстратом для репарации ДНК с помощью негомологичного концевого соединения (NHEJ) или гомологично направленной репарации (HDR).

Ученые программируют CRISPR-Cas9 для создания двухцепочечных разрывов ДНК с тупым концом в целевых геномных локусах на основе близлежащих мотивов соседства протоспейсеров (PAM) и сконструированных специфических для цели одиночных направляющих РНК (sgRNAs). После того как Cas9 расщепляет ДНК, целевой ген становится субстратом для клеточного механизма репарации ДНК, который катализирует механизмы негомологичного концевого соединения (NHEJ) или гомологично направленной репарации (HDR), нарушающие экспрессию генов или вводящие новые последовательности ДНК.

Исследователи часто сталкиваются с тем, что Cas9 разрезает ДНК не по назначению, что может привести к транслокациям, неожиданным крупным делециям и нежелательным изменениям экспрессии генов.⁴ Чтобы избежать таких побочных эффектов, исследователи разрабатывают альтернативы Cas9.⁵

Таблица 1. Обзор Cas9 и распространенных альтернатив Cas9^5-7

Cas9 Streptococcus pyogenes Расщепляет двухцепочечную ДНК. Создает тупые концы GC-богатые (например, 5'-NGG-3')

Cas12a Acidaminococcus Lachnospiraceae Расщепляет двухцепочечную ДНК. Создает ступенчатые концы с 5' нависаниями . Облегчает редактирование нескольких генов . AT-богаты[ (например, 5'-TTN-3')

Cas13 Leptotrichia shahii Расщепляет одноцепочечную РНК. Нет мотива PAM.

Cas12a имеет множество преимуществ перед Cas9 (табл. 1).⁸ Белок производит ступенчатые, а не тупые концы разрывов ДНК,⁹ это позволяет использовать механизмы HDR вместо NHEJ. Кроме того, Cas12a не нуждается в tracrRNA и обладает активностью РНКзы, которая может обрабатывать один массив pre-crRNA, содержащий несколько направляющих РНК, что облегчает редактирование мультигенов по сравнению с Cas9.¹⁰ Cas12a также имеет меньшее количество вне-целевых эффектов по сравнению с Cas9,¹¹ и уникально способен к PAM-независимой деградации одноцепочечной ДНК, что полезно для диагностических приложений.^5,12

Cas13 отличается от Cas9 и Cas12a тем, что расщепляет не ДНК, а одноцепочечную РНК. Работая со своей направляющей последовательностью, он с высокой эффективностью нацеливается на деградацию РНК в эукариотических клетках. Это перспективный подход для транскриптомной инженерии, поскольку он модулирует экспрессию генов без изменения последовательности ДНК.¹³

Редакторы оснований и прайм-редакторы - это технологии нового поколения на основе CRISPR, основанные на каталитически ослабленных белках Cas, называемых никазами, которые исследователи объединяют с другими ферментами, модифицирующими ДНК.² Поскольку никазы Cas менее активны, чем традиционные нуклеазы Cas, они вносят одноцепочечные разрывы ДНК (или nicks) вместо двухцепочечных разрывов. Эти разрывы обычно не задействуют механизм репарации ДНК, что позволяет ферментам слияния воздействовать на ДНК с большей точностью редактирования, чем при использовании методов репарации.²

Для редактирования оснований используются модифицированные версии белков Cas, разрезающих ДНК, которые сохраняют свою способность связывать ДНК, не создавая при этом двухцепочечных разрывов.¹⁴ Эти белки Cas с пониженным каталитическим уровнем направляют фермент аденин- или цитидиндезаминазу в определенный участок ДНК, где они вызывают преобразование C G в T A или A T в G C.¹⁵ Теоретически редактирование оснований может исправить любую transition mutation (A в G или C в T),¹⁶ которые составляют примерно 30 процентов известных аллелей заболеваний и являются самым большим классом мутаций, вызывающих заболевания человека.¹⁴

При редактировании праймеров белок Cas, лишенный нуклеазы, притягивает обратную транскриптазу к нужной последовательности ДНК, не создавая двухцепочечных разрывов.¹⁷ Обратная транскриптаза преобразует РНК в ДНК. В контексте редактирования праймеров обратная транскриптаза заменяет или вставляет последовательность ДНК, кодируемую направляющей РНК праймового редактора (pegRNA).¹⁷ Эти очень универсальные прайм-редакторы не ограничены конкретной парой оснований и могут катализировать переключение между любыми основаниями. Они также могут генерировать вставки до 44 пар оснований (п.п.) и делеции до 80 п.п.¹⁸.

CRISPR-модуляция изменяет экспрессию генов без внесения изменений в последовательность ДНК.¹⁹ Ученые соединяют каталитически неактивную нуклеазу Cas (мертвую Cas или dCas) либо с репрессорным доменом для CRISPR-интерференции (CRISPRi), либо с доменом активации транскрипции для CRISPR-активации (CRISPRa).¹⁹ Сплавленный белок dCas связывается с целевой последовательностью ДНК, не вызывая двуцепочечных разрывов, рекрутирует малые регуляторные РНК в локус и вызывает либо нокдаун экспрессии генов (CRISPRi через репрессорный домен), либо активацию экспрессии генов (CRISPRa).²⁰

Редактирование оснований имеет мощный медицинский потенциал благодаря низкому риску создания вставок и делеций. В клинических испытаниях оно было использовано в паре с терапией CAR-T-клетками для лечения лейкемии, не поддающейся иному лечению.²¹

Поскольку прайм-редактирование может исправлять большинство мутаций, исключая крупные дупликации, делеции, вставки или хромосомные перестройки, исследователи изучают его возможности для лечения различных заболеваний, от наследственных болезней до рака.²²

Наконец, до-клиническое применение CRISPRi и CRISPRa позволяет исследователям проводить масштабные скрининги генетических сетей, лежащих в основе заболеваний с неизвестной этиологией, таких как нейродегенеративные нарушения. ^23,24

1. Doudna JA, Charpentier E. Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 2014;346(6213):1258096.

2. Manghwar H, et al. CRISPR/Cas system: Recent advances and future prospects for genome editing. Trends Plant Sci. 2019;24(12):1102-1125.

3. Li T, et al. CRISPR/Cas9 therapeutics: Progress and prospects. Sig Transduct Target Ther. 2023;8(1):36.

4. Brunet E, Jasin M. Induction of chromosomal translocations with CRISPR-Cas9 and other nucleases: Understanding the repair mechanisms that give rise to translocations. Adv Exp Med Biol. 2018;1044:15-25.

5. Hillary VE, Ceasar SA. A Review on the mechanism and applications of CRISPR/Cas9/Cas12/Cas13/Cas14 proteins utilized for genome engineering. Mol Biotechnol. 2023;65(3):311-25.

6. Schubert MS, et al. Optimized design parameters for CRISPR Cas9 and Cas12a homology-directed repair. Sci Rep. 2021;11(1):19482.

7. Cox DBT, et al. RNA editing with CRISPR-Cas13. Science. 2017;358(6366):1019-27.

8. Zetsche B, et al. Multiplex gene editing by CRISPR-Cpf1 using a single crRNA array. Nat Biotechnol. 2017;35(1):31-34.

9. Swarts DC, Jinek M. Cas9 versus Cas12a/Cpf1: Structure-function comparisons and implications for genome editing. Wiley Interdiscip Rev RNA. 2018;9(5):e1481.

10. Zetsche B, et al. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system. Cell. 2015;163(3):759-771.

11. Modrzejewski D, et al. Which factors affect the occurrence of off-target effects caused by the use of CRISPR/Cas: A systematic review in plants. Front Plant Sci. 2020;11:574959.

12. Chen JS, et al. CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity. Science. 2018;360(6387):436-439.

13. Tong H, et al. High-fidelity Cas13 variants for targeted RNA degradation with minimal collateral effects. Nat Biotechnol. 2023;41(1):108-119.

14.Newby GA, Liu DR. In vivo somatic cell base editing and prime editing. Mol Ther. 2021;29(11):3107-3124.

15. Doi G, et al. Catalytically inactive Cas9 impairs DNA replication fork progression to induce focal genomic instability. Nucleic Acids Research. 2021;49(2):954-968.

16. Alderton GK. DNA transitions. Nat Rev Cancer. 2013;13(4):221-221.

17. Chen PJ, Liu DR. Prime editing for precise and highly versatile genome manipulation. Nat Rev Genet. 2023;24(3):161-177.

18. Anzalone AV, et al. Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA. Nature. 2019;576(7785):149-157.

19. Qi LS, et al. Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression. Cell. 2013;152(5):1173-1183.

20. Cheng AW, et al. Multiplexed activation of endogenous genes by CRISPR-on, an RNA-guided transcriptional activator system. Cell Res. 2013;23(10):1163-1171.

21. Genomics Education Programme. Cancer therapy involving genome editing cures another child’s leukaemia. Genomics Education Programme. Published January 13, 2023. Accessed August 28, 2023.

22. Godbout K, Tremblay JP. Prime editing for human gene therapy: Where are we now? Cells. 2023;12(4):536.

23. Bendixen L, et al. CRISPR-Cas-mediated transcriptional modulation: The therapeutic promises of CRISPRa and CRISPRi. Molecular Therapy. 2023;31(7):1920-1937.

24. Kampmann M. CRISPR-based functional genomics for neurological disease. Nat Rev Neurol. 2020;16(9):465-80.