Современные методы in vivo gene therapy (GTx) в основном направлены на лечение редких моногенных заболеваний, вызванных потерей функции или патогенным приобретением токсичных функциональных мутаций, и обычно включают доставку терапевтического гена с помощью рекомбинантного вирусного вектора.^1,2 Наиболее часто используемые вирусные векторы для GTx основаны на адено-ассоциированном вирусе (AAV), неразвивающемся одноцепочечном ДНК-вирусе.³ AAV является представителем рода Dependoparvovirus семейства Parvoviridae.^4,5 AAV дикого типа считается непатогенным, клинически немым,^6,7 и требует совместной инфекции с вирусом-помощником (аденовирусом или герпесвирусом) для обеспечения репликации.^6,7 Капсид AAV состоит из трех структурных белков (VP1-VP3) в соотношении 1:1:10 (VP1:VP2:VP3).^8,9 Геном упакованного рекомбинантного вектора AAV (rAAV) не содержит всех вирусных генов, но вместо этого включает интересующий трансген,⁴ плюс регуляторные элементы, способствующие эффективной и целенаправленной экспрессии трансгена.⁸ Серотипы AAV различаются по своему тканевому тропизму^10,11; поэтому выбор соответствующего серотипа AAV обеспечивает целенаправленную экспрессию в тканях.^4,10,12 По оценкам, около 30%-60% населения имеют соизмеримые антитела к различным серотипам AAV при инфекции дикого типа.¹³ Эти антитела потенциально могут препятствовать трансдукции клеток-мишеней векторами rAAV, что мешает успешному переносу генов и может иметь потенциальные последствия для безопасности.¹³ Несколько исследований показали, что серотипическая принадлежность анти-AAV антител у людей варьируется в зависимости от географии^14,15 и возраста.^15-18 Кроме того, благодаря высокой степени сохранения аминокислотной последовательности капсида, существует значительная перекрестная реактивность между серотипами AAV.^13-15,19. Помимо воздействия дикого типа AAV, существует теоретический риск того, что распространение векторов rAAV в биологических жидкостях пациентов, получивших rAAV GTx, может привести к консервации серотипов у членов семьи и других близких.²⁰ Кроме того, в связи с продолжающимися клиническими исследованиями вакцин на основе rAAV, существует опасение, что у получателей этих вакцин могут развиться антитела против AAV, что сделает их непригодными для будущих rAAV GTx.^21,22 Оба этих потенциальных риска требуют дополнительного изучения.

Оценка анти-AAV антител считается необходимой перед введением системной rAAV GTx, а наличие анти-AAV антител выше определенного порога в настоящее время является общепринятым критерием исключения из многих клинических испытаний rAAV GTx.^23-25 В данном обзоре обсуждаются современные подходы к измерению анти-AAV антител в плазме или сыворотке крови пациентов, потенциальные последствия безопасности и эффективности, связанные с наличием этих антител, и стратегии исследования для смягчения влияния уже существующих анти-AAV антител у пациентов. Данный обзор посвящен проблемам, связанным с уже существующими антителами, в отличие от антител, образовавшихся после системного введения rAAV GTx.²⁶

Анти-AAV антитела могут быть нейтрализующими или не нейтрализующими; их потенциальное влияние на трансдукцию вектора показано на рисунке 1. Нейтрализующие антитела (NAbs) обычно связываются с капсидом rAAV и могут ингибировать трансдукцию вектора, а не нейтрализующие антитела (non-NAbs) связываются с капсидом AAV, но не препятствуют трансдукции вектора (в некоторых случаях они могут даже усиливать трансдукцию AAV).²⁷ Как NAbs, так и non-NAbs потенциально могут влиять на биораспределение вектора вдали от клеток-мишеней, перенацеливая его на вторичные лимфоидные органы.²⁷ Несистемное, прямое введение векторов rAAV в иммунопривилегированные участки, включая глаза или центральную нервную систему, может быть менее подвержено влиянию анти-AAV антител.^28-30



Figure 1. Mechanisms for the inhibition of vector transduction and transgene expression by neutralizing anti-AAV antibodies

rAAV vector transduction and key steps in which transduction may be inhibited by neutralizing anti-AAV antibodies. Non-neutralizing anti-AAV antibodies bind to the rAAV capsid but do not prevent vector binding to cell-surface receptors or inhibit transduction. Of note, non-antibody neutralizing factors (not depicted) might also impact transduction. AAV, adeno-associated virus; rAAV, recombinant AAV.

Доминирование серотипа анти-AAV антител является более высоким в течение нескольких месяцев после рождения из-за активной передачи антител от матери, известно как пассивный иммунитет.^31,32 В позднем младенчестве доминирование серотипа остается низким примерно до трехлетнего возраста, после чего оно прогрессивно возрастает на протяжении всего детства и зрелого возраста в результате воздействия AAV дикого типа.^17,18 В течение жизни человека уровень анти-AAV антител может оставаться стабильным или колебаться во времени. Исследование уровней NAb у шимпанзе показало, что некоторые животные были серонегативными, серопозитивными или сероконвертированными с колебаниями титров в течение 10-летнего периода наблюдения.¹⁴ Конверсия серотипа у анти-ААВ-антител-отрицательных пациентов в период между определением необходимости лечение и использованием GTx вызывает беспокойство, хотя степень, в которой это может произойти, в настоящее время неизвестна. Продольное исследование здоровых доноров (N = 30) в течение 3 лет показало, что титры AAV8 NAb были стабильными, а сероконверсия происходила нечасто и только у доноров с пограничными положительными и отрицательными титрами.¹⁹ Ожидается, что клинические испытания GTx с периодами тренировки, в ходе которых пациентов проверяют на антитела через регулярные периоды, предоставят дополнительные данные по этому вопросу. Например, рандомизированное исследование GTx фазы 3 при мышечной дистрофии Дюшенна (DMD) включает когорту пациентов, которые будут проходить обкатку через 1 год после зачисления, что позволит получить продольные данные о серопревалентности.³³

Доминирование серотипа анти-AAV антител зависит от множества факторов, таких как серотип капсида AAV, возраст, тип анализа (Рисунок 2A),^18,34-42 и географическое положение (Рисунок 2B).^34,36,42 Другие факторы, которые могут влиять на доминирование серотипа, включают здоровье донора (здоровый или больной)^{19,37,40,41,43,44} и использование иммунодепрессантов, таких как rituximab и cyclosporine.^13,45. Очевидна значительная перекрестная реактивность анти-AAV антител между серотипами,⁴⁶ что, скорее всего, объясняется высокой степенью гомологии последовательности капсида AAV.^13,19,47 Kruzik et al. (2019) обнаружили, что 87% людей с NAbs, направленными против нескольких серотипов AAV, показали более высокие титры против AAV2, указывая на то, что более низкие титры против AAV5 и AAV8 в одном и том же образце могут быть вызваны перекрестной реактивностью NAbs против AAV2.¹⁹ Для улучшения понимания вариаций иммуногенности разных серотипов необходимы дальнейшие исследования, направленные на изучение аминокислотных или конформационных мотивов, определяющих перекрестную реактивность анти-AAV антител.



Figure 2. Anti-AAV antibody seroprevalence ranges for different AAV serotypes and across geographical regions using the hemophilia A and B population as an example

The published anti-AAV antibody seroprevalence rates vary widely according to a variety of factors, including (A) different AAV serotypes,18,34-42 and (B) across geographical regions (using AAV6 data from three separate reports as an example).34,36,42 Other factors that may influence seroprevalence rates include assay type, donor health and age, and the use of some medications, such as immunosuppressants. ?As these studies were performed in different regions/countries using different assay types, the seroprevalence rates cannot be directly compared. AAV, adeno-associated virus; TAb, total antibody; TI, transduction inhibition.

Было разработано несколько методов для выявления анти-AAV антител до начала GTx. На сегодняшний день в клинических испытаниях регулярно используются анализы ингибирования трансдукции (TI) и анализы total antibody (TAb).^48,49 В этих анализах обычно используются образцы плазмы или сыворотки пациента, но для простоты в дальнейшем тексте такие образцы будут называться образцами сыворотки.^48,49 Регистрационная документация клинических исследований и информация о назначении rAAV GTx может включать схему анализа и пороговое значение титра анти-AAV антител для определения соответствия пациента требованиям (отсечка скринингового титра), которые варьируют от исследования к исследованию.^50-55

Анализы TI, обычно называемые и понимаемые как анализы NAb, измеряют степень, в которой NAbs и нейтрализующие факторы не антитела ингибируют rAAV-опосредованную экспрессию репортерного гена.⁴⁸ При использовании клеточного подхода при TI-анализе используется тот же капсид, который применяется в конкретном GTx, но содержит "репортерный" ген для простоты обнаружения (рис. 3A).^23,48 Конструкция репортерного вектора должна быть получена и очищена таким же образом, как и соответствующий GTx-вектор, чтобы обеспечить сопоставимые аналитические характеристики (соотношение пустого и полного капсида, процент интактных геномов, примеси), которые в противном случае могут повлиять на результаты анализа. Сыворотка пациента серийно разводится и предварительно инкубируется с репортерным вектором rAAV перед инокуляцией клеток-мишеней.⁴⁹ После инкубационного периода, позволяющего трансдукцию клеток-мишеней и экспрессию репортерного гена, нейтрализующий титр для rAAV оценивается путем измерения снижения экспрессии репортерного гена.⁴⁹ Титр нейтрализации обычно определяется как наибольшее разведение сыворотки, которое снижает экспрессию трансгена rAAV на определенную величину (например, ~50%) или экстраполированное разведение, полученное на основе кривой ингибирования (ID50).^49,56 Анализы TI измеряют присутствие NAbs, а также нейтрализующих факторов не антител, которые ингибируют трансдукцию. Факторы, нейтрализующие не антитела, могут включать малые молекулы, активаторы врожденного иммунитета и рецепторы AAV.^49,57-60 Хотя это еще не до конца изучено, считается, что NAbs и факторы, нейтрализующие не антитела, ингибируют трансдукцию и экспрессию трансгена посредством одного или нескольких механизмов, которые включают блокирование поглощения вектора в клетках-мишенях, предотвращение выхода из эндосом, препятствование распаковке капсида и препятствование проникновению в ядро (Рисунок 1).^49,61



Figure 3. Principles of transduction inhibition and total antibody assays

(A) (1) Serum samples are heat-inactivated and any potential precipitates removed by centrifugation. Patient and control serum dilutions are prepared. The TI assay is usually carried out in a 48- or 96-well plate format, permitting a high-throughput sample analysis. Typically, a reporter rAAV vector is combined with the serially diluted test sample before (2) being incubated with the cell line (in some cases, target cells are pre-infected with wild-type adenovirus to increase rAAV transduction).¹⁴ (3) The target cells are lysed, and reporter gene expression (luciferase or GFP activity) is measured as luminescence after the addition of the enzyme substrate (in the case of luciferase) or fluorescence (in the case of GFP). The presence of AAV NAbs and non-antibody neutralizing factors (not depicted in the figure for reasons of clarity) interferes with the transduction process and decreases the reporter gene expression when compared with the negative control. (4) Confirmatory steps to determine neutralization due to NAbs can be performed, although they are not always essential. This step may involve use of an irrelevant monoclonal non-AAV antibody to determine specificity, Ig fraction depletion, or competitive inhibition with empty vectors (or irrelevant transgenes).⁴⁹ (B) TAb assays can be divided into antigen-capture and bridging formats, depending on the secondary reagents used. TAb assays can be developed using either co-incubation (homogeneous) or sequential incubation (heterogeneous) protocols based on the desired attributes, such as improved assay selectivity, antigen tolerance, or specificity (reviewed in Gorovits et al.⁴⁸). (1) rAAV capsids are immobilized on an ELISA or electrochemiluminescence (ECL) microtiter plate; (2) serum samples are added to allow binding of antibodies to the rAAV capsid; (3) after washing to remove unbound material, in the antigen-capture format, a secondary detection reagent such as a horseradish peroxidase-conjugated or ruthenylated anti-species antibody is added; in the bridging format, a labeled (e.g., biotinylated or ruthenylated) rAAV capsid is added48). (4) In the case of a ruthenylated detection system, the assay signal is measured in luminescence units after the addition of the read buffer. For enzyme-conjugated detection systems, the enzyme substrate is added for colorimetric detection. Commercially available serotype-specific anti-AAV capsid monoclonal/polyclonal antibodies or proprietary antibodies may be used as a positive control, while pooled samples from TAb-negative donors can be used as a negative control.48 (5) Anti-AAV TAb screening assays typically involve an additional confirmatory assay to ensure the specificity of the signal obtained. AAV, adeno-associated virus; ECLA, electrochemiluminescence assay; ELISA, enzyme-linked immunosorbent assay; GFP, green fluorescent protein; Ig, immunoglobulin; NAb, neutralizing antibody; rAAV, recombinant AAV; TAb, total antibody; TI, transduction inhibition.

Репортерные векторы rAAV обычно содержат гены, обеспечивающие удобную и чувствительную детекцию трансдукции, такие как зеленый флуоресцентный белок (GFP), β-галактозидаза или люцифераза, вместо терапевтического трансгена.^23,49 Для оценки нейтрализующей активности, направленной против rAAV, экспрессия репортерного гена измеряется в присутствии и отсутствии исследуемого образца наряду с образцами положительного контроля (ПК) и отрицательного контроля (ОК). Способность анализа выявлять NAbs с низким титром может зависеть от специфических характеристик гена-репортера, капсида AAV и дизайна анализа. В многочисленных исследованиях сообщалось о более чувствительном обнаружении NAb с помощью TI анализа с репортерной системой люциферазы по сравнению с репортером GFP.^40,62,63 В качестве альтернативы использованию репортерного гена в качестве конечной точки можно использовать уровень экспрессии мРНК, кодируемой терапевтическим трансгеном, аналогично анализам, используемым для оценки потенции при тестировании партии rAAV GTx.⁴⁹.

Для анализа TI использовались различные типы клеток, включая клеточные линии HEK293, HeLa и Huh7,^14,49,64, причем HEK293 является наиболее распространенной.⁴⁹ Различные серотипы капсидов rAAV различаются по эффективности трансдукции для этих клеточных линий. Плохо трансдуцирующие капсиды, приводящие к снижению экспрессии трансгенов, требуют более высокого MOI (множественность инфекции, т.е. отношение частиц вектора к клеткам-мишеням) или реагентов, усиливающих трансдукцию (аденовирус дикого типа,⁶⁵ экдизоном индуцированные белки аденовируса,⁵⁶ соединение C66) для достижения измеримой экспрессии трансгенов. Однако использование более высоких показателей MOI изменяет стехиометрию антител к капсидам, что может повлиять на результаты анализа.⁶⁷ Другие факторы, которые могут повлиять на результаты анализа, включают матрицу образца, начальное разведение образца, количество клеток-мишеней, время и температуру инкубации, объем используемой сыворотки и тепловую инактивацию белков комплемента.⁶³ Использование реагентов, таких как гепарин, антикоагулянт, обычно используемый для сбора крови, также может влиять на трансдукцию клеток HeLa или HEK293 посредством дозозависимого конкурентного связывания с протеогликанами.^49,68 Факторы, связанные со сбором и обработкой проб, также могут влиять на результаты, включая устройства/пробирки для сбора проб, целостность проб (гемолиз, липемия), обработку проб и условия хранения.⁶².

Анализы на TAb Анализы TAb, также известные как анализы связывающих антител, измеряют все связанные с капсидом антитела, независимо от того, обладают ли они нейтрализующей (ингибирующей) активностью или нет (Рисунок 1).^23,24 Поскольку анализы TAb определяют только антитела,⁴⁸ они не измеряют факторы нейтрализации, не связанные с антителами.

Анализы TAb обычно включают нанесение векторов rAAV (полных или пустых) или пептидов AAV на пластину (Рисунок 3B). Они могут выявлять все изотипы анти-AAV антител,⁴⁸ включая те, которые имеют низкую авидность и могут не иметь клинического значения.⁶⁹ Эти анализы также могут выявлять преобладание анти-AAV иммуноглобулинов (Ig) с помощью специфических для данного класса вторичных антител.⁴⁸ Существуют значительные различия между традиционными платформами для TAb анализа. Анализ захвата антигена оценивает анти-ААВ антитела, которые непосредственно связываются с капсидом с помощью иммуноферментного анализа (ELISA) или электро-хеми-люминесцентного анализа (ECLA). Определение изотипа в анализах захвата антигена зависит от использования соответствующих реагентов для различения классов Ig в мультиплексном формате. В качестве альтернативы, арочный анализ с использованием меченых капсидов в качестве вторичных реагентов может выявить все классы антител, связанных с капсидом (Рисунок 3B).^48,69

Выбор реагентов, полученных из капсида rAAV, является важным моментом для анализа TAb. Они варьируются от анализа к анализу, начиная от интактных векторов rAAV или подходящих суррогатов, таких как пустые капсиды или капсидные белки.⁴⁸ Капсидный белок (или фрагменты белка) может не представлять все соответствующие эпитопы или конформационные эпитопы на поверхности капсида; поэтому рекомендуется использовать интактные капсиды, а не суррогаты. Более того, пустые капсиды несут различные заряды по сравнению с интактными капсидами, что может влиять на их сродство к связыванию антител,⁷⁰ хотя доказательства этого ограничены.⁴⁸

Анализы TI и TAb могут проводиться полу-количественно, с использованием серийно разведенного образца пациента, или качественно, с использованием одного заранее определенного разведения. В клинических исследованиях поздней фазы с более продвинутыми протоколами обычно используются серийные разведения, позволяющие полуколичественно определять титр анти-AAV антител (рис. 4). Упрощенный (cutoffs) аналиа - это специфический для протокола параметр, при превышении которого разведение образца считается положительным в отношении нейтрализующей активности.⁵⁶ Упрощенный анализ варьируют между методами и устанавливаются на определенном пороге, обозначающем положительный образец (например, 50% TI). Скрининговые титры для определения соответствия требованиям пациента определяются при заранее оговоренном разведении (например, более 1:4). Обычно они устанавливаются с помощью исследований на животных, в которых сравнивается трансдукция у нативных и серопозитивных животных. Однако, поскольку когорты в исследованиях на крупных животных (например, на собаках, свиньях, макаках) часто бывают небольшими, а переносимость данных, полученных на животных, на человека часто ограничена, установление соответствующих скрининговых титров является сложной задачей.⁵⁶ Другие методы, используемые для установления скрининговых титров, описаны в других источниках.⁷¹ На рисунке 4 показан полуколичественный анализ TI (принципы также применимы к анализу TAb) на примере серийного разведения 1:3 и 50%-ного ингибирования.



Figure 4. Readout of a semi-quantitative transduction inhibition assay

These principles also apply to total antibody assay. (A) Reporter gene expression in serial one in three dilutions of serum samples of four patients and positive and negative controls. The negative control does not contain neutralizing anti-AAV antibodies (or non-antibody neutralizing factors); therefore, the rAAV vector transduces the target cells where the reporter gene is expressed (yellow well). The positive control contains neutralizing anti-AAV antibodies, often marginally above the screening titer cutoff. Patient serum samples one to four contain varying levels of neutralizing anti-AAV antibodies (or non-antibody neutralizing factors) that affect the level of reporter gene expression seen at different dilutions. (B) The degree of inhibition of reporter gene expression is plotted against the dilutions of the serum sample.^48,49,56 The 50% inhibition cutoff from the resulting curves is based on the highest sample dilution that achieves 50% inhibition of vector transduction in comparison with the negative-control sample. In this example, patient 3 has an anti-AAV NAb titer of 1:81, which will be compared with the screening titer cutoff to determine patient eligibility. If the patient 3 titer of 1:81 ≥ screening titer cutoff (e.g., 1:3), the patient would be ineligible for the rAAV GTx. AAV, adeno-associated virus; rAAV, recombinant AAV; TAb, total antibody; TI, transduction inhibition.

Для оценки качества и функциональности анализов TI и TAb требуются образцы PC и NC.^48,49 Часто титр PC выбирается так, чтобы он был незначительно выше, чем отсекающий титр скрининга.⁷¹ PC может состоять из поли-клональных или моноклональных анти-AAV антител, специфичных к серотипу, и может использовать коммерчески доступные запатентованные реагенты для облегчения сравнения данных между продуктами.⁴⁸ Для характеристики параметров работы анализа, включая чувствительность, точность, селективность и надежность, используются либо серотип-специфичные, либо перекрестно реагирующие реагенты PC.⁴⁸ Выбор реактива для PC должен быть тщательно продуман, поскольку некоторые моноклональные PC могут обеспечивать строгую серотипическую специфичность, в то время как другие, включая поли-клональные PC, перекрестно реагируют с несколькими капсидами.⁴⁸ NC обычно включает объединенные сыворотки от нескольких NAb-отрицательных людей или нативных животных⁴⁹ и используется для мониторинга эффективности анализа⁴⁹; он также используется в качестве разбавителя и для нормализации сигналов.⁴⁸ Моноклональные антитела с уникальной или узкой специфичностью также могут служить в качестве NC; например, моноклональные антитела против AAV6 мыши (ADK6) могут быть использованы в качестве NC для анализа AAV9 и, наоборот, моноклональные антитела против AAV9 мыши (ADK9) могут быть использованы в качестве NC для анализа AAV6. Основной проблемой при разработке NC является высокая распространенность уже существующих антител, поэтому для исключения положительных к антителам образцов может потребоваться подтверждающий шаг.⁴⁹

Не существует стандартизации внутри и между анализами TI и TAb. Поэтому точное сравнение эффективности анализа и клинической пользы в настоящее время невозможно.^48,49,72 Идеальным является анализ, который может определять анти-AAV-антитела низкого уровня, но может быть и компромисс между такими характеристиками анализа, как сложность, чувствительность и специфичность. Преимущества и потенциальные недостатки обоих типов анализов описаны в Таблице 1. Их следует учитывать при разработке биоаналитической стратегии для конкретного rAAV GTx в контексте конкретной конструкции вектора, дозы, способа введения, показаний к заболеванию и популяции пациентов. Недостаток данных, подтверждающих корреляцию результатов применения анти-AAV-антител с клиническими результатами, не позволяет рекомендовать какой-либо один подход. Кроме того, отсутствие эталонных реагентов для анализа TI и TAb признано неудовлетворенной потребностью в данной области.

Table 1. Comparison of transduction inhibition and total antibody assays

Стандартизация результатов анализа на анти-AAV-антитела при разнообразии программ GTx rAAV, использующих одинаковые или антигенно родственные серотипы капсида, сопряжена со значительными трудностями. Стандартизация и коммерциализация сложны из-за гетерогенности клеточных линий, отсутствия согласованного анализа, а также связанных с этим затрат и трудностей, присущих расширению сложных по своей сути анализов в условиях редких заболеваний.⁴⁹ Выбор скринингового анализа на ранней стадии разработки требует тщательного рассмотрения, поскольку характеристики исследуемой популяции могут измениться, если методология анализа будет изменена на поздней стадии разработки. Хотя некоторые спонсоры клинических испытаний на поздних стадиях могут опасаться внедрения TI-анализов из-за сложностей, связанных с настройкой, в текущих или недавно завершенных клинических испытаниях успешно используются надежные и прочные TI-анализы, которые подходят для рутинного клинического тестирования.^33,71,73-75.

Несколько исследований показывают разумную корреляцию между результатами TAb и TI для некоторых серотипов (AAV1, AAV3B, AAV5 и AAV8), но не для других (AAV9, AAVrh74 и AAVDJ).^19,40,76-78 Однако исследование с участием здоровых добровольцев с использованием TAb и TI анализов для AAV5 показало, что часть людей была положительной в одном анализе и отрицательной в другом.^41,62. В целом, в образцах с высоким титром NAbs можно ожидать совпадающих результатов анализа (положительных) между TI и TAb анализами.¹⁹ Для устранения разногласий между TI и TAb анализами в некоторых испытаниях GTx на основе rAAV была предложена стратегия скрининга с использованием двух анализов для выявления лиц, у которых отрицательные результаты как TAb, так и NAb, и которые могут с большей вероятностью ответить на GTx.^41,62 Однако этот подход, вероятно, непрактичен, учитывая трудности со стандартизацией анализов, о которых говорилось выше. Кроме того, наличие квалификационных требований, основанных как на TI, так и на анализе TAb, может еще больше ограничить кандидатов на участие в клинических испытаниях. Другой подход может включать получение доклинических данных, устанавливающих взаимосвязь между этими двумя платформами с использованием хорошо охарактеризованных и надежных анализов TI и TAb.

Многочисленные нормативные руководства, относящиеся к генотерапии rAAV, рекомендуют спонсорам рассмотреть возможность одновременной разработки диагностических тестов для скрининга уже существующих анти-AAV антител.^79,80,81. Если тест считается важным для безопасности и/или эффективности, а у соответствующих кандидатов на клинические испытания GTx наблюдаются благоприятные результаты лечения, такие тесты могут быть классифицированы как сопутствующая диагностика (CDx).^48,49 Официальное одобрение регулятором анализа на анти-AAV антитела в качестве CDx будет отражать, что он надежен, достаточно чувствителен, специфичен для рассматриваемых анти-AAV антител и подходит для конкретного rAAV GTx.

Поэтому подача маркетинговой заявки на CDx и заявки на лицензию на биологические препараты для rAAV GTx должна быть скоординирована, чтобы поддержать одновременное получение маркетинговых разрешений. Для совместной разработки CDx и rAAV GTx спонсор должен определить применение анализа и соответствующие риски и преимущества; также необходимо определить популяцию(и) пациентов, у которых будет полезно использовать анализ в сочетании с терапией.⁸² В идеале, CDx и GTx должны разрабатываться одновременно на ранних этапах, чтобы анализ был готов к ранним клиническим исследованиям, исключая необходимость потенциальных промежуточных исследований в дальнейшем. Анализ должен быть разработан надлежащим образом в соответствии с применимыми стандартами качества и промышленными стандартами.^81,82

Нормативная среда для CDx-тестов для rAAV GTx развивается и в некоторой степени открыта для интерпретации: Для Onasemnogene abeparvovec (спинальная мышечная атрофия типа I), который был лицензирован Управлением по контролю за продуктами и лекарствами (FDA) (2019 год)⁸³ , Европейским агентством по лекарственным средствам (EMA) (2020 год)⁸⁴ и Министерством здравоохранения, труда и благосостояния Японии (2020 год)⁸⁵ , титры анти-AAV TAb измеряются с помощью разработанного в лаборатории теста в США и Европе и CDx в Японии⁸⁶. Для Valoctocogene Roxaparvovec (гемофилия А), который был лицензирован EMA (2022),⁸⁷ анализ TAb с маркировкой CE доступен в качестве CDx в соответствии с Европейской директивой по экстракорпоральной диагностике (IVDD).⁸⁸ Для препарата etranacogene dezaparvovec (гемофилия B), который был лицензирован FDA на момент написания данной рукописи (декабрь 2022 года),⁸⁹ одним из требований FDA по пост-маркетинговому тестированию является обоснованием чувствительного и точного анализа TI для выявления анти-AAV5 NAb до титра 1:1,400 или выше (в настоящее время, на момент одобрения FDA, не существует обоснованного анализа анти-AAV5 NAb для etranacogene dezaparvovec).⁹⁰ В лицензированных в настоящее время продуктах rAAV GTx, которые вводятся несистемным путем, не используются тесты CDx для определения анти-AAV антител^91,92 (в соответствии с идеей о том, что некоторые несистемные пути введения могут быть менее подвержены влиянию анти-AAV антител, см. раздел "Обзор анти-AAV антител").

В целом, регуляторная среда в отношении CDx для rAAV GTx развивается, и для разработки соответствующей стратегии CDx необходимо тщательное рассмотрение. Настоятельно рекомендуется заблаговременно проконсультироваться с регулирующими органами по этому вопросу.

Предыдущие исследования rAAV GTx на животных27,93-95 и людях96-99 продемонстрировали, что предварительно существующие анти-AAV NAbs могут ограничивать или полностью блокировать экспрессию трансгена даже при низких титрах. В исследованиях на животных сообщалось о не обнаруживаемых уровнях фактора IX (FIX) у мышей, обработанных rAAV8, которые были привиты анти-AAV8 NAbs,²⁷ и 96% потеря экспрессии FIX наблюдалась при титре AAV2 NAb всего 1:3,8 у мышей, обработанных rAAV2⁹⁴; однако было установлено, что влияние уже существующих NAbs зависит от серотипа.^93,94,97. У макак почти полный блок трансдукции был зафиксирован при титрах AAV8 NAb более 1:5.⁹⁵ Аналогично, в другом исследовании на макаках полное отсутствие экспрессии FIX было продемонстрировано при титре AAV8 NAb 1:5.⁹³ Напротив, в исследовании, изучавшем влияние AAV9 Abs на эффективность трансдукции у макак, сообщалось, что титры анти-AAV9 TAb до 1:400 не блокировали перенос печеночного гена.¹⁰⁰ Важным моментом является то, что в первых двух исследованиях на макаках использовались TI-анализы, тогда как в третьем исследовании для определения титра анти-AAV-антител использовался TAb-анализ. Как было сказано ранее, значимое сравнение титров в разных анализах практически невозможно.

У людей экспрессия FIX была ослаблена у пациента с уже существовавшим титром NAb 1:17, которому вводили вектор AAV2 для лечения гемофилии B.⁹⁶ В другом исследовании, в котором оценивался rAAV (Spark100) GTx у пациентов с гемофилией B, George et al. (2017) сообщили, что единственный участник с титром анти-AAV-Spark100 NAb 1:1 достиг более низкой активности FIX, чем участники с более низким титром NAb (менее 1:1)⁹⁹.

Общепризнано, что антитела опосредуют врожденные и В- и Т-клеточно-зависимые иммунные реакции; например, уже существующие антитела могут связывать векторы rAAV и перенаправлять их во вторичные лимфоидные органы¹⁰¹ для поглощения антиген-презентирующими клетками.^101,102 Это может изменить профиль биораспределения и клиренс векторов rAAV, что потенциально может привести к снижению распределения в клетках-мишенях и/или воспалению.

Нейтрализующие или не-нейтрализующие IgM/IgG антитела, как полагают, образуют иммунные комплексы с циркулирующими векторами, которые могут активировать систему комплемента по классическому пути.¹⁰³ Активация системы комплемента может привести к синдрому тромботической микроангиопатии (ТМА) и повреждению почек.^104-108. В исследовании rAAV GTx у пациентов с DMD у трех участников развилась активация комплемента после введения высокой дозы вектора (2E14 vg/кг).^103,109,110 Однако, поскольку все пациенты были серонегативными как по TAbs, так и по NAbs на исходном уровне, ни TI, ни TAb анализы не предсказали бы активацию комплемента в этих случаях.¹¹⁰ Врожденные иммунные реакции, такие как активация комплемента, могут быть результатом первичной иммунизации капсидом у нативных пациентов при введении rAAV GTx и зависят от введенной дозы вектора (в основном наблюдаются при высоких дозах более 1E14 vg/kg).^84,109,111 Образование антител De novo IgM через несколько дней после введения rAAV GTx может лучше предсказать активацию комплемента и ТМА-подобные нежелательные явления, чем статус антител на исходном уровне. По мере того, как rAAV GTx набирает обороты, предпринимаются все большие усилия для понимания и устранения неблагоприятных событий, связанных с иммунными реакциями организма, путем усиления мониторинга пациентов, изменения критериев допуска пациентов к клиническим испытаниям и корректировки иммуносупрессивных схем.^112,113.

Не во всех клинических исследованиях серопозитивность по AAV использовалась в качестве критерия исключения. В исследовании фазы 3 etranacogene dezaparvovec у пациентов с гемофилией В использовался вектор AAV5, и лечение пациентов проводилось независимо от их анти-AAV NAb статуса³⁸ с использованием непроверенного анализа клинических испытаний.⁹⁰ Подгруппа пациентов с выявленными ранее существующими нейтрализующими анти-AAV5 антителами ≤1:678 показала среднюю активность FIX, которая была численно ниже по сравнению с подгруппой пациентов без выявленных ранее нейтрализующих анти-AAV5 антител. Пациенты с предсуществующими анти-AAV5 NAbs и без них продемонстрировали гемостатическую защиту. Один из участников исследования с титром предшествующих AAV5 NAb 1:3212 не ответил на терапию (экспрессия FIX не наблюдалась), и профилактика FIX была возобновлена.³⁸ В настоящее время имеется ограниченное количество данных, позволяющих выдвинуть четкие гипотезы относительно этих результатов. В настоящее время терапевтический уровень экспрессии трансгена должен быть достигнут с первой дозой rAAV GTx. Системное повторное введение того же и, вероятно, других серотипов вектора rAAV будет невозможно из-за сильного, стойкого и перекрестного ответа антител, который проявляется после введения первой дозы rAAV GTx. Профилактические стратегии, позволяющие обойти эту проблему в будущем, в настоящее время изучаются в клинических испытаниях¹¹⁴.

В настоящее время значительная часть пациентов с предсуществующими NAbs, вероятно, будет исключена из клинических испытаний или лечения GTx. Следовательно, в настоящее время изучаются различные стратегии для преодоления этой проблемы. Они в целом делятся на подходы, связанные с GTx, и подходы до лечения,^72,115 как представлено в таблице 2.

Table 2. Investigative strategies to mitigate the effect of pre-existing anti-AAV antibodies in patients

Подходы, связанные с GTx, включают использование более высоких доз GTx,^72,116,117 совместное введение пустых "ложных" капсидов,^{72,97,115,116} локальную доставку в целевой орган или ткань,^{43,47,115,116,118} использование альтернативных капсидов или маскировку капсида rAAV.^72,115,119 Эти стратегии направлены на ограничение иммунного устранения вектора и снижение восприимчивости к NAbs. Стратегии, связанные с предварительным лечением, направлены на подавление гуморального иммунного ответа путем снижения выработки антител (например, с помощью иммуносупрессивных препаратов),^{16,47,97,116,120,121} или путем снижения уровня сывороточного IgG с помощью плазмафереза,^{47,115,116,122,123} пре-кондиционирования IgG-деградирующим ферментом некоторых видов стрептококков (IdeS или IdeZ),^124,125 и ингибирования рецептора неонатального кристаллизуемого фрагмента (FcRn),^126,127. В конечном итоге, для преодоления влияния уже существующих AAV NAbs у пациентов, которые в противном случае не могли бы быть допущены к AAV-опосредованной GTx, может потребоваться сочетание альтернативных вариантов AAV, альтернативных путей введения с минимальным иммунным воздействием и методов снижения уровня анти-AAV NAb с помощью физических методов или фармакологической модуляции гуморального иммунного ответа.⁴⁷ Сроки, дозировка и применение подходов к иммунной модуляции, таких как IdeS, должны быть адаптированы к конкретным серотипам AAV для оптимизации трансдукции.^128,129

Основное предполагаемое применение rAAV GTx - это однократное лечение; ожидается, что высокие и стойкие уровни NAb после введения вектора сделают повторное введение особенно сложным. Однако повторное введение rAAV GTx может оказаться необходимым в некоторых клинических сценариях, таких как миопатия на ранних стадиях или в тканях с повышенной текучестью. В настоящее время изучаются профилактические стратегии в качестве дополнительной терапии для снижения образования NAb и обеспечения возможности повторного введения препарата в более поздние сроки, и предварительные результаты обнадеживают.^124,130-134 Для обеспечения возможности повторного введения rAAV GTx может потребоваться комбинация подходов, чтобы достаточно снизить уровень NAb или обеспечить профилактическое ингибирование образования антител при первом воздействии.¹¹⁵

Точное и надежное определение анти-AAV антител до системного введения при GTx является важным моментом в отношении эффективности и безопасности терапии. Консервативные критерии отбора (в том числе слишком строгие критерии определения титров) могут исключить пациента из потенциально преобразующего или спасающего жизнь лечения. И наоборот, слишком мягкие критерии включения могут сделать лечение неэффективным или иметь потенциальные последствия для безопасности. В настоящее время не существует универсального метода определения клинически значимого уровня антител. Используются либо TI, либо TAb анализы, оба имеют свои преимущества и потенциальные недостатки. В целом, анализ TI фокусируется на клинически значимом параметре ингибирования трансдукции, и поэтому обеспечивает прямое измерение антител, которые могут повлиять на результат rAAV GTx. Однако он требует большего опыта и усилий для внедрения в рутинное клиническое использование. В отличие от этого, анализ TAb выявляет как NAbs, так и non-NAbs и является менее сложным для внедрения и автоматизации. Официальное одобрение регуляторами анализов на анти-AAV антитела в качестве CDx тестов подтвердит их пригодность для конкретных rAAV GTx. При разработке биоаналитической стратегии для конкретного rAAV GTx характеристики двух типов анализов следует рассматривать в контексте конкретной конструкции вектора, дозы вектора, способа введения, показаний к заболеванию, популяции пациентов и размера популяции пациентов.

Стандартизация труднодостижима в рамках и между анализами TI и TAb по нескольким причинам, включая, но не ограничиваясь, отсутствием стандартизации критических компонентов анализа, различиями в обработке образцов и процессах, и отсутствием согласованных аналитических процедур. Поэтому сравнение данных по анти-AAV антителам, полученных в рамках различных программ rAAV GTx, является весьма сложной задачей. Подробные отчеты о параметрах анализа наряду с результатами будут полезны для сообщества, чтобы использовать полученные знания в разных программах. Кроме того, ожидается, что межлабораторные программы, которые сравнивают и анализируют критические атрибуты качества вирусных векторов и разрабатывают физические эталонные материалы, могут улучшить согласованность измерений в отрасли¹³⁵.

Наличие ранее существовавших NAbs против AAV может иметь значительные последствия для пациентов и их семей. Серопозитивный пациент может быть лишен права на получение потенциально важного лечения, в то время как пациент с отрицательным результатом анализа на NAbs все еще подвержен потенциальному риску конверсии серотипа до начала GTx (например, во время фазы обкатки или отсроченного лечения в рамках клинического испытания, или между тестированием на соответствие критериям и дозировкой лицензированного GTx). В настоящее время ведутся исследования, направленные на поиск потенциальных решений для пациентов с анти-AAV антителами, которые в настоящее время не могут получать rAAV GTx.