Посещений:
CRISPR/Cas9 РЕДАКТИРОВАНИЕ ГЕНОВ



Выявление эффектов вне мишени

Off-target effects in CRISPR/Cas9 gene editing
Congting Guo, Xiaoteng Ma, Fei Gao,Yuxuan Guo
Front. Bioeng. Biotechnol., 09 March 2023 Sec. Preclinical Cell and Gene Therapy Volume 11 - 2023 | https://doi.org/10.3389/fbioe.2023.1143157

Gene editing stands for the methods to precisely make changes to a specific nucleic acid sequence. With the recent development of the clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 system, gene editing has become efficient, convenient and programmable, leading to promising translational studies and clinical trials for both genetic and non-genetic diseases. A major concern in the applications of the CRISPR/Cas9 system is about its off-target effects, namely the deposition of unexpected, unwanted, or even adverse alterations to the genome. To date, many methods have been developed to nominate or detect the off-target sites of CRISPR/Cas9, which laid the basis for the successful upgrades of CRISPR/Cas9 derivatives with enhanced precision. In this review, we summarize these technological advancements and discuss about the current challenges in the management of off-target effects for future gene therapy.
Инструменты для редактирования генома открывают большие перспективы в лечении генетических и не генетических заболеваний. В ранних исследованиях для редактирования генома использовались нуклеазы с цинковыми пальцами (ZFNs) и нуклеазы с эффекторами, подобными активаторам транскрипции (TALENs) (Urnov et al., 2010; Joung and Sander, 2013; Shamshirgaran et al., 2022). ZFNs и TALENs зависят от белковой инженерии ДНК-связывающих доменов для распознавания и редактирования определенных последовательностей ДНК. Этот процесс может быть неэффективным, утомительным и дорогостоящим, что ограничивает применение редактирования генома. Недавно эти проблемы были решены благодаря появлению системы кластеризованных регулярно перемежающихся коротких палиндромных повторов (CRISPR)/Cas9. CRISPR/Cas9 - это класс рибонуклеопротеиновых комплексов, образованных белком Cas9 и одной направляющей РНК (sgRNA) (Jinek et al., 2012; Cho et al., 2013; Cong et al., 2013; Wang et al., 2016a). Cas9 может вызывать расщепление ДНК в желаемых геномных позициях, которые определяются точным сопряжением оснований между sgRNA и ДНК, примыкающей к мотиву protospacer-adjacent (PAM) (Jinek et al., 2012; Cho et al., 2013; Cong et al., 2013; Wang et al., 2016a). Конструирование sgRNA более удобно, программируемо и экономически эффективно, чем конструирование ДНК-связывающих доменов, поэтому CRISPR/Cas9 более предпочтителен, чем ZFNs и TALENs, и произвел революцию в области биотехнологий (Zhang et al., 2021; Tran et al., 2022).
Комплекс Cas9/sgRNA вызывает сайт-специфические двухцепочечные разрывы ДНК (DSBs), стимулируя пути гомологично-направленной репарации (HDR) или негомологичного соединения концов (NHEJ) для редактирования генома. HDR - это точный, но неэффективный механизм, который использует гомологичный донорский шаблон (матрицу) для восстановления разрезов ДНК (Li et al., 2019; Fu et al., 2021). В отличие от него, подверженный ошибкам механизм NHEJ вносит небольшие вставки и делеции (indels), а точные изменения последовательности непредсказуемы и неконтролируемы (Fu et al., 2021). Когда indels возникают в кодирующей последовательности данного гена, NHEJ может вызвать мутации со сдвигом рамки считывания, что приводит к распаду мРНК и замалчиванию генов, из-за отсутствия смысла (Wang et al., 2016a; Zischewski et al., 2017; Lindeboom et al., 2019).
Хотя системы CRISPR/Cas обладают огромным потенциалом в трансляционной медицине, вне-целевые эффекты остаются серьезной проблемой (Fu et al., 2013; Hsu et al., 2013; Pacesa et al., 2022). Внецелевые эффекты возникают, когда Cas9 действует на нецелевые участки генома и создает разрезы, которые могут привести к неблагоприятным последствиям. Сайты эффекта вне мишени (off-target) часто зависят от sgRNA поскольку известно, что Cas9 допускает до 3 несоответствий между sgRNA и геномной ДНК (Fu et al., 2013; Hsu et al., 2013; Wang et al., 2016a). При таком сценарии инструменты in silico полезны для поиска потенциальных off-target сайтов во всем геноме и расчета вероятности off-target редактирования (Naeem et al., 2020). Тем не менее, многочисленные исследования доказали, что существуют и независимые от sgRNA эффекты off-target, что требует непредвзятого экспериментального обнаружения и проверки (Richter et al., 2020; O'Geen et al., 2015). В данном обзоре мы обобщили имеющиеся методы оценки вне-целевых эффектов, указав их преимущества и ограничения. Некоторые из этих методов обнаружения для предсказания off-targets применимы для других нуклеаз семейства Cas, таких как Cas12a (Cpf1), которые также создают DSBs на off-target сайтах (Kim et al., 2019). Кроме того, мы обсуждаем стратегии по улучшению специфичности CRISPR/Cas9 и снижению нежелательного мутагенеза, что крайне важно для их будущего применения в генной терапии.
2 In silico prediction


Нецелевые эффекты CRISPR/Cas9 могут быть предсказаны с помощью инструментов in silico, которые обычно представляют собой онлайн-программы с открытым исходным кодом, доступные через Интернет (Bao et al., 2021). Алгоритмы предсказания этих программ в основном основаны на последовательностях sgRNA поэтому результаты этих методов обычно смещены в сторону sgRNA-зависимых off-target эффектов. Эти вычислительные методы обычно недостаточно учитывают сложное внутриядерное микроокружение, такое как эпигенетическое состояние и состояние организации хроматина, поэтому предсказание off-target с помощью in silico инструментов нуждается в дальнейшей экспериментальной проверке (Таблица 1).

Таблица 1

ТАБЛИЦА 1. In silico и экспериментальные методы для предсказания off-target в масштабах генома.

Программное обеспечение для предсказания off-target можно разделить на две группы в зависимости от формата выходных данных. Первая группа производит данные, описывающие уровень выравнивания sgRNA с предполагаемыми off-target сайтами в геноме. К таким программам относятся CasOT, Cas-OFFinder, FlashFry и Crisflash. CasOT - первый исчерпывающий инструмент для предсказания сайтов off-target в предоставленном пользователем референсном геноме, который позволяет настраивать несколько параметров, включая последовательность PAM и число несоответствий (Xiao et al., 2014). Cas-OFFinder получил более широкое применение благодаря высокой толерантности к длине sgRNA, типу PAM и количеству несовпадений или выступов (Bae et al., 2014). FlashFry предназначен для определения характеристик сотен тысяч последовательностей CRISPR-мишеней за короткое время. Это высокопроизводительный инструмент, который также может предоставлять информацию о содержании GC и оценках on/off-target (McKenna and Shendure, 2018). Crisflash - это инструмент для конструирования sgRNA и обнаружения скрытых вне мишени последовательностей, который работает на порядок быстрее, чем другие программы (Jacquin et al., 2019).
Вторая группа in silico инструментов может использовать более сложные модели апрбирования для облегчения вычислительной номинации сайтов off-target. К таким алгоритмам относятся MIT score, CCTop (Consensus Constrained TOPology prediction), CROP-IT (CRISPR/Cas9 Off-target Prediction and I dentification Tool), CFD (Cutting frequency determination), DeepCRISPR и программные пакеты Elevation. Алгоритм MIT взвешивает позиционный эффект несоответствий в sgRNA для получения оценки вне-целевых эффектов (Hsu et al., 2013; Haeussler et al., 2016). CCTop и CROP-IT генерируют баллы на основе расстояний между несоответствиями и PAM (Singh et al., 2015; Stemmer et al., 2015). Алгоритм CFD разработан на основе эксперимента по генетическому скринингу CRISPR/Cas9, в ходе которого оценивались вне-целевые эффекты тысяч sgRNA (Doench et al., 2016). DeepCRISPR - это комплексная вычислительная платформа, использующая глубокое обучение для предсказания сайтов расщепления вне мишени. Она учитывает эпигенетические особенности, такие как раскрытие хроматина и метилирование ДНК, чтобы определить геномные профили off-target (Chuai et al., 2018). Аналогично, инструмент Elevation также включает информацию о доступности ДНК для прогнозирования потенциальных сайтов off-target (Listgarten et al., 2018). Недостатком Elevation является то, что он работает только с экзомом человека (GRCh38), что ограничивает его более широкое использование в других организмах (Listgarten et al., 2018).
3 Experimental detection
3.1 Cell-free methods


Бесклеточные методы восстанавливают реакцию нуклеазы на ДНК или хроматине, которые извлекаются из клеток, чтобы напрямую идентифицировать геномные расщепления в пробирках. К бесклеточным методам относятся Digenome-seq (секвенирование переваренного генома), DIG-seq (Digenome-seq с использованием бесклеточной хроматиновой ДНК), Extru-seq, SITE-seq (селективное обогащение и идентификация меченых концов геномной ДНК путем секвенирования) и CIRCLE-seq (циркуляризация для регистрации эффектов расщепления in vitro путем секвенирования) (Таблица 1).

Digenome-seq - высокочувствительный метод, позволяющий выявлять indels с частотой 0,1 % и ниже (Kim et al., 2015). В этом методе геномную ДНК сначала выделяют из клеток и инкубируют с рибонуклеопротеидным (РНП) комплексом Cas9/sgRNA для редактирования генов. Отредактированная ДНК затем анализируется методом полногеномного секвенирования (WGS) для обнаружения последовательностей, точно совпадающих на одном конце, что указывает на локусы, в которых существуют DSB. Текущий конвейер Digenome-seq оснащен усовершенствованным алгоритмом оценки и позволяет проводить скрининг вне-целевых сайтов с использованием нескольких sgRNA (Kim et al., 2016). Из-за высокого фона неспецифических DSBs в очищенных образцах ДНК Digenome-seq требует высокого покрытия секвенирования (~400-500 миллионов чтений для генома человека), поэтому стоимость секвенирования может быть относительно высокой (Kim et al., 2019). Потребность в высококачественном эталонном геноме также ограничивает его более широкое использование в редких организмах (рис. 1A).



FIGURE 1. Schematics of experimental methods for genome-wide off-target prediction.

Основным недостатком Digenome-seq является то, что состояния хроматина не учитываются при оценке эффектов вне мишени. Для решения этой проблемы была разработана обновленная версия Digenome-seq под названием DIG-seq (Kim and Kim, 2018). В DIG-seq вместо очищенной ДНК используется бесклеточный хроматин, что повышает точность определения сайтов off-target. Сравнительное исследование между Digenome-seq и DIG-seq убедительно показало влияние состояния хроматина на активность off-target (Kim and Kim, 2018).
Чтобы еще больше сохранить геном в его внутриклеточном состоянии для лучшего обнаружения off-target, Jeonghun et al. недавно представили Extru-seq (Kwon et al., 2023). В этом методе взвешенные живые клетки сначала смешивают с очищенным комплексом Cas9/sgRNA RNP. Затем клетки механически лизируют, пропуская через поры, диаметр которых меньше диаметра клетки, чтобы высвободить геномную ДНК, реагирующую с Cas9/sgRNA перед WGS (Kwon et al., 2023). По сравнению с другими бесклеточными методами, такими как Digenome-seq, процент ложно-положительных результатов Extru-seq значительно ниже (Kwon et al., 2023). Интересно, что по сравнению с клеточными методами, такими как GUIDE-seq (см. следующий раздел) (Tsai et al., 2015), Extru-seq демонстрирует гораздо меньший процент ложно-отрицательных результатов (2,3 % против 29 %) (Kwon et al., 2023). Таким образом, Extru-seq объединяет преимущества как бесклеточных, так и клеточных методов.
Все вышеперечисленные методы предполагают дорогостоящий этап WGS. Чтобы снизить затраты, ученые разработали SITE-seq - метод, который добавляет селективную реакцию биотинилирования к расщепленным геномным участкам и использует стрептавидиновое вытягивание для обогащения этих участков перед секвенированием (Cameron et al., 2017). SITE-seq снижает фоновый шум Digenome-seq и требует гораздо меньшего покрытия секвенирования (~0,62-2,46 млн чтений для генома человека). Тем не менее, точность SITE-seq в поиске вне-целевых сайтов остается низкой: только 10 % положительных совпадений могут быть подтверждены с помощью целевого секвенирования (Kim et al., 2019).
CIRCLE-seq - еще один метод, позволяющий обнаружить внегеномные сайты без проведения WGS. В этом методе геномная ДНК сначала измельчается и циркулирует путем внутримолекулярного лигирования. В присутствии комплексов Cas9/sgRNA циркулярные фрагменты ДНК селективно линеаризуются при расщеплении нуклеазой Cas9, после чего они становятся доступными для создания библиотек и высокопроизводительного секвенирования (Tsai et al., 2017; Lv et al., 2022; Pan et al., 2022). Этот метод позволяет эффективно удалять неспецифическую линейную ДНК и непереваренную циркулярную ДНК, что значительно снижает фон при обнаружении внецелевых участков. Для успешного анализа генома человека методом CIRCLE-seq требуется всего ~4-5 миллионов чтений (Kim et al., 2019). Однако процент ложно-положительных результатов CIRCLE-seq все еще высок и требует тщательной проверки с помощью целевого секвенирования (Tsai et al., 2017).
3.2 Cell culture-based methods


Поскольку внутриядерный контекст влияет на поведение редакторов генома, прямая оценка вне-целевых эффектов в клетках была бы более благоприятной, чем бесклеточные методы. В настоящее время используются WGS, Cas9 ChIP-seq (иммунопреципитация хроматина с последующим высокопроизводительным секвенированием), IDLVs (лентивирусные векторы с дефектом интегразы), GUIDE-seq (геномная, беспристрастная идентификация DSBs с помощью секвенирования), LAM-HTGTS (линейная амплификация-опосредованное высокопроизводительное геномное секвенирование), BLESS (маркировка разрывов, обогащение стрептавидином и секвенирование следующего поколения) и BLISS (маркировка разрывов in situ и секвенирование) были разработаны для достижения этой цели (таблица 1).
WGS-анализ вне-целевых эффектов был хорошо документирован в исследованиях клеточных культур (Smith et al., 2014; Veres et al., 2014; Iyer et al., 2015). Сравнивая последовательности генома до и после редактирования CRISPR/Cas9, WGS может напрямую выявить желательные и нежелательные события редактирования. Точность и чувствительность WGS при обнаружении нецелевых участков определяется глубиной секвенирования, поэтому при необходимости определения низкочастотных нецелевых участков WGS становится дорогостоящим.
Чтобы избежать непомерно высокой стоимости WGS, необходимо обогащать редактируемые CRISPR/Cas сайты перед секвенированием. Один из таких подходов предполагает использование Cas9 ChIP-Seq для определения сайтов связывания Cas9 в геноме. В этом методе используется каталитически неактивный Cas9 (dCas9), который может связываться с геномной ДНК, не создавая DSBs и не отделяясь от редактируемых участков (Kuscu et al., 2014; Wu et al., 2014). В одном из исследований был проведен dCas9 ChIP-Seq с 12 различными sgRNA в клетках HEK293T и успешно подтверждено разрезание ДНК примерно в 50 % предсказанных сайтов off-target (Kuscu et al., 2014). Однако в других публикациях наблюдался гораздо более низкий процент валидации (Cencic et al., 2014; Duan et al., 2014; Tsai et al., 2015). Эти исследования показали, что Cas9 может ассоциироваться с геномными локусами, не выполняя свою нуклеазную функцию, что является основным препятствием для анализа Cas9 ChIP-Seq, основанного на обнаружении вне-целевого воздействия.
Для более точного определения вне-целевых эффектов в клетках необходимо внутриклеточное мечение CRISPR/Cas9-редактированных локусов для обогащения этих фрагментов ДНК. Одним из таких инструментов маркировки являются дефектные по интегразе лентивирусные векторы (IDLV), которые проявляют склонность к интеграции вблизи DSBs (Wang et al., 2015; Kim et al., 2019). IDLV был впервые разработан для обнаружения DSB, созданных ZFNs и TALENs (Gabriel et al., 2011; Wang et al., 2015; Wang et al., 2021). Интегрированные в IDLV сайты могут быть выборочно амплифицированы с помощью ПЦР для высокопроизводительного секвенирования. Благодаря способности лентивирусов к надежной трансдукции в определенные типы клеток, этот метод позволяет выявлять внецелевые эффекты в тех типах клеток, которые иначе трудно трансфицировать (Ferrari et al., 2022). К недостаткам IDLV можно отнести низкую чувствительность и высокий процент ложно-положительных результатов, что, вероятно, связано с неспецифической интеграцией IDLV и амплификацией ПЦР (Martin et al., 2016).
Другой более популярный метод обнаружения вне-целевых участков в клетках называется GUIDE-seq (Tsai et al., 2015). Этот метод основан на доставке двухцепочечных олигонуклеотидов (dsODN) с известными последовательностями, которые могут интегрироваться в DSBs в процессе NHEJ (non-homologous end joining). Интегрированные dsODN служат шаблонами для направленной ПЦР-амплификации и секвенирования меченых фрагментов ДНК (Tsai et al., 2015; Malinin et al., 2021; Yaish et al., 2022) (рис. 1B). GUIDE-seq может обнаруживать вне-целевые сайты с частотой indels до 0,03 % (Tsai et al., 2015). GUIDE-seq более чувствителен, чем метод IDLV, поскольку dsODN более эффективно и точно интегрируются в DSB, в то время как события интеграции IDLV малочисленны и могут распространяться на расстояние до 500 п.н. от реальных сайтов DSB (Tsai et al., 2015; Cromer et al., 2023). Основное ограничение GUIDE-seq связано с низкой эффективностью доставки dsODNs в клетки, что приводит к обнаружению только 30-50 % всех DSBs (Tsai et al., 2015; Pan et al., 2022).
IDLV и GUIDE-seq полагаются на активность вставки ДНК в ходе NHEJ. Однако DSB также могут приводить к транслокации и перестройке хромосом. Для лучшего обнаружения таких DSB был разработан метод LAM-HTGTS (Frock et al., 2015; Hu et al., 2016). В этом методе клетки млекопитающих культивируются с нуклеазой Cas9 для создания DSB "приманки" и "жертвы". DSB-приманки - это сайты, которые, как известно, расщепляются нуклеазой, а DSB-ловушки - это неизвестные вне-целевые сайты, которые, как ожидается, будут лигироваться с сайтом-приманкой после перестройки хромосомы. Соединения приманки и добычи могут быть линейно амплифицированы и обогащены с помощью биотинилированного праймера. Затем эти ДНК присоединяются к адаптерам и селективно амплифицируются с помощью вложенной ПЦР для NGS-анализа (Schmidt et al., 2007; Hu et al., 2016) (рис. 1С). Преимуществом этого метода является возможность выявления хромосомных транслокаций, которые могут быть пропущены другими методами (Hu et al., 2016; Li et al., 2019; Xu et al., 2023). Однако, поскольку транслокации ДНК происходят реже, чем небольшие вставки ДНК, сопоставима ли чувствительность LAM-HTGTS с другими методами обнаружения вне-целевого воздействия, остается под вопросом (Hu et al., 2016; Li et al., 2019).
IDLV, GUIDE-seq и LAM-HTGTS измеряют фрагменты ДНК, образующиеся в результате DSB, чтобы косвенно определить наличие DSB. В качестве альтернативы DSB могут быть непосредственно обнаружены с помощью метода BLESS (прямое мечение разрывов in situ, обогащение стрептавидином и секвенирование следующего поколения), который фиксирует DSB in situ путем лигирования биотинилированных линкеров к сайтам расщепления в фиксированных клетках (Crosetto et al., 2013) (рис. 1D). BLESS демонстрирует частоту ложноположительных результатов менее 1 % (Crosetto et al., 2013; Yan et al., 2017; Kim et al., 2019), что подтверждает точность этого метода. Основное ограничение этого метода заключается в том, что BLESS фиксирует только DSB, присутствующие в момент фиксации образца, что недостаточно отражает внецелевые события. Поэтому для снижения частоты ложноотрицательных результатов BLESS требуются миллионы клеток.
Чтобы повысить чувствительность BLESS и снизить требования к количеству клеток, была разработана технология BLISS (breaks labeling in situ and sequencing) (Yan et al., 2017). BLISS лигирует концы DSB с адаптерами, содержащими промотор T7, поэтому меченые фрагменты ДНК могут быть линейно амплифицированы через T7-опосредованную транскрипцию перед секвенированием (Yan et al., 2017; Ballarino et al., 2021). По сравнению с BLESS, BLISS требует всего несколько тысяч клеток и демонстрирует более высокую чувствительность. Например, Winston et al. провели side-by-side сравнение BLISS и BLESS для выявления off-target сайтов вызываемых sgRNA, нацеленных на EMX1 или VEGFA (Yan et al., 2017). Для sgRNA, нацеленной на EMX1, BLESS обнаружила 6 off-target сайтов, все из которых были включены в 10 подлинных off-target сайтов, обнаруженных BLISS. Аналогично, для sgRNA, нацеленной на VEGFA, помимо 16 сайтов off-target, которые были обнаружены обоими методами, BLISS выявил еще 27 сайтов off-target, которые не были обнаружены BLESS (Yan et al., 2017). Таким образом, чувствительность BLISS более чем в два раза выше, чем BLESS.
3.3 In vivo detection


Одним из основных применений системы CRISPR/Cas9 является редактирование соматических клеток для генной терапии in vivo. Методы прямого измерения внецелевых эффектов в тканях и даже в живых организмах будут иметь решающее значение для полной оценки безопасности препаратов для редактирования генов. В качестве примера можно привести методы Discover-seq (обнаружение in situ Cas off-targets и их проверка путем секвенирования) и GUIDE-tag (табл. 1).
Discover-seq использует MRE11, эндогенный белок репарации ДНК, для выявления CRISPR-Cas-индуцированных DSBs in vivo (Wienert et al., 2019). Во время реакции на повреждение ДНК MRE11 специфически прикрепляется к DSBs, которые можно обнаружить с помощью MRE11 ChIP-seq. Поскольку доступны хорошие антитела к MRE11 ChIP-класса и нет необходимости доставлять в организм какие-либо экзогенные компоненты, Discover-seq широко применим для различных типов образцов тканей или клеток (Wienert et al., 2019; Cromer et al., 2023). Однако, поскольку связывание MRE11-DSB является преходящим, Discover-seq фиксирует только те DSB, которые присутствуют в момент подготовки образца (Wienert et al., 2019). Поэтому чувствительность Discover-seq должна быть тщательно оценена, поскольку потенциально высок процент ложно-отрицательных результатов. В настоящее время не существует стандартизированного подхода для подтверждения чувствительности Discover-Seq. Потенциальным решением является использование нескольких ортогональных подходов для перекрестной валидации ложно-отрицательных результатов, чтобы убедиться, что чувствительность Discover-Seq достаточна для конкретного применения (рис. 1E).
GUIDE-tag - это недавно разработанный метод для обнаружения вне-целевых эффектов в культуре клеток и в тканях. GUIDE-tag был создан на основе GUIDE-seq, но с улучшенной системой захвата dsODN для увеличения частоты обнаружения DSBs (Liang et al., 2022). Более конкретно, мономерный стрептавидин (mSA) соединяется с нуклеазой Cas9, образуя рибонуклеопротеиновый комплекс Cas9-mSA/sgRNA в GUIDE-tag. Во время редактирования генома mSA рекрутирует биотинилированный dsODN, чтобы облегчить его интеграцию в DSBs через NHEJ (Liang et al., 2022) (рис. 1F). Чтобы сравнить чувствительность GUIDE-tag с Discover-seq, Shun-Qing et al. оценили in vivo GUIDE-tag в печени мыши на целевом сайте Pcsk9, который был ранее охарактеризован с помощью Discover-seq. Из 26 внецелевых сайтов, которые были первоначально обнаружены с помощью Discover-seq, GUIDE-tag успешно захватил 24. Кроме того, GUIDE-tag обнаруживает 16 новых вне-целевых сайтов, которые не были обнаружены с помощью Discover-seq (Liang et al., 2022). Таким образом, GUIDE-tag является более чувствительным методом, чем Discover-seq.
4 Strategies to reduce off-target effects
4.1 Cas9 improvement


Изучение механизмов функционирования прототипа SpCas9 (Streptococcus pyogenes Cas9) позволило получить критические сведения о структурной основе off-target эффектов (Hsu et al., 2013). Основываясь на этой информации, ученые предположили, что надежность SpCas9 можно повысить, уменьшив неспецифическое связывание Cas9/sgRNA с ДНК, особенно с нецелевой нитью ДНК. Эта идея привела к рациональному конструированию мутантов SpCas9, таких как улучшенный SpCas9 (eSpCas9) и SpCas9-HF1 (HF1 - вариант высокой верности №1). Дальнейший анализ структуры белков eSpCas9 и SpCas9-HF1 показал наличие механизма коррекции, который удерживает эти мутанты в неактивном состоянии при связывании с несовпадающими мишенями. Соответственно, ученые сконструировали hypaCas9 (гиперточный Cas9) (Chen et al., 2017), который демонстрирует более высокую активность на мишени и меньшие эффекты вне мишени, чем eSpCas9 и SpCas9-HF1 (Kleinstiver et al., 2016; Slaymaker et al., 2016; Chen et al., 2017).
Чтобы сравнить надежность вышеупомянутых производных Cas9, созданных методом рациональной инженерии, ученые сравнили как активность этих мутантов на целевых сайтах, так и количество детектируемых вне-целевых сайтов с использованием ранее зарегистрированных sgRNA. Janice S et al. показали, что eSpCas9, SpCas9-HF1 и hypaCas9 сохранили высокую активность на целевых участках (более 70% от SpCas9 дикого типа) на 23/24, 18/24 и 19/24 тестируемых участках, соответственно. Кроме того, результаты GUIDE-seq продемонстрировали значительное снижение числа сайтов, не являющихся мишенями. Например, среди 134 сайтов off-target одной sgRNA, нацеленной на VEGFA с помощью SpCas9, только 19, 24 и 18 сайтов off-target также обнаруживаются с помощью eSpCas9, SpCas9-HF1 и hypaCas9, соответственно (Chen et al., 2017).
Варианты SpCas9 с повышенной специфичностью также могут быть разработаны с помощью непредвзятого высокопроизводительного скрининга. Хорошим примером является дрожжевой скрининг мутантов SpCas9 со случайными мутациями в домене REC3 (REC означает "распознавание"), критическом домене Cas9, который отвечает за сопряжение между геномной ДНК и комплексом Cas9/sgRNA. Этот скрининг выявил четыре ключевые выгодные точечные мутации в SpCas9, что привело к появлению evoCas9, варианта, который демонстрирует верность, превосходящую SpCas9-HF1 и eSpCas9 (Kleinstiver et al., 2015; Casini et al., 2018). Antonio et al. провели GUIDE-seq для прямого сравнения off-target эффектов evoCas9, SpCas9-HF1 и eSpCas9 по сравнению с SpCas9 дикого типа. Они обнаружили, что количество off-target сайтов уменьшилось на 98,7 %, 95,4 % и 94,1 %, соответственно. При этом абсолютная on-target активность этих мутантов Cas9 не была резко снижена по сравнению с SpCas9 (Casini et al., 2018).
Помимо белковой инженерии, специфичность редактирования CRISPR/Cas9 можно повысить с помощью парных nickases SpCas9 (Frock et al., 2015). Никазы Cas9 - это мутировавшие нуклеазы Cas9, которые разрезают только одну нить ДНК. Когда две sgRNA сконструированы таким образом, чтобы одновременно разрезать две противоположные нити ДНК на небольшом расстоянии, можно создать DSBs с заметно меньшим эффектом off-target (Hsu et al., 2013; Frock et al., 2015). Основным недостатком этой стратегии является сложность идентификации двух правильно расположенных sgRNA на целевом геномном участке, учитывая ограничение PAM-последовательностей.
Эффект off-target также может быть уменьшен путем открытия новых гомологов Cas9, которые используют более редкие PAM-последовательности, тем самым демонстрируя меньшую вероятность соединения с нецелевой геномной ДНК. Например, в отличие от SpCas9, которая использует относительно распространенный PAM 5'-NGG-3', SaCas9, полученная из Staphylococcus aureus, требует более сложной PAM-последовательности 5'-NGGRRT-3' (Kumar et al., 2018). Аналогично, St1Cas9 и St3Cas9 из Streptococcus thermophilus распознают более длинные PAM-последовательности - 5'-NNAGAAW-3' и 5'-NGGNG-3', соответственно (Muller et al., 2016). Помимо повышенной специфичности, эти гомологи Cas9 также дают возможность нацеливаться на геномные участки, которые иначе не редактируются SpCas9. Однако следует отметить, что использование гомолога Cas9 с редким PAM приводит к тому, что многие последовательности перестают быть целевыми (табл. 2).

Table 2 Strategies to reduce off-target effects.

4.2 sgRNA improvement


Помимо белка Cas9, для повышения точности редактирования генома можно использовать sgRNA. В первую очередь, последовательность sgRNA является решающим фактором, влияющим на эффективность воздействия на цель и вне цели. Различные sgRNA, нацеленные на один и тот же локус гена, могут иметь разные результаты, поэтому важно провести скрининг подходящей sgRNA для интересующего локуса гена перед дальнейшим экспериментом (Doench et al., 2016). Помимо влияния последовательностей sgRNA накопленные данные показали, что специфичность активности Cas9 может быть повышена путем удлинения или усечения sgRNA (Cho et al., 2014; Fu et al., 2014; Kim et al., 2016; Kim et al., 2017; Liang et al., 2019). При удлинении sgRNA на 5' конце sgRNA обычно добавляют два гуаниновых нуклеотида (так называемые 5'-GGX20) (Cho et al., 2014). Эти дополнительные гуаниновые нуклеотиды благоприятствуют транскрипции, управляемой T7-промотором, и могут препятствовать взаимодействию между комплексом Cas9/sgRNA и ДНК в сайтах off-target (Cho et al., 2014; Kim et al., 2019). С другой стороны, усечение sgRNA на 2-3 п.н. на 5' конце, как сообщается, также снижает эффект off-target, сохраняя эффективность редактирования on-target (Fu et al., 2014). Еще большее снижение нежелательного мутагенеза достигается, когда усеченные sgRNA применяются к парным nickases Cas9 (Cho et al., 2014).
Помимо изменения длины sgRNA, химические модификации sgRNA также могут влиять на их off-target эффект. В одном из исследований в рибозо-фосфатную основу sgRNA был включен 2'-O-метил-3'-фосфоноацетат (MP), и было обнаружено, что модификации MP в определенных положениях могут повышать специфичность on-target и одновременно резко снижать off-target активность (Ryan et al., 2018). Включение в состав sgRNA мостиковых нуклеиновых кислот (2',4'-BNANC [N-Me]) или блокированных нуклеиновых кислот (LNA) также снижает кинетику реактивности нуклеазы Cas9, тем самым повышая специфичность редактирования генома (Cromwell et al., 2018). Замена рибонуклеотидов на дезоксирибонуклеотиды также снижает вне-целевые эффекты (Yin et al., 2018). Основным недостатком стратегий модификации sgRNA является то, что в настоящее время они ограничены приложениями для редактирования генома, в которых используются синтетические РНК, но не трансгены на основе ДНК (Таблица 2).
4.3 DSB-independent gene editing


Cas9-опосредованная генерация DSB является основным источником off-target эффекта CRISPR/Cas9. Поэтому новые версии редакторов генов, которые не создают DSB, обычно демонстрируют большую специфичность редактирования генома. Одним из таких инструментов являются редакторы оснований, которые объединяют никазы Cas9 с нуклеотидными деаминазами для достижения однонуклеотидных преобразований без создания DSBs. Наиболее популярными редакторами оснований являются редактор адениновых оснований (ABE) и редактор цитозиновых оснований (CBE). ABE катализирует редактирование аденина в гуанин, а CBE преобразует цитозин в тимин (Komor et al., 2016; Gaudelli et al., 2017; Wu et al., 2022).
Хотя CBE и ABE значительно снижают классические off-target эффекты систем CRISPR/Cas9, они создают новые форматы off-target эффектов, такие как редактирование РНК и sgRNA-независимое редактирование ДНК (Grunewald et al., 2019; Jin et al., 2019; Zhou et al., 2019; Zuo et al., 2019). Эти эффекты, вероятно, вызваны чрезмерной активностью деаминазы, которая не ограничивается связыванием Cas9/sgRNA с соответствующими геномными локусами. Эффекты РНК вне мишени могут быть обнаружены с помощью RNA-seq (Grunewald et al., 2019; Zhou et al., 2019) и, как полагают, являются преходящими, учитывая короткое время жизни РНК. Независимое от sgRNA редактирование ДНК, вероятно, происходит в локусах, где ДНК разматывается в R-петлю, поэтому одноцепочечная геномная ДНК подвергается воздействию деаминаз (Jin et al., 2020; Richter et al., 2020).
Недавнее развитие EndoV-seq и Detect-seq значительно облегчило обнаружение внецелевого воздействия ABE и CBE на геномную ДНК. EndoV-seq использует эндонуклеазу V (EndoV) для специфического разрезания инозина в ДНК (Liang et al., 2019). Поскольку инозин - это промежуточный нуклеозид, образующийся при ABE, EndoV может специфически разрезать локусы ДНК, которые редактируются ABE. Такие разрезы ДНК можно обнаружить с помощью секвенирования, используя экспериментальную платформу, аналогичную Digenome-seq (Liang et al., 2019). Подобно EndoV-seq, Detect-seq измеряет внецелевые эффекты CBE, отслеживая промежуточные продукты реакции (Lei et al., 2021). Более конкретно, Detect-seq химически маркирует дезоксиуридин, продукт деаминирования цитозина, и обогащает редактируемые CBE геномные локусы с помощью биотин-стрептавидинового вытягивания для глубокого анализа секвенирования (Lei et al., 2021).
В дополнение к редакторам оснований, CRISPR/Cas9-опосредованные внецелевые эффекты также могут быть уменьшены с помощью эпигенетических редакторов (Willyard, 2017). Эти инструменты используют ферментативно мертвый Cas9 (dCas9) белок, чтобы направить эпигенетическую модуляцию на целевые гены, тем самым изменяя их эндогенный уровень экспрессии. Преимущество эпигенетических редакторов заключается в том, что они полностью исключают необратимые изменения в ДНК. Однако эпигенетические редакторы потенциально могут оказывать вне-целевое воздействие на уровне эпигенома (Willyard, 2017), что должно быть тщательно оценено с помощью анализа ChIP-seq.
4.4 Delivery method improvement


Активность и точность редактирования генов в значительной степени зависит от уровня экспрессии и продолжительности действия редакторов в клетках. Поэтому методы доставки Cas9/sgRNA в клетки-мишени существенно влияют на ее вне-целевой эффект (Lohia et al., 2022; Taha et al., 2022). В клеточных культурах Cas9/sgRNA могут доставляться путем трансфекции плазмид, электропорации рибонуклеопротеидов (очищенный комплекс Cas9/sgRNA RNP) или вирусной трансдукции. Электропорация RNP демонстрирует более высокую эффективность редактирования по мишени и меньшее количество мутаций вне мишени, чем другие методы доставки (Kim et al., 2014; Ramakrishna et al., 2014). Подобно электропорации РНП, мРНК и sgRNA Cas9 также могут быть доставлены в клетки с помощью электропорации или векторов на основе липосом (Evers et al., 2022; Yu et al., 2023) для повышения точности редактирования генома. Смысл всех этих методов заключается в достижении переходного пика экспрессии CRISPR/Cas9 с последующей быстрой сменой этих редакторов, чтобы избежать внецелевых эффектов из-за длительной экспрессии редактора.
Продолжительность экспрессии редакторов генома также влияет на выбор векторов для редактирования генома in vivo. Например, адено-ассоциированный вирус (AAV) и липидные наночастицы (LNPs) в настоящее время являются основными векторами для генной терапии in vivo. Известно, что экспрессия генов, доставленных с помощью AAV, может длиться годами в окончательно дифференцированных типах клеток (Lu et al., 2019). Хотя это свойство может быть предпочтительным в приложениях для дополнения генов, AAV-опосредованное редактирование генов, вероятно, проявляет склонность к накоплению нежелательных вне-целевых мутаций с течением времени (Hanlon et al., 2019; Kim et al., 2019). В отличие от этого, доставленные с помощью LNP мРНК Cas9 и sgRNA могут быть быстро деградированы in vivo, поэтому LNP в настоящее время является наиболее популярным вектором для редактирования генов in vivo (Zuris et al., 2015; Wang et al., 2016b; Finn et al., 2018; Qiu et al, 2021; Ju et al., 2022; Ghani et al., 2023), что уже привело к появлению новых исследуемых препаратов в клинических испытаниях (NCT04601051) (Niemietz et al., 2020; Witzigmann et al., 2020; Gillmore et al., 2021) (Таблица 2).
5 Conclusive remarks


Эффективность и специфичность - два критических параметра, определяющих успех редактирования генома с помощью CRISPR/Cas9. Огромный потенциал редактирования генома для генной терапии требует от ученых всестороннего рассмотрения вопросов безопасности, в частности, вне-целевых эффектов. Методы оценки вне-целевых эффектов CRISPR/Cas9 быстро развивались в последнее десятилетие. Однако до сих пор сохраняются ограничения в соотношении точности и чувствительности этих новых методов. Прямая оценка off-target эффектов in vivo и даже у пациентов является особенно сложной. Разработка решений этих проблем приведет к появлению инструментов редактирования генома нового поколения, которые ускорят наступление эры генной терапии.