В настоящее время проводятся революционные клинические испытания, которые могут привести к появлению новых мощных CRISPR-методов лечения ВИЧ, генетической слепоты и других заболеваний, но при этом сохраняются некоторые опасения по поводу безопасности. Одно из опасений заключается в том, что при введении CRISPR непосредственно в организм пациентов у них могут возникнуть серьезные иммунные реакции на Cas9 - фермент бактериального происхождения, который разрезает ДНК. В недавнем препринте (1) появилась информация о методике, разрушающей Cas9 в ответ на действие препарата, одобренного Управлением по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных средств США (FDA), и исследователи, разработавшие эту методику, надеются, что в конечном итоге она может быть использована в качестве "выключателя" CRISPR в случае плохой реакции.

"Когда вы помещаете бактериальную систему в человеческий организм, это немного рискованно, поскольку иммунная система просто сходит с ума", - сказал Amit Choudhary из Института Брода (Broad Institute), возглавлявший работу. "Нам нужно что-то такое, что при неблагоприятном сценарии полностью отключит [систему] или снизит ее эффективность".

Чтобы добиться такого контроля, Choudhary и его коллеги добавили к ферменту Cas9 специальный элемент реакции и ввели в него препарат помалидомид, который действует как молекулярный клей, соединяющий белки, которые иначе не могли бы взаимодействовать. В данном случае помалидомид приводит специальный ответный элемент в контакт с белком, который метит его и Cas9 для уничтожения собственным убиквитин-протеасомным путем деградации клетки.

Вскоре после этого Cas9 был демонтирован - или "измельчен", как назвал его Choudhary, - протеасомой. Доза помалидомида контролирует скорость этого процесса, определяя период полураспада Cas9. В культивируемых клетках концентрация в один микромоль очищала генный редактор в течение тридцати минут, а обычно этот процесс занимает 24 часа (2). Поскольку помалидомид является препаратом, одобренным Управлением по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных средств США (FDA), то в перспективе Choudhary планирует, что пациенты смогут принимать таблетки для контроля длительности пребывания Cas9 в организме.

Команда воспроизвела этот подход с базовыми и эпигенетическими редакторами, использующими другие версии Cas9, что позволяет предположить, что он может быть использован с большинством редакторов на основе CRISPR. Важно отметить, что сокращение периода полураспада Cas9 привело к пропорционально меньшему количеству правок в нежелательных местах, вызывающих эффекты "вне мишени", и что клей может снизить активность редактирования при использовании на мышах.

Karen Maxwell из Университета Торонто, не принимавшая участия в работе, отметила, что молекулярный клей - это умная идея, но трудно судить, лучше ли он других платформ управления или эквивалентен им. "Они избавились от off-target эффектов, но при этом снизилось и on-target редактирование", - сказала она. "Если у нас намного меньше редактирования, то вне-целевых эффектов будет намного меньше по определению".

Однако подход Choudhary отличается тем, что он способен разрушать Cas9. Другие аналогичные способы контроля активности CRISPR, такие как анти-CRISPR, ингибиторы малых молекул и деактивация светом, как правило, блокируют Cas9, а не уничтожают его. По словам Choudhary, этого, вероятно, будет недостаточно, если у пациента возникнет иммунная реакция. Более того, некоторые из них могут сами представлять иммунную угрозу.

Это важный момент, соглашается Erik Sontheimer из Медицинской школы Массачусетского университета Чан, также не принимавший участия в работе. "[Иммунный риск, связанный с Cas9], еще не установлен, но он, конечно, правдоподобен, - сказал он. И есть некоторые свидетельства того, что это может стать проблемой": В исследовании 2019 года сообщалось, что большинство из 125 участников имели уже существующий иммунитет к Cas9, что означает, что их иммунная система может отреагировать на терапию CRISPR-Cas9, проводимую in vivo (3).

Такой иммунитет - не просто проблема безопасности, он может повлиять на эффективность терапии. В исследовании на мышах, проведенном в 2018 году, было показано, что уже существующий иммунитет к Cas9 в конечном итоге привел к полному уничтожению отредактированных клеток (4). По мнению Avery August, иммунолога из Корнельского университета, не принимавшего участия в основной работе, то же самое может произойти и у людей. "Если иммунная система мобилизована, то некоторые Т-клетки в иммунном ответе могут уничтожить клетки [несущие Cas9], что приведет к притуплению эффекта", - сказал он.

Является ли измельчение решением потенциальных иммунных рисков Cas9, пока неясно. С точки зрения Августа, только люди без уже существующего иммунитета, вероятно, получат от него пользу, поскольку путь деградации, который он использует, тот же самый, который используется для передачи иммунной системе фрагментов чужеродного материала. Другими словами, измельченные кусочки Cas9 могут увеличить риск запуска иммунной системы, если у человека есть иммунитет.

По его словам, "если разрушить ферменты достаточно быстро, чтобы не успеть выработать иммунитет, то это может оказать благоприятное воздействие". В этом случае клей будет меньше похож на выключатель, а больше на плащ-невидимку.

1. Sreekanth, Vedagopuram, et al. "A molecular glue approach to control the half-life of CRISPR-based technologies," bioRxiv, 2023-03, 2023.

2. Kim, Sojung, et al. "Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins," Genome Research, 24.6:1012-1019, 2014.

3. Charlesworth, Carsten T., et al. "Identification of preexisting adaptive immunity to Cas9 proteins in humans," Nature Medicine 25.2: 249-254, 2019.

4. Li, Ang, et al. "AAV-CRISPR gene editing is negated by pre-existing immunity to Cas9," Molecular Therapy 28.6: 1432-1441, 2020.