The Wonderfully Shrunken Cas13
 The Scientist Nov 7, 2023 | |
|---|---|
|
Scientists removed unnecessary sections of the Cas13 enzyme, creating a mini-enzyme that works and fits with other CRISPR elements into a single gene therapy vector. |
CRISPR-Cas открывает большие перспективы для лечения и терапии заболеваний человека. Один из немногих способов, с помощью которого ученые могут внедрить элементы CRISPR в большое количество клеток млекопитающих, - это адено-ассоциированный вирусный вектор (AAV). Эти векторы невелики, поэтому втиснуть в один вектор большой ген фермента Cas, его промоторы, сигнал полиаденилирования, гены направляющих РНК и другие необходимые компоненты довольно сложно; разделение компонентов на два вектора может создать проблемные дозы или снизить эффективность.
Один из способов уместить все это в одном векторе AAV - уменьшить большой ген фермента Cas. В новой работе, опубликованной в журнале Nature Communications, генетик Zhanjun Li и его команда из Цзилиньского университета миниатюризировали фермент Cas13d, вырезав ненужные фрагменты, а затем с помощью платформы искусственного интеллекта AlphaFold2 визуализировали структуру других белков Cas13d и Cas13b и миниатюризировали их.1 Они обнаружили, что эти мини-ферменты работают так же хорошо, как ферменты дикого типа.
"Существует не так много примеров белков, которые можно уменьшить до меньших размеров и заставить их работать", - сказал Jeffrey Chamberlain, генетик из Вашингтонского университета, не принимавший участия в исследовании. "Это может иметь огромное значение с точки зрения упрощения редактирования генов с помощью этих средств доставки AAV".
В прошлом исследователи искали и находили естественные белки Cas меньшего размера, но они не всегда работали так же хорошо, как полноразмерные Cas.2 Они также разработали другие методы миниатюризации, но они изменяли функцию. Эффективного, обобщенного метода уменьшения размеров белков Cas пока не разработано.
Li и его коллеги использовали стратегию, которую они назвали "Interaction, Dynamics, and Conservation (IDC), чтобы найти участки фермента Cas13d, которые не являются необходимыми для его работы. (Cas13 - один из многих ферментов Cas, используемых в CRISPR, но он нацелен на РНК, а не на ДНК, как Cas9).
Сначала они рассмотрели один из примеров белка Cas13d под названием EsCas13d. Предыдущие исследования позволили определить кристаллическую структуру этого белка с помощью крио-ЭМ, поэтому команда использовала стратегию IDC для изучения взаимодействий между функциональными сайтами фермента EsCas13d, конформационных изменений, происходящих при выполнении ферментом своих функций, и структурных единиц, которые являются консервативными и обобщенными.3 Исследователи выбрали восемь участков аминокислотной цепи, которые, по их предположению, не были необходимы для его функционирования, и удалили их, создав мини-EsCas13d.
Затем они использовали AlphaFold для предсказания структуры двух других членов Cas13d, RfxCas13d и RspCas13d, на основе их аминокислотных цепочек. Они обнаружили, что их структуры похожи (с некоторыми ключевыми различиями) на структуру EsCas13d, поэтому они решили миниатюризировать их таким же образом.
Li обнаружил, что каждый мини-Cas13d разрушает РНК различных генов в линии клеток HEK293 примерно с той же эффективностью и с той же оптимальной длиной спейсера, устойчивостью к рассогласованиям и внецелевым эффектам, что и ферменты дикого типа. Вестерн-блот анализ показал, что дикий тип и mini-13ds также демонстрируют схожие уровни белка в клетках. Затем команда попробовала миниатюризировать Cas13b, используя AlphaFold2 и стратегию IDC, и создала два мини-варианта с 12 удаленными участками, каждый из которых обеспечивал такое же количество целевой деградации РНК, как и их аналоги дикого типа.
Чтобы проверить, работают ли мини-ферменты в естественных условиях, Li и его команда выбрали в качестве мишени мышиную пропротеинконвертазу субтилизин/кексин типа 9 (Pcsk9), которая повышает уровень холестерина в крови. Они ввели плазмиду mini-RfxCas13d AAV, содержащую кРНК, нацеленные на кодирующую последовательность мРНК Pcsk9, в хвостовую вену 8-недельных мышей. Уровень мРНК Pcsk9 значительно снизился у введенных мышей, и уровень белка также снизился. "Эти небольшие белки проявили полную активность, аналогичную активности фермента дикого типа, а уровень общего холестерина в сыворотке крови у мышей, которым вводили AAV, снизился до 61%+8,3% от нормального уровня", - подтвердил Ли в своем электронном письме. Показатели повреждения печени были в норме, а сама печень выглядела здоровой".
"Следующий план - разработать более разумные белки, которые будут содержать не только миниатюризацию, но и добавление, замену и мутации, чтобы получить высокоточные, сверхточные и высокоэффективные Cas-белки", - говорит Ли.
"Самое приятное в этом то, что они используют искусственный интеллект и всевозможные обучаемые функции, чтобы действительно анализировать структуру белка в огромных деталях", - говорит Chamberlain. "Я надеюсь, что подобная работа может быть применена и к некоторым другим Cas, таким как Cas9, который является более распространенным ферментом для редактирования генов, ориентированным скорее на ДНК, чем на РНК". Cas13d.
REFERENCES |