Здесь мы используем клинический метод секвенирования следующего поколения (NGS) для достижения глубины секвенирования и обнаружения вариантов с ультранизкой частотой в экзонах генов, связанных с раком, аллексонами и геномом в целом. В трех отдельных первичных донорских человеческих гемопоэтических стволовых и клетках предшественниках (HSPC), оцененных в технических трех экземплярах, мы ввели белок Cas9 с высокой чувствительностью к трем локусам (AAVS1, HBB и ZFPM2) и собрали геномную ДНК на 4 и 10 день. Наши результаты демонстрируют, что клинически значимая доставка Cas9 высокого качества в первичные HSPCs и культуру ex vivo до 10 дней не приводит к появлению или обогащению канцерогенными вариантами и что даже один SNP в спейсерной последовательности gRNA является достаточным для устранения вне-целевой активности Cas9 в первичных человеческих HSPCs, способных к репарации. Система CRISPR, состоящая из белка CRISPR/Cas, соединенного с (наводящей) guide RNA (gRNA), продемонстрировала удивительную универсальность для локального редактирования генома. Для обеспечения безопасного клинического применения CRISPR-систем для редактирования генома вставкой и делецией (indels) должны происходить только в предполагаемом геномном сайте без вне-целевых эффектов, через пути негомологичного соединения концов (NHEJ) или с помощью гомологичной направленной репарации (HDR). Непреднамеренное редактирование генома может происходить при использовании ферментов Cas с низкой чувствительностью или когда gRNA направляет расщепление на последовательности, похожие на последовательность-мишени, что приводит к возникновению мутаций вне мишени, которые могут иметь онкогенные или другие неблагоприятные последствия. Определение генотоксичности методов редактирования генома остается основополагающим для безопасного клинического применения.

Несколько недавних сообщений показали, что двунитевые разрывы ДНК (DSBs), вызванные Cas9, инициируют ответ p53 в плюрипотентных и раковых клеточных линиях, что приводит к остановке клеточного цикла и/или апоптозу^1,2. Поскольку клетки с потерявшими функцию мутациями в р53 не страдают от такой же степени токсичности после редактирования генома и могут проходить клеточный цикл с не-устранёнными DSB, эти исследования позволили предположить, что Cas9-опосредованное расщепление может обогащать мутации р53. Однако выводы этих исследований зависят от наличия мутаций р53 в исходном пуле клеток до (а не в результате) доставки Cas9, чего нельзя ожидать в первичных клетках, полученных от здоровых доноров.

Эти исследования также проводились на иммортализованных клеточных линиях, которые обычно имеют грубые хромосомные аномалии (полиплоидия, анеуплоидия, транслокации и т.д.) с нефункциональными реакциями на повреждение ДНК и доставку нуклеиновых кислот, и использовали стабильную экспрессию Cas9, которая способствует длительному клеточному стрессу^3-5. Таким образом, значительные усилия были направлены не только на априорное предсказание возможных вне-целевых геномных координат^6-8, но и на разработку эмпирических лабораторных методов обнаружения участков вне-целевой активности после редактирования генома^9-13. Хотя эти экспериментальные методы сообщают об активности во многих сайтах-кандидатах, которые могут быть пропущены методами предсказания in silico, остается опасение, что такие методы отличаются от клинических протоколов доставки Cas9, поскольку эти методы обычно включают в себя конститутивную экспрессию Cas9 дикого типа в иммортализованных клеточных линиях или доставку Cas9 во вне клеток геномную ДНК (gDNA). Таким образом, методы, используемые в лабораториях, могут иметь высокий уровень ложных положительных результатов.

Важность долгосрочной безопасности редактирования генома/генотерапии в клинике была недавно проиллюстрирована, когда два испытания генотерапии серповидно-клеточной болезни (NCT02140554 и NCT04293185) были приостановлены после того, как у двух пациентов развились миелоидные злокачественные опухоли в результате либо цитотоксической химиотерапии, либо инсерционного мутагенеза лентивирусного вектора¹⁵. В связи с этими проблемами безопасности, в данном исследовании мы попытались определить, появляются ли онкогенные варианты во время редактирования Cas9 и/или в результате работы по экспансии ex vivo. Идеальная методология требует сверхглубокого секвенирования, поскольку мутации с вариабельной частотой аллелей (VAF) менее 1% остаются не обнаруженными большинством геномных методов обнаружения эффектов вне мишени. Отчасти это объясняется тем, что сигнатура активности нуклеазы Cas9 представляет собой спектр indels, а не преимущественно однонуклеотидных вариантов (SNV). Поэтому сверхглубокое секвенирование, способное выявлять SNVs, а также indels, амплификации и многонуклеотидные варианты (MNVs), может значительно повысить чувствительность для выявления всего спектра онкогенной вне-целевой активности редактирования с 1% до менее 0,1% VAF, что необходимо для выявления низкочастотных вариантов, которые могут инициировать патогенную клональную экспансию. Чтобы достичь такой высокой чувствительности для клинического применения, мы разработали технологию NGS, которая позволяет идентифицировать низкочастотные события в наиболее важных геномных регионах для оценки генотоксичности с высоким риском: экзоны генов, связанных с раком, которые регулярно проверяются на мутации в существующих клинических онкологических программах. Мы не нашли доказательств того, что клиническое геномное редактирование Cas9 ex vivo у нескольких первичных доноров гемопоэтических стволовых и клеток предшественников (HSPC) в трех отдельных геномных локусах вносит или обогащает онкогенные мутации. Эти результаты были подтверждены с помощью секвенирования целого экзома (WES) и секвенирования целого генома (WGS) при нацеливании на AAVS1. Мы разработали метод, адаптированный к существующей клинико-онкологической NGS-диагностике, который может быть использован для оценки безопасности существующих инструментов редактирования генома и инструментов нового поколения, протоколов ex vivo культуры и продуктов на основе клеток до их клинического применения. Для сверхглубокого секвенирования опухолевых супрессоров и онкогенов мы использовали анализ NGS с гибридным захватом для обнаружения изменений ДНК на большой глубине в экзонах 523 генов, имеющих отношение к раку (охватывающих 1,94 Mbof DNA), с использованием уникальных молекулярных индексов (с использованием набора TruSight Oncology 500)¹⁶. Эти 523 гена включают известные онкогены в ключевых руководствах наиболее распространенных типов рака, а также множество повторяющихся генов, которые часто мутируют при раке и находятся в стадии клинического исследования, начиная от не-мелкоклеточного рака легких до аденокарциномы поджелудочной железы (дополнительная таблица 1). Предыдущие работы показали высокую степень согласия (как положительного, так и отрицательного) между панелью TSO500 и секвенированием всего экзома (WES) для измерения мутационного бремени (не-синонимичные мутации на килобазу ДНК)¹⁶. Поскольку эта панель основана на генетике рака человека и не была создана на заказ в соответствии с дизайном gRNA, она является объективной по отношению к процессу редактирования генома и фокусируется на регионах генома с наибольшим риском с точки зрения оценки потенциальной онкогенности стратегии редактирования генома. Коммерческая доступность панели TSO500 также делает ее пригодной для более широкого сообщества специалистов по редактированию генома и, особенно, для клинических лабораторий. HSPC от трех отдельных здоровых доноров были подвергнуты воздействию четырех условий: Макетная электропорация, а также три различные обработки Cas9 с gRNA, нацеленными на сайты в AAVS1, HBB или ZFPM2 (рис. 1a; дополнительная таблица 2). Активность Cas9 в AAVS1 и HBB подробно описана в литературе, и эти сайты были выбраны из-за их относительно высокой и низкой вне-целевой активности, соответственно^10,11.Примечательно, что используемая здесь gRNA HBB в настоящее время проходит I фазу клинических испытаний для коррекции единственного SNP, ответственного за серповидно-клеточную болезнь^17,18. В качестве положительного контроля, который, как мы ожидали, вызовет вне-целевую активность в панели TSO500, мы разработали gRNA, нацеленную на интрон 3 ZFPM2, который имеет предсказуемый вне-целевой сайт в экзоне 5 EZH2. Этот вне-целевой сайт различается на один нуклеотид в позиции 1 спейсерной последовательности - участок, наиболее удаленный от PAM, который имеет наименьшее влияние на специфичность Cas9 (рис. 1b), и обладает самым высоким рейтингом среди вне-целевых сайтов для ZFPM2 в COSMID6. EZH2 был выбран в качестве соответствующего положительного контроля из-за его хорошо изученной роли в широком спектре типов опухолей^19,20 и значимости мутаций с потерей и усилением функции при миелодисплазиях^21-24, что делает его особенно важным для редактирования HSPC. Методология, использованная для оценки активности Cas9 после редактирования генома, была адаптирована из клинической работы по обработке тканей в формалине и парафине (FFPE) для получения геномной (gDNA), собранной из первичных CD34⁺-пуриновых HSPC, полученных из пуповинной крови трех разных здоровых доноров. Замороженные клетки оттаивали и размножали в течение 2 дней в среде для HSPC при 100 К клеток/мл, а затем использовали на четырх группах лечения (2-5 х 10⁵ клеток на группу лечения)

Рис. 1 | Схема эксперимента и оценка целевой активности.

Мы собрали 4х10⁵ клеток из каждой группы лечения на 4 день и выделили gDNA для анализа. Чтобы определить, происходило ли обогащение опухолеродных вариантов в наших ex vivo-расширенных популяциях HSPC, а также для того, чтобы понять, обогащало ли само ex vivo-расширение (независимо от активности Cas9) опухолеродные варианты, мы также собрали gDNA из оставшихся клеток через 10 дней после таргетинга. Для того чтобы убедиться в высоком уровне целевой активности каждой gRNA мы провели направленную ПЦР-амплификацию геномных областей вокруг предсказанного сайта разрезания с последующим секвенированием по Сэнгеру и анализом indels с помощью TIDE²⁷. Высокая частота нацеленных indels наблюдалась у всех трех доноров для gRNA AAVS1 и HBB (рис. 1c). Хотя gRNA ZFPM2 была одинаковой у всех доноров, она индуцировала меньше indels, что было ожидаемо из-за ее высокой степени предсказанной вне-целевой активности, а также из-за того, что эта gRNA не была проверена на эффективность. Сначала были проведены пилотные эксперименты, чтобы убедиться, что система TSO500 может быть адаптирована для работы с тканями, полученными из FFPE, и с gDNA, собранной из первичных клеток. Чтобы определить оптимальное количество ДНК для использования в программе секвенирования, в качестве исходного материала для подготовки библиотеки с помощью набора для подготовки библиотеки TSO500 на основе гибридного захвата использовали 10-30ng of input ДНК. Чтения были сопоставлены с геномом человека (сборка hg19), а необработанные данные секвенирования были обработаны с помощью специального биоинформационного конвейера (Дополнительный рисунок 1A) для выявления indels, SNVs и MNVs. Пилотные эксперименты показали успешную адаптацию программы секвенирования к gDNA, собранной из первичных клеток в культуре, и что для достижения медианного покрытия экзонов (MEC) 2000 необходимо не менее 30ng исходной ДНК (Дополнительный рис. 1B). Для одновременного обнаружения предполагаемых ошибок мы дополнили панель TSO500 зондами, специфичными для областей, на которые направлены gRNA AAVS1, HBB и ZFPM2 (дополнительная таблица 3). После первых пилотных экспериментов необработанные данные секвенирования дали среднее значение MEC более 3550 для всех образцов в каждой технической копии, что соответствует минимальному пределу обнаружения (LoD) и чувствительности 0,205% и 95%, соответственно (рис. 2а; дополнительный рис. 2). Более того, поскольку три технических реплики были секвенированы почти для всех временных точек и условий, которые учитываются в среднем MEC более 3550, наш LoD в этих образцах был еще больше снижен до предела менее 0,07% VAF. Варианты были согласованы в технических репликах с точки зрения типов названных вариантов, без значимых различий при сравнении обработок Mock и Cas9 (Дополнительный рис. 3). Мы также наблюдали высокую степень согласованности между техническими репликами: медиана составила 98,31% вариантов, названных во всех репликах для каждого донора (рис. 2b; дополнительная таблица 4). Эти данные показывают, что общее количество вариантов в репликах в большей степени зависело от донора, чем от времени в культуре или обработки Cas9. Кроме того, количество вариантов в каждом доноре не увеличивалось в зависимости от времени в культуре (т.е. день 0, день 4, день 10) или обработки Cas9. В соответствии с этими результатами мы обнаружили, что глубина чтения по всему геному в большей степени зависела от донора, чем от любого другого фактора (Дополнительный рис. 4). Кроме того, хотя хромотрипсис, как сообщалось ранее, является редким следствием целевого расщепления Cas9²⁸ , мы не обнаружили явного снижения глубины чтения в нашей основной популяции HSPC в вариантах, расположенных ближе к предполагаемому месту разрезания при любой обработке Cas9. Чтобы получить представление о характеристиках вариантов, идентифицированных в нашей когорте, мы построили график VAF по MEC для образцов Mock в дни 0, 4 и 10 (Дополнительный рис. 5A). Примечательно, что для всех доноров во всех временных точках частота VAF по мере увеличения MEC стремилась к 0,5 и 1,0, что соответствует гетерозиготным и гомозиготным вариантам зародышевой линии, соответственно. Поскольку все варианты были найдены в панели опухолевых супрессоров и онкогенов, а все HSPC были получены от нормальных, здоровых доноров, мы ожидали, что практически все варианты, идентифицированные в условиях "День 0" и "Макет", будут непатогенными. Действительно, при исключении синонимичных вариантов, а также тех, которые, как сообщалось ранее, встречаются более 10 раз в обширных базах данных зародышевой линии^29,30, осталась лишь горстка вариантов (в среднем 3,9 варианта из 1490,1 воспроизводимых вариантов на условие). Опять же, мы не обнаружили последовательного увеличения числа вариантов по мере культивирования HSPC с d0 по d10. Интересно, что мы наблюдали несколько последовательных вариантов, которые, хотя и присутствовали в нашей базе данных зародышевой линии и, следовательно, были литерированы, были обнаружены при промежуточных VAF, а не стремились к 0,5 или 1,0. Хотя эти варианты были последовательными в пределах доноров, но не между ними, ни один из них не был найден в экзонах генов, связанных с клональным кроветворением неопределенного потенциала^31,32 (примечание: возраст доноров для источника HSPCs неизвестен). Поэтому мы считаем, что эти мутации представляют собой либо артефакты секвенирования, либо добросовестный химеризм донорских HSPC, произошедший до оплодотворения культуры ex vivo. Чтобы определить, вносит ли редактирование с помощью Cas9 варианты в супрессоры опухоли или онкогены, мы построили график VAF x MEC для всех групп обработки Cas9 на 4 и 10 дни для всех трех доноров (рис. 2c; дополнительный рис. 5B). Опять же, как и ожидалось для гетерозиготных и гомозиготных зародышевых мутаций, не подвергшиеся отсеиванию варианты имели тенденцию к увеличению VAF на 0,5 и 1,0 по мере увеличения MEC. Далее мы отсеяли непатогенные варианты, исключив все названные мутации, которые являются синонимами и/или были ранее зарегистрированы в базе данных зародышевых вариантов. Мы обнаружили, что при обработке Cas9 осталось меньше вариантов, чем при обработке Mock (в среднем 3,3 варианта из 1487,9 воспроизводимых вариантов на условия). Поскольку все варианты, найденные в образцах Mock, не были внесены Cas9, мы удалили их для последующего анализа (рис. 3a). Из восемнадцати обработок Cas9 только шесть вариантов остались после altering, и четыре из них были ожидаемыми мутациями EZH2 в донорах 2 и 3 как на 4-й, так и на 10-й день обработки ZFPM2. Два других варианта, оставшиеся после удаления зародышевых, синонимичных и Mock-мутаций, были SNV, обнаруженными при лечении ZFPM2 на 10 день у доноров 2 и 3 с VAF менее 0,0015, что соответствует нашему пределу обнаружения. Важно отметить, что, хотя в наших группах обработки осталось только шесть вариантов, фильтры, которые мы применяли для условий Cas9, были достаточно подходящими. Поскольку Cas9 вызывает indels гораздо чаще, чем SNV в сайтах, которые демонстрируют гомологию с gRNA, если бы мы применили дополнительные alters к нашим вариантам (то есть, В донорах 2 и 3 ожидаемый сайт вне мишени EZH2 показал самый высокий VAF в точках d4 и d10 во всех трех репликах с высокой степенью достоверности (покрытие 3,893x) при средней активности вне мишени 19,3% (рис. 3a). Интересно, что VAF EZH2 у этих доноров уменьшался с 4-го по 10-й день (в среднем от 21,7% до 16,9% соответственно), что, возможно, является результатом селективного недостатка клеток с indels в этом гене. Спектр indels в EZH2 был охарактеризован (Дополнительный рис. 6), а общая частота была определена с помощью ПЦР-амплификации, секвенирования по Сэнгеру и анализа indels с помощью TIDE (рис. 3б). Примечательно, что даже без отсеивания Mock-вариантов, мутации в EZH2 составили большинство вызовов при обработке gRNA Cas9+ZFPM2 у доноров 2 и 3 (рис. 3c; дополнительный рис. 7). Удивительно, но мы не обнаружили присутствия вне-целевой активности в EZH2 в доноре 1 ни с помощью NGS, ни с помощью TIDE (рис. 3b), несмотря статью https://doi.org/10.1038/s41467-022-32233-zNature Communications | (2022) 13:4724

При исследовании трассы Сэнгера этого сайта в доноре 1 мы обнаружили гомозиготный SNP в позиции 6 спейсерной последовательности (рис. 3d). В связи с тем, что специфичность Cas9 с высокой деликатностью, которая, как сообщалось, достоверно снижает вне-целевую активность в 20 раз¹⁴ , вполне вероятно, что этот гомозиготный SNP устранил всю активность в этом сайте (ниже порога обнаружения панели TSO500). Исключительная специфичность Cas9-протеина высокой степени защиты при транзиторной доставке в первичные клетки подтверждается единственным SNP за пределами основной области спейсерной последовательности у донора 1, который был достаточен для устранения всей детектируемой активности в этом сайте. Секвенирование целого экзома подтверждает отсутствие вне-целевой активности в этом сайте. Поскольку транзиторная доставка РНК Cas9 и 10-дневная культура ex vivo привели к появлению небольшого количества вариантов в панели TSO500, мы попытались расширить поиск вне-целевой активности на весь экзом. Для этого мы ввели электропорацию Cas9 с высокой чувствительностью, предварительно объединенного с AAVS1 gRNA, одному донору HSPC. Мы использовали gRNA AAVS1, поскольку она описана как более специфичная, чем gRNA HBB, и мы хотели увеличить шансы на обнаружение любого экзонного сайта вне мишени. Затем мы собрали gDNA из AAVS1-мишеней и макета электропорации на 10 пост-редактировании и подвергли оба образца захвату экзома

Fig. 2 | Summary of TSO500 sequencing data.

Это позволило достичь высокой глубины чтения в целевых регионах; средний охват выравнивания составил 1988 и 2054 для процедур AAVS1 и Mock, соответственно (дополнительная таблица 5). До начала обработки мы идентифицировали 38 431 и 38 527 вариантов в препаратах Mock и AAVS1, соответственно (рис. 4a). Для выявления вариантов, которые могли возникнуть в результате лечения Cas9, использовался конвейер "опухоль-норма" для выделения вариантов, характерных только для лечения AAVS1 ("опухоль") после вычитания фонового варианта Mock ("норма"). Кроме того, мы выявили ZFPM2 OT101020 30% инделов bEZH2

Fig. 3 | Варианты, идентифицированные при обработке Cas9. Fig. 4 | Variants identified by whole-exome sequencing.

При построении графика зависимости VAF от глубины покрытия мы заметили, что практически все варианты с высоким VAF были обнаружены при низкой глубине чтения, что указывает на то, что это, скорее всего, не настоящие варианты, уникальные для лечения AAVS1, а варианты зародышевой линии, которые не были секвенированы на достаточную глубину, чтобы быть обнаруженными и в макетном образце. Эта гипотеза была подтверждена построением графика соотношения охвата в AAVS1 и охвата в макетной выборке для всех выявленных вариантов, что выявило линейную корреляцию между охватом в макетной и AAVS1 выборках (т.е. варианты с высоким VAF и низким охватом в AAVS1 выборке, вероятно, были обнаружены при низкой глубине чтения и в макетной выборке) (рис. 5d). Мы наблюдали кластеризацию вариантов с низким покрытием при VAF 1 и 0,5 (рис. 5a, b), что подтверждает предположение о том, что это зародышевые гомозиготные или гетерозиготные варианты, которые также присутствовали в обработке Mock, но не были обнаружены из-за низкого покрытия. Далее, чтобы удалить фоновые варианты генотипа, мы вычли из вариантов AAVS1 те, которые были обнаружены в условиях Mock (рис. 5c), и снова обнаружили, что практически все варианты с высоким VAF были секвенированы с низким покрытием, вероятно, представляя собой шум секвенирования ниже предела обнаружения. Мы дополнительно отсеяли эти варианты, чтобы удалить варианты с VAF ниже 0,1% в обработке AAVS1 и варианты с VAF менее 1% в образце Mock - всего 173 варианта (рис. 5e). Из них 19 вариантов находились в предсказанном сайте мишени для gRNA AAVS1, включая все самые высокие показатели VAF при охвате более 100. Среди оставшихся вариантов-кандидатов на эффект вне мишени (расширенные данные) мы не обнаружили гомологии сgRNA AAVS1, что, вероятно, указывает на ложные срабатывания из-за низкого охвата при обработке AAVS1 и/или Mock. В качестве дополнительного доказательства того, что мутации, обнаруженные при обработке AAVS1, представляют собой артефакты секвенирования, мы провели дополнительный анализ, в котором образец Mock был обработан как "отредактированное" состояние, а образец AAVS1 - как фоновый контроль. Хотя мы ожидали, что в макете будет мало истинных вариантов, которые не присутствовали бы также при обработке AAVS1, мы обнаружили в макете в общей сложности 41 200 "соматических" вариантов (среднее значение 174 прочтений по названным вариантам) (рис. 5f и дополнительный рис. 8C, D). Этот список был сокращен до 171 варианта после проведения аналогичной сортировки (Дополнительный рис. 8E,F). Поскольку в макете было обнаружено почти такое же количество мутаций, как и в обработке AAVS1, а также отсутствие гомологии gRNA с любым из внецелевых сайтов в обработке AAVS1, мы считаем, что данные WGS не свидетельствуют о наличии дополнительных (интронных или межгенных) вне-целевых вариантов, введенных CRISPR-опосредованным нацеливанием на AAVS1 при данной глубине покрытия.

Первые препараты на основе CRISPR прошли ранние клинические испытания на людях, а многие другие участвуют в разработке лекарств³³ . Растет потребность в установлении долгосрочной безопасности редактирования человеческих клеток (ex vivo и in vivo) с помощью нуклеаз и векторов CRISPR. Мы разработали метод оценки безопасности инструментов для редактирования генома, протокол культивирования ex vivo и получения продуктов на основе клеток до клинического применения. Установление соответствующих параметров для оценки стабильности генома после редактирования генома остается важной и активной областью исследований. Например, в то время как WGS является единственным способом захвата вариантов/отклонений по всему геному, глубина чтения на пару оснований для достижения высокой чувствительности, необходимой для целей редактирования генома в популяции клеток, остается дорогостоящей и технически сложной. Секвенирование всего генома человека в массовых клетках позволяет обнаружить только высокочастотные события из-за низкого покрытия на пару оснований. В качестве альтернативы, выступает ограничение секвенирования наиболее сохранными и функционально значимыми регионами генома (т.е. экзонами, составляющими 1% генома³⁴) позволяет увеличить охват и, следовательно, повысить эффективность обнаружения вариантов с более низкой частотой. Хотя NGS может идентифицировать соматические мутации, внесенные культурой ex vivo и методами редактирования генома, для масштабируемой клинической реализации, воспроизводимо подтверждающей безопасность клеточных терапий на основе инженерии, существует компромисс между широтой и глубиной секвенирования. Поскольку рак может возникнуть в результате экспансии даже одного мутировавшего клона, в данном исследовании мы применили эту концепцию для дальнейшего ограничения секвенирования экзонами наиболее распространенных супрессоров опухолей и онкогенов, идентифицированных непредвзятым образом с учетом редактирования генома из генетики рака, для выявления событий с крайне низкой частотой. Cas9 может инициировать в ДНК DSBs как на целевых, так и вне-целевых сайтах, что потенциально может привести к непреднамеренным аномалиям генома. Действительно, в нескольких исследованиях сообщалось об обогащении р53-инактивирующих мутаций после CRISPR-редактирования в иммортализованных клеточных линиях человека, когда подмножество р53-мутантных клеток добавлялось в исходный пул клеток - важный момент, поскольку это не были мутации, инициированные Cas9-редактированием^1,2. Это подтверждается предыдущими исследованиями на первичных клетках человека, которые показали, что доставка Cas9 RNP не вводила мутации в p53 или 129 других генов, связанных с раком (с использованием Стэнфордской панели мутаций для солидных опухолей), хотя предел обнаружения составлял 5% VAF^35,36. Таким образом, мы разработали программу сверхглубокого секвенирования опухолевых супрессоров/онкогенов, чтобы определить, приводит ли редактирование и краткосрочная экспансия in vivo к нарушению и/или обогащению ассоциированных с раком вариантов при доставке в клинически значимом контексте, т.е. когда Cas9¹⁴ с высокой точностью транзиторно доставляется в виде RNP посредством электропорации в первичные HSPC человека без субпопуляций клеток с уже существующими опухолеродными вариантами. Для достижения этой цели мы исследовали экзоны 523 известных опухолевых супрессоров и онкогенов и достигли уровня обнаружения зародышевых и соматических мутаций на уровне менее 0,1% VAF, что представляет собой гораздо более низкий предел обнаружения (более 50 раз), чем в предыдущих исследованиях. При редактировании с помощью трех отдельных gRNA (нацеленных на AAVS1, HBB и ZFPM2), сверхглубокое секвенирование более 500 опухолевых супрессоров и онкогенов не выявило обнаружимых вариантов (более 0,002 VAF), которые можно было бы объяснить активностью Cas9 или экспансией клеток ^{ex vivo} (за исключением ожидаемого вне-целевого сайта EZH2 в группе обработки ZFPM2). Эти выводы были дополнительно подтверждены отсутствием какой-либо вне-целевой активности на сайтах, напоминающих gRNA AAVS1, по данным WES или WGS. В этом клинически значимом контексте транзиторная доставка Cas9 RNP с высокой чувствительностью (https://doi.org/10.1038/s41467-022-32233-z Nature Communications | (2022) 13:4724) в первичные HSPC не привносили и не обогащали опухолевые варианты. Более того, было обнаружено, что Cas9 с высокой чувствительностью настолько специфичен, что даже один гомозиготный SNP в позиции 6 спейсерной последовательности был достаточен для устранения всей обнаруживаемой вне-целевой активности в EZH2. В свете наших выводов предыдущие отчеты^1,2, вероятно, являются артефактом всплеска мутанта p53, геномной нестабильности клеточных линий, сверхфизиологических уровней Cas9 и/или резкой токсичности. В целом, данная работа подчеркивает важность: (1) регулировать продолжительность и уровень экспрессии нуклеазы для ограничения степени вне-целевой активности^11,37; (2) минимизировать токсичность путем электропорации RNP в отличие от редактирования на основе мРНК или плазмид³⁸, чтобы минимизировать возможности для клональной экспансии; и (3) проводить эксперименты на наиболее клинически значимых моделях - первичных клетках человека с функциональными механизмами ДНК-чувствительности и репарации повреждений, а не на бессмертных клеточных линиях с хорошо документированными геномными аномалиями^3,4. Ограничением данной работы является то, что мы достигли высокого покрытия только в кодирующих областях генов, включая те, которые, как известно, вовлечены в возникновение рака. Мы выбрали этот фокус, поскольку вне-целевые эффекты в экзонах, особенно в опухолевых супрессорах и онкогенах, несут наибольший риск возникновения неблагоприятных событий и хорошо описаны в патогенезе опухолей. Такая направленность позволила добиться высокой глубины секвенирования и, следовательно, выявить варианты с крайне низкой частотой с чувствительностью в разы выше, чем сообщалось ранее при использовании методов гибридного захвата^35,36. Нецелевые indels в не-кодирующих областях³⁹ генома, хотя и не входят в стандартное онкологическое обследование, были оценены с помощью WGS, хотя и с гораздо меньшей глубиной/чувствительностью из-за стоимости. Хотя наша панель включала 523 гена, имеющих отношение к раку (охватывающих 1,94 Мб), хромосомные укорочения^40,41 за пределами этих локусов не были специально исследованы, и для их выявления также потребовался бы полногеномный подход или массив высокого разрешения (например, сравнительная геномная гибридизация), для обнаружения, хотя atacAllN = 26 673AAVS1-MockN = 26 673FilteredN = 172ebdf

Fig. 5 | Варианты, идентифицированные с помощью полногеномного секвенирования.

Мы продемонстрировали, что WGS можно использовать в особых обстоятельствах, хотя стоимость и высокий уровень шума генетических вариаций означает, что в настоящее время его нецелесообразно использовать в качестве рутинной оценки вне-целевого воздействия. Поскольку клеточная и генная терапия расширяется в лечении дополнительных заболеваний, важным продолжением этой работы будет подтверждение наших выводов на дополнительных типах клеток и состояниях хроматина, помимо HSPCs^42-44. Например, мы предполагаем, что наш подход может быть распространен на дополнительные популяции пациентов с синдромами предрасположенности к раку, онкогенными воздействиями окружающей среды, такими как курение/радиация/стресс костного мозга, пожилой возраст и иммунокомпромиссный статус для подтверждения внутренних и генотоксических эффектов редактирования CRISPR/Cas. Важность установления безопасности клеточной терапии до ее клинического применения иллюстрирует недавнее развитие лейкемии у двух пациентов, включенных в исследование лентивирусной генотерапии серповидно-клеточной болезни, что привело к приостановке обоих соответствующих исследований¹⁵. Последующее исследование показало, что лейкемические клетки несли в себе вирусные интеграты, а мутации в RUNX1 и PTPN11 произошли в какой-то момент во время или после миелоаблативного кондиционирования и/или лентивирусной интеграции. Нарушение обоих генов, как было показано, играет роль в широком спектре раковых заболеваний^45-48, и благодаря включению в панель TSO500 и глубине секвенирования, достигнутой в данном исследовании, мы смогли бы выявить варианты в этих генах с VAF менее 0,1% до аутологичной трансплантации в этих испытаниях. В целом, мы считаем, что наше исследование не только устанавливает важный эталон типичной степени вариаций в раково-ассоциированных генах после редактирования на основе CRISPR и краткосрочной экспансии ex vivo, но и может стать общим инструментом для оценки безопасности клеточных продуктов перед трансплантацией (особенно в случае клональной экспансии и/или долгосрочной культуры ex vivo). Улучшение возможности выявления и обеспечения отсутствия онкогенных мутаций, следовательно, максимизирует шансы на успешное клиническое внедрение и долгосрочную безопасность терапии, основанной на редактировании генома на конкретном участке. Такие высокочувствительные работы по безопасности, как описанные здесь, имеют неоценимое значение для обеспечения того, чтобы безопасность подходов, основанных на CRISPR, не отставала от эффективности этих методов лечения по мере того, как все большее число людей будут получать пользу от их применения.

Эта работа была проведена в соответствии со всеми соответствующими этическими нормами с полного одобрения комитета Institutional Review Board (IRB) Стэнфордского университета. Доноры HSPC пуповинной крови предоставили информированное согласие в соответствии с требованиями комитета IRB Стэнфордского университета (протокол № 33813), информация о пациентах была удалена до начала лабораторных экспериментов, поэтому мы не можем сделать заявление о половой или этнической принадлежности участников. Доноры не были осведомлены о цели исследования и не получали компенсации за свое участие. Формы согласия разрешали публикацию неидентифицированной генетической информации.

Культивирование HSPC. Первичные человеческие HSPC были получены из свежей пуповинной крови (щедро предоставленной программой Binns Family for Cord Blood Research) по протоколу 33818, который был одобрен и ежегодно продлевался IRB NHLBI. Все пациенты дали информированное согласие на проведение исследования. CD34+HSPC были обогащены бусинками с помощью наборов Human CD34Microbead Kits (Mitenyi Biotec, Inc, Бергиш Гладбах, Германия) в соответствии с протоколом производителя и культивировали при 1 x 10⁵ клеток/мл в бес-сывороточной базовой среде CellGenix GMP SCGM (Sartorius CellGenixGmbH, Фрайбург, Германия), дополненной фактором стволовых клеток (SCF) (100 нг/мл), тромбопоэтином (TPO) (100 нг/мл), FLT3-лигандом (100 нг/мл), IL-6 (100 нг/мл), UM171 (35 нМ), 20 мг/мл стрептомицина и 20 Ед/мл пенициллина. Условия в клеточном инкубаторе были 37°C, 5% CO2 и 5% O2.

Редактирование генома HSPCs/ Химически модифицированные gRNA, использованные для редактирования HSPCs, были приобретены у компании Synthego (Menlo Park, CA, USA). Модификации gRNA состояли из 2'-O-метил-3'-фосфоротиоата на трех терминальных нуклеотидах 5'и 3'концов³⁷. Весь белок Cas9 (SpyFi S.p. Cas9 nuclease) был приобретен у компании Aldevron, LLC (Фарго, Северная Дакота, США). РНК комплексовали в молярном соотношении Cas9:sgRNA 1:2,5 при 25 °C в течение 10 мин до электропорации. HSPC ре-суспендировали в буфере P3 (Lonza, Базель, Швейцария) с комплексными РНК и электрофорилировали с помощью нуклеофектора Lonza 4D (программа DZ-100). Клетки высевали в количестве 1 x 10⁵ клеток/мл после электропорации в среду, дополненную цитокинами, описанную выше.

Подготовка библиотеки TSO500. Концентрация исходной ДНК определялась с помощью набора Qubit dsDNA HS assay kit на флуорометре Qubit в соответствии с производственным протоколом (Qubit, Лондон, Великобритания). Затем ДНК фрагментировали до 90-250 п.н. с помощью Covaris E220 Evolution Sonicator (Covaris, Woburn, MA, USA), с целевым пиком около 130 п.н., как определено на биоанализаторе Agi-lent Technologies 2100 с использованием высокочувствительного ДНК-чипа. Затем образцы подвергали репарации концов и А-хвостов. К концам фрагментов ДНК были пришиты адаптеры, содержащие модули UMI. После очистки фрагменты ДНК амплифицировались с помощью праймеров для добавления индексовых последовательностей для мультиплексирования образцов (необходимого для генерирования кластеров). Было выполнено два этапа гибридизации/захвата. Сначала на подготовленные библиотеки ДНК в течение ночи гибридизировали пул олигосом, специфичных для 523 генов, на которые нацелен TSO500, с дополнительными зондами от Integrated DNA Technologies, Inc. (Cor-alville, IA, USA) (Дополнительная таблица 3). Затем использовали стрептавидинмагнитные бусины для захвата зондов, гибридизованных с целевыми регионами. Этапы гибридизации и захвата повторяли с использованием обогащенных библиотек ДНК для обеспечения высокой специфичности захваченных регионов. Праймеры использовались для амплификации обогащенных библиотек с помощью бусинок для очистки образцов. Обогащенные библиотеки квантифицировались, и каждая библиотека нормализовалась для обеспечения равномерного представительства в объединенных библиотеках. Наконец, библиотеки объединяли, денатурировали, разбавляли до соответствующей концентрации загрузки и секвенировали на Illumina NovaSeq с длиной чтения 2 x 151 пар оснований. За один цикл секвенировалось до 8 библиотек TSO500.