Генная терапия обладает огромным потенциалом в лечении генетических заболеваний. В отличие от традиционной медицины, которая лечит только симптомы, ее эффективность заключается в устранении генетического корня проблемы. Исправляя мутации, генотерапия способна излечивать наследственные заболевания. Sherkow et al. [1] определили генотерапию как "преднамеренное, ожидаемое постоянное и специфическое изменение последовательности ДНК клеточного генома с клинической целью". Первая одобренная генотерапия была проведена в 1990 году, когда в иммунные клетки ребенка был введен чужеродный ген [2]. Впервые генотерапия была применена в виде вставки ДНК в геном хозяина [3]. В 2000-х годах были разработаны инструменты, позволяющие вводить модификации в специфические целевые участки генома, в том числе нуклеазы с цинковыми пальцами (ZFN) [4] и нуклеазы с эффекторами, подобными активаторам транскрипции (TALEN) [5].

Важной вехой в развитии генотерапии стало открытие в 2012 году системы CRISPR/Cas9. Эта система включает нуклеазу Cas9, которая индуцирует двухцепочечный разрыв ДНК в определенном месте генома. Cas9 направляется на нужную последовательность в геноме с помощью направляющей РНК. Эта направляющая представляет собой одну нить РНК, комплементарную последовательности из 18-24 нуклеотидов (нт) в геноме [6,7]. Когда комплекс фиксируется на комплементарной последовательности ДНК и Cas9 распознает protospacer adjacent motif (PAM), происходит активация комплекса. Последовательность PAM зависит от микроорганизма, из которого происходит Cas9. Например, наиболее широко используемый Cas9 происходит от Streptococcus pyogenes (SpCas9) и распознает PAM 5'-NGG-3' [8]. После распознавания этой небольшой последовательности Cas9 перерезает последовательность за 3 нт перед PAM [9]. Затем клетка восстанавливает свою ДНК путем негомологичного концевого соединения (NHEJ), микрогомологичного концевого соединения (MMEJ) или гомологично направленной репарации (HDR). NHEJ - это неточный механизм, при котором происходит соединение разорванных концов ДНК, что часто приводит к вставкам или делециям нуклеотидов [10]. MMEJ также является неточным механизмом, который может приводить к нежелательным вставкам, делециям и даже транслокациям [11]. Этот механизм работает за счет выравнивания коротких гомологичных последовательностей, находящихся между разорванными концами [12,13]. HDR восстанавливает повреждение с помощью гомологичной донорской ДНК, что приводит к точному восстановлению в месте пореза [10].

Эволюция и совершенствование технологии CRISPR/Cas9 привели к развитию редактирования оснований. Эта система существует в трех вариантах: редакторы цитозиновых оснований (CBE) [14], редакторы адениновых оснований (ABE) [15] и редакторы оснований от C до G (CGBE) [16]. CBE может устанавливать мутации C -> T и G - > A, ABE может вызывать мутации A -> G и T -> C [17], а CGBE может генерировать трансверсии C-to-G [16,18]. Эти редакторы изменяют все предполагаемые пары оснований в точном окне (например, CBE переключает все пары оснований C-G, расположенные в окне, на пары оснований T-A). По сравнению с CRISPR/Cas9 преимущества этой технологии заключаются в том, что редактирование оснований не требует двухцепочечного разрыва (в системе используется модифицированнfz D10A Cas9) и не нуждается в экзогенном ДНК-шаблоне, что приводит к уменьшению количества нежелательных indels. Редактирование оснований также приводит к гораздо более точной коррекции мутации за счет способности нацеливаться на конкретный кодон. Однако эти системы [19] не могут быть применены в тех случаях, когда изменение пары оснований в рамке (отличной от желаемой) приведет к несильной мутации.

В октябре 2019 года группа David R. Liu’s опубликовала выдающееся открытие, получившее название "prime editing" [20]. Эта система может осуществлять целевые вставки, делеции и все 12 возможных переходов от основания к основанию. Этот механизм позволяет модифицировать ДНК с беспрецедентной точностью и имеет существенные преимущества перед традиционными системами CRISPR/Cas9 и редактированием оснований (табл. 1). Производная от системы CRISPR/Cas9, новая технология состоит из нуклеазы Cas9, соединенной с обратной транскриптазой (RT) на ее 3' конце и направляющей РНК для редактирования оснований (pegRNA) (рис. 1). Сочетание Cas9 и RT образует праймер-редактор (PE). PegRNA состоит из спейсерной последовательности, сайта связывания праймера (PBS), шаблона обратной транскриптазы (RTT) и общего участка, который связывается с Cas9 и RT [19]. Сначала комплекс связывается с ДНК, ориентируясь на спейсерную последовательность в pegRNA. Cas9 распознает PAM и делает разрез на 3 нт выше по течению. Однако вместо двухцепочечного разреза модифицированный H840A Cas9 из праймерного редактирования вызывает одноцепочечный nick [20]. Затем PBS гибридизуется со своей комплементарной последовательностью, расположенной на разрезанной нити. Затем RTT использует RTT в качестве шаблона для транскрипции вырезанной части нити. В этот момент одна из нитей имеет дублированный участок, поэтому клетке придется удалить один из двух участков, чтобы снова собрать двухцепочечную ДНК. Несоответствие будет устранено 5' или 3' заслонкой. Если действует 3' заслонка, то коррекция будет сохранена, но если возникнет 5' заслонка, то редактирование будет потеряно [20].



Figure 1. Prime editing mechanism. Step 1: Guided by the spacer sequence in the pegRNA, the Cas9 fused with a reverse transcriptase (RT) binds to the DNA at the desired place in the genome. The Cas9 recognizes a PAM and induce a single-stranded nick 3 nt upstream. Step 2: The PBS hybridizes to its complementary sequence on the cut strand. Step 3: The RT will use the RTT as a template to transcribe the cut strand. Step 4: Mismatches will be repaired by a 5' flap or a 3' flap.

Для внесения каких-либо модификаций необходимо ввести желаемую коррекцию в последовательность RTT, поскольку она служит шаблоном для транскрипции. В настоящее время существует несколько версий редактора prime, наиболее популярными из которых являются PE2 и PE3. PE3 аналогичен PE2, но имеет дополнительную направляющую РНК, которая индуцирует зарубку на нити, изначально не перерезанной Cas9. Это способствует замене неотредактированной нити, заставляя клетку использовать отредактированную нить в качестве шаблона. Это повышает вероятность сохранения редактирования на этапе устранения несоответствия. Когда задается позиция, она определяется в соответствии с референсной системой, основанной на начальном сайте расщепления Cas9. Таким образом, нуклеотиды ниже по течению от этого сайта будут иметь положительную позицию (например, +5 означает пять нуклеотидов после сайта разреза в направлении 3'), а нуклеотиды выше по течению от сайта разреза - отрицательную (например, -5 означает пять нуклеотидов перед сайтом разреза в направлении 5').

Таблица 1. Сравнение преимуществ и недостатков систем CRISPR/Cas9, редактирования оснований и prime editing.

Поскольку prime editing может вводить вставки, делеции и все типы замен, оно способно исправить любую мутацию, вызывающую наследственное заболевание. Прайм-редактирование также позволяет генерировать клеточные линии или животные модели для конкретных мутаций, что способствует развитию исследований по ряду генетических заболеваний. В данном обзоре обобщены результаты до-клинических исследований по использованию прайм-редактирования для генотерапии человека. На сегодняшний день прайм-редактирование было применено для лечения наследственных заболеваний печени, глаз, кожи, мышц, нейродегенеративных заболеваний, а также муковисцидоза, бета-талассемии, Х-сцепленного тяжелого комбинированного иммунодефицита и рака. Мы также обсуждаем лучшие стратегии, использованные в этих исследованиях, чтобы направить будущие эксперименты по исправлению патогенных мутаций путем прайм-редактирования.

Существует несколько опубликованных работ, посвященных исправлению методом прайм-редактирования мутаций, вызывающих заболевания печени, или созданию животных моделей с такими мутациями (табл. 2). Заболевания печени действительно являются в настоящее время наиболее изученным направлением генотерапии человека методом прайм-редактирования.

Table 2.  Prime editing studies on correcting or introducing mutations causing liver diseases.

Schene et al. [24] первыми в 2020 г. опубликовали оригинальную статью о прайминге для лечения заболеваний печени. Они генерировали органоиды модели заболевания с помощью прайм-редактирования и ставили своей целью коррекцию моделей заболевания, полученных от пациентов, с помощью прайм-редактирования. Сначала авторы ввели делецию длиной 6 nt в ген CTNNB1, которая может приводить к раку печени. Используя систему PE3 и pegRNA, состоящую из 20-нуклеотидного спейсера, 12-нуклеотидного PBS и 17-нуклеотидного RTT, они ввели в органоиды печени делецию в позиции +1 в 30% клеток. Используя PE3 и "тихую" мутацию в PAM (чтобы избежать повторного прайм-редактирования уже отредактированного аллеля), они ввели замену A -> G (в позиции +7 в pegRNA) в 20% клонов органоидов печени в гене ABCB11, вызывающем дефицит насоса экспорта желчных солей. Далее авторы попытались исправить мутации в полученных от пациента клетках кишечника и органоидах печени. Используя PE3, они успешно исправили 21% S210del в гене DGAT1. Однако для коррекции мутации R1153H в гене ABCB11 и мутации E342K в гене SERPINA1 в органоидах печени, полученных от пациента, редактирования не было получено. В работе использовалась система PE3, но авторы отметили, что не проводили оптимизацию дизайна pegRNA, что очень важно для хорошей эффективности праймового редактирования.

Liu et al. [25] также опубликовали работу, посвященную праймерному редактированию при заболеваниях печени. Они работали над исправлением мутации E342K в гене SERPINA1, вызывающей дефицит альфа-1-антитрипсина (A1AT). Мутация E342K является наиболее распространенной мутацией, вызывающей это заболевание. Это та самая мутация, которую не удалось исправить Schene et al [24], что подчеркивает важность оптимизации дизайна pegRNA. Liu et al. [25] впервые использовали PE2 для введения мутации в клетки HEK293T. Классический PE2 требует наличия NGG PAM. К сожалению, вблизи редактируемого участка их не оказалось. Поэтому они выбрали более удаленный. Их pegRNA имела 20 нт спейсер, 13 нт PBS и 27 нт RTT. Эта pegRNA и PE2 обеспечили лишь 1,9% редактирования в клетках HEK293T. Однако при использовании той же pegRNA и PE3 было достигнуто 9,9% редактирования. При использовании этой pegRNA и PE* [25] (PE с оптимизацией сигнала ядерной локализации) они получили 6,4% редактирования при использовании PE2* и 15,8% при использовании PE3*. Затем они попытались исправить in vivo мутацию у мышей PiZ [25] (мышиная модель мутации E342K в гене SERPINA1). Для этого плазмидную ДНК праймера редактирования вводили с помощью гидродинамической инъекции в хвостовую вену. С помощью PE2 они получили 2,1% редактирования, а с помощью PE2* - 6,7%. Поскольку емкость AAV составляет не более 5 кб [32], прайм-редактирование не может быть осуществлено с помощью одного AAV. Для решения этой проблемы авторы опробовали доставку сплит-интеиновых прайм-редакторов с помощью AAV путем инъекции в хвостовую вену. При введении низкой дозы двойного AAV8-PE3 (2 x 10¹¹ вирусного генома) они обнаружили 0,6% редактирования через две недели, 2,3% через шесть недель и 3,1% через десять недель. Однако авторы предположили, что поскольку PAM находится далеко от редактируемого участка, эффективность праймированного редактирования не максимальна и что использование более близкого PAM приведет к большей эффективности.

В том же месяце, когда Liu et al. [25] опубликовали свое исследование, Habib et al. [26] опубликовали статью о прайм-редактировании в hiPSCs (индуцированных плюрипотентных стволовых клетках человека), создав платформу для прайм-редактирования с помощью доксициклин-индуцируемого препарата. Они также попытались исправить путем прайм-редактирования мутацию E342K (1024 G > A) в гене SERPINA1 в hiPSCs, полученных от пациента с дефицитом альфа-1-антитрипсина (A1AT). Сначала авторы продемонстрировали возможность создания клеточных линий hiPSC, содержащих желаемую мутацию в локусе HEK3 и RNF2, с помощью платформы для редактирования праймеров с использованием PE3, индуцируемой доксициклином. Аналогичные выводы они получили, сравнивая свои конструкции pegRNA для этих локусов с результатами, полученными в hiPSCs группой David Liu’s (создателей прайм-редактирования) в клетках HEK293T. Например, обе группы пришли к выводу, что по сравнению с локусом HEK3 эффективное праймерное редактирование сайта RNF2 требует более длинной последовательности PBS. Этот вывод позволяет предположить, что оптимальная длина PBS зависит от последовательности и, следовательно, может иметь одинаковую оптимальную длину даже при использовании в разных типах клеток. Кроме того, на целевом сайте HEK3 в hPSCs возможны переходные замены (положение от +1 до +33), трансверсионные замены (положение от +1 до +33), небольшиеindels (1-3 п.н. в положении +10), крупные делеции (до 80 п.н.) и крупные инсерции (до 42 п.н.). Однако Habib et al.’s [26] не смогли ввести небольшие indels в позициях +17 и +21 для мутации в гене RNF2.

Еще одним интересным аспектом исследования Habib et al.’s [26] является раздел, объясняющий, почему система PE3 генерирует индельные мутации. Чтобы понять, что является главным фактором, авторы протестировали пять различных сценариев: одиночный DSB, индуцированный Cas9 дикого типа (wt) и sgRNA, одиночный nick, индуцированный nCas9-RT и sgRNA, двойной DSB, индуцированный wt Cas9 и двумя sgRNA, двойной nick, индуцированный nCas9-RT и двумя sgRNA, и, наконец, система PE3 (двойной nick, индуцированный nCas9-RT, одной pegRNA и одной sgRNA). На основании этого эксперимента авторы пришли к выводу, что непреднамеренные indels возникают не непосредственно в результате двойного nicking, а под действием комбинации RT и pegRNA.

Последний раздел статьи посвящен коррекции методом прайм-редактирования мутации E342K в гене SERPINA1 в hiPSCs, полученных от пациента с дефицитом A1AT. Результаты показали лишь очень низкую эффективность редактирования (0,83%), которая была сопоставима с редактированием, выполненным ABE. Низкая эффективность редактирования может быть обусловлена низкой эффективностью трансфекции.

В ноябре 2021 года Genesis Lung опубликовал диссертацию [27], посвященную коррекции методом прайминг-редактирования мутации E342K в гене SERPINA1, вызывающей дефицит A1AT. Lung работал над той же мутацией, что и Schene et al [24], Liu et al [25] и Habib et al [26], работы которых были описаны выше. Последние три упомянутых автора не смогли продемонстрировать обнаружируемую коррекцию мутации [25]. Они использовали PE, требующий NGG PAM, из-за чего целевой нуклеотид находился далеко от места разреза, что препятствовало хорошей эффективности. В своей оригинальной работе Anzalone et al. [20] предложили длину RTT от 10 до 16 нт, что значительно короче, чем использовали Liu et al. Lung [27] попытался исправить мутацию E342K в гене SERPINA1 с помощью прайм-редактора, используя другой PAM. Сначала он сконструировал вариант праймерного редактора, который мог использовать различные PAM (NGG, NGA, NGC) и конъюгировать их с pegRNAs, имеющими различные длины PBS (13 или 17 нт) и RTT (от 10 до 20 нт). Liu достиг до 3% редактирования вариантов с использованием NGA PAM в клетках HEK293T, содержащих лентивирусную кассету с мутацией E342K. Лучшая pegRNA имела спейсер 20 нт, PBS 13 нт и RTT 20 нт. При использовании PE3 он достигал 3 - 5% редактирования. Эти эксперименты проводились путем трансфекции ДНК плазмид с помощью Lipofectamine 2000. Он также пытался трансфицировать компоненты праймерного редактирования в форме РНК, что может повысить эффективность [33]. Однако в данном случае эффективность существенно не отличалась при использовании ДНК или РНК. Далее он попытался исправить мутацию E342K в первичных фибробластах человека. Используя NGA-PE2, он получил 1,99% редактирования. В своей диссертации Лунг также описал, что избыточная экспрессия гена экзонуклеазы 2 (TREX2) может снижать эффективность редактирования прайма. Было показано, что этот ядерный белок обладает 3'-5' экзонуклеазной активностью [34]. Поскольку не-инженерные pegRNA очень чувствительны к деградации экзонуклеазой, присутствие TREX2 может снижать эффективность редактирования праймера за счет деградации pegRNA с их 3' конца, что уменьшает доступное количество pegRNA. Следовательно, нокаут этого гена может способствовать праймингу. Следует отметить, что магистерская диссертация Lung’s не является рецензируемой статьей. Поэтому к полученным результатам следует относиться с осторожностью.

Böck et al.[28]. работали над редактированием двух других локусов - dnmt1 и Pahenu2, которые кодируют белки, экспрессирующиеся в печени. Сначала они протестировали два варианта редактора prime - расщепленный по целому локусу PE2ΔRnH [28] и его нерасщепленный вариант. Расщепленная версия доставлялась с помощью AAV8, а нерасщепленная, более крупная, - с помощью аденовирусного вектора человека 5 (AdV). Последний вирус может содержать больший груз, но он гораздо более иммуногенен. С помощью расщепленного варианта удалось достичь 15% редактирования локуса dnmt1 in vivo. Предполагая, что нерасщепленная версия даст лучший результат, авторы также протестировали ее in vivo и получили гораздо лучшие результаты, когда праймер редактора не был расщеплен. У новорожденных мышей они получили 58,2% редактирования, у взрослых мышей - 35,9%. Далее они протестировали коррекцию мутации в локусе Pahenu2 (F263S, c.835T > C), которая приводит к фенилкетонурии - заболеванию печени. Сначала они протестировали свои pegRNAs в клеточной линии HEK293T, в которую был стабильно интегрирован экзон 7 аллеля Pahenu2. Две лучшие конструкции имели спейсер 20 нт, PBS 13 нт и RTT 16 или 19 нт. Эти две pegRNAs приводили к редактированию почти до 20%. При этом pegRNA с RTT длиной 19 нт имела меньшее количество нецелевых эффектов, поэтому именно эта pegRNA была выбрана для экспериментов in vivo. Для экспериментов in vivo использовалась мышиная модель фенилкетонурии (модель мыши Pahenu2 [28]). Сначала с помощью расщепленной версии праймера, доставляемого с помощью AAV8, были получены скудные результаты (менее 1% с PE2 и менее 2% с PE3). Затем использовали нерасщепленную версию прайм-редактора, доставляемую AdV. При использовании версии PE2 на взрослых мышах они получили только 2% редактирования. Однако при обработке новорожденных мышей результаты оказались лучше. При использовании PE2 они получили 6,9% редактирования, а при использовании PE3 - 11,1%. Этот процент оказался достаточным для терапевтического снижения уровня фенилаланина в крови, не вызывая даже обнаруживаемых внецелевых мутаций и не приводя к длительному воспалению печени. Полученные результаты обнадеживают. Основная проблема этого проекта, связанная с его клинической трансляцией, заключается в том, что они доставляют огромную дозу вируса (7 х 10¹⁴ векторных геномов/кг). Помимо того, что это очень дорого, использование такого количества вируса приводит к индукции иммунной системы. Однако они отметили, что процент отредактированных гепатоцитов сохраняется даже через 12 недель после инъекции.

Jiang et al. [29] оптимизировали прайм-редактирование для удаления и замены длинных геномных последовательностей. Авторы объединили PE с двумя pegRNA и назвали этот метод делецией и репарацией на основе PE-Cas9 (PEDAR). Они протестировали свой метод для удаления патогенной вставки размером 1,38 кб в гене FAH в мышиной модели тирозинемии и замены ее на последовательность длиной 19 п.н. Они успешно удалили фрагмент и отремонтировали делеционный переход, восстановив экспрессию FAH в печени. Они обнаружили FAH-экспрессирующие гепатоциты на срезах печени, обработанных PEDAR, и получили 0,76% коррекции. Даже если это мало, отредактированные гепатоциты получили преимущество в росте и в конечном итоге заселили печень. Действительно, через сорок дней после лечения на срезах печени мышей, обработанных PEDAR, наблюдались широко распространенные пятна FAH, а отредактированные гепатоциты имели нормальную морфологию.

Kim et al. [30] также работали над наследственной тирозинемией 1-го типа. Они изучали исправление методом прайм-редактирования точечной мутации G -> A (позиция +10 в их pegRNA) в гене FAH в химически полученных печеночных предшественниках (CdHs) из мышиной модели наследственной тирозинемии (мыши HT1) [30]. После лечения методом прайм-редактирования эти клетки были привиты в печень мышей HT1 для изучения репопуляции печени исправленными клетками. Сначала авторы сгенерировали CdHs из мышей HT1. Затем они электропорацией ввели в клетки PE3, sgRNA nicking в положении -4, и pegRNA, содержащую спейсер длиной 20 нт, PBS длиной 11 нт и RTT длиной 15 нт. В результате было получено 2,3% редактирования без каких-либо off-target эффектов. Далее авторы проверили возможность терапевтической трансплантации ex vivo исправленной популяции клеток HT1-mCdHs-PE3b (химически полученных печеночных предшественников, полученных от мышей HT1 и обработанных PE3b) в печень мышей HT1. Поскольку массовая популяция клеток обладала достаточной эффективностью редактирования, выделение клеточных клонов не требовалось. Таким образом, в печень мышей HT1 была непосредственно привита массовая популяция обработанных клеток. Пересаженные мыши HT1-mCdHs-PE3b прожили более 160 дней, по сравнению с контрольными мышами, которым вводили PBS, и которые погибли до 90 дней. Повреждения печени у пересаженных мышей также значительно уменьшились. Через 140 дней авторы показали, что популяция FAH-позитивных клеток в печени, пересаженной HT1-mCdHs-PE3b, вновь заселила печень. Вследствие репопуляции этих клеток процент редактирования в печени увеличился с 2,3 до 34,3%.

Jang et al. [31] также исследовали исправление путем прайм-редактирования мутации в гене FAH. Они работали с точечной мутацией G > A в последнем нуклеотиде экзона 8. Эта мутация вызывает пропуск экзона 8 и приводит к потере функции FAH, что является причиной наследственной тирозинемии 1-го типа. Сначала они протестировали несколько pegRNA в клетках HEK293T, содержащих целевую последовательность мутантного Fah. Лучшая из них имела спейсер длиной 20 нт, а редактирование происходило в позиции +10 от места разреза. Используя PE2, они получили 18,7% редактирования in vitro. Далее они испытали свою pegRNA in vivo на мышиной модели наследственной тирозинемии 1-го типа (Fahmut/mut). Авторы испытали как PE2, так и PE3. Первой хорошей новостью стало то, что обработанные мыши дожили до конца экспериментального периода (40 дней для опытов с PE3 и 60 дней для опытов с PE2), в отличие от больных контрольных мышей, у которых наблюдалась значительная потеря веса и они погибли до 30-го дня эксперимента. Эти результаты показали, что лечение предотвращало потерю веса мышей и продлевало их выживание. Количественный анализ проводился после жертвоприношения мышей. У мышей Fah^mut/mut, обработанных PE3, было обнаружено, что 12% мРНК Fah содержали экзон 8, по сравнению с контрольными Fah^mut/mut, у которых его не было. Была также проведена количественная оценка частоты FAH+ клеток в печени. На 40-й день у мышей, обработанных PE3, количество FAH+ клеток составляло в среднем 61%. На 60-й день у мышей, обработанных PE2, количество FAH+ клеток составляло в среднем 33%. Также определяли процент редактирования методом глубокого секвенирования. У мышей, обработанных PE3, наблюдалось 11,5% редактирования, а у мышей, обработанных PE2, - 6,9%. Этот процент был ниже, чем частота FAH+ клеток, поскольку большинство гепатоцитов полиплоидны [35] и поскольку ДНК гепатоцитов была смешана с ДНК непаренхимальных клеток. Поэтому частота FAH+ клеток более показательна для клинического улучшения. Авторы также исследовали наличие indels на целевом нуклеотиде или вблизи него, а также в потенциальных off-target сайтах pegRNA. Мутаций вне мишени обнаружено не было.

Одним словом, при заболеваниях печени прайм-редактирование было использовано для исправления мутаций, вызывающих дефицит DGAT1, дефицит насоса для экспорта желчных солей, дефицит альфа-1-антитрипсина, фенилкетонурию и тирозинемию 1-го типа. Прайм-редактирование также использовалось для создания клеточных и животных моделей рака печени, дефицита насоса для экспорта желчных солей, дефицита альфа-1-антитрипсина, а также заболевания печени, вызванного мутацией в гене DNMT1.

Разработка метода прайм-редактирования для лечения наследственных заболеваний глаз может быть ускорена из-за ограниченности местной доставки терапевтических агентов. Глаз стал первым органом человека, на котором в клинических испытаниях была применена технология CRISPR/Cas9 [36]. Поэтому интересно рассмотреть до-клинические исследования прайм-редактирования для коррекции наследственных заболеваний глаз (табл. 3).

Таблица 3. Исследования прайм-редактирования по исправлению или введению генетических мутаций, вызывающих заболевания глаз.

Помимо работ по праймированию мутации FAH, Jang et al. [31] изучали праймирование мутации R44X, вызывающей врожденный амавроз Лебера (LCA). Эта мутация представляет собой переход C > T в экзоне 3 гена RPE65 и приводит к дегенерации сетчатки и тяжелому раннему ухудшению зрения [39,40]. Jang et al. [31] впервые протестировали несколько pegRNAs, нацеленных на мутацию R44X, в клетках HEK293T. Лучшая pegRNA имела спейсер 19 нт, PBS 9 нт и RTT 14 нт. Используя PE2, они получили 14% редактирования in vitro. Далее pegRNA были протестированы in vivo на мышах rd12 - мышиной модели LCA, связанной с RPE65. Они проводили субретинальные инъекции транс-сплайсинговых AAV (серотип 2), кодирующих PE2 и pegRNA. В результате было получено 6,4% редактирования. Учитывая, что только 23% пигментного эпителия сетчатки получило AAV, авторы оценили эффективность редактирования в областях, подвергшихся воздействию компонентов прайм-редактирования, в 28%. У мышей LCA, получавших праймерное редактирование, также наблюдалось улучшение зрительных функций. Они продемонстрировали высокую точность редактирования, поскольку вблизи места мутации или на уровне геномной ДНК не было обнаружено непреднамеренных правок, замен или indels.

В работе Lin et al. [37] изучалась генерация путем прайм-редактирования мышиной модели с заболеванием катаракты. Сначала они протестировали прайм-редактирование на клетках мышиного нейро-2а (N2a). Они использовали PE3 с pegRNA, удаляющей 1 п.н. (G) в экзоне 3 гена crygc. Эта мутация приводит к образованию усеченного белка гамма-кристаллина, который вызывает ядерную катаракту у гомозиготных и гетерозиготных мутантных мышей. Для pegRNA использовали спейсер длиной 20 нт, PBS длиной 13 нт и RTT длиной 10 нт. Дополнительная sgRNA осуществляла nicking на 25 п.н. ниже места разреза. Авторам удалось внедрить эту делецию в 80% клеток. Далее они попытались создать модель мыши с заболеванием катаракты, вызванным делецией нуклеотида G в экзоне 3 гена crygc. В эмбрионы мышей были сделаны микроинъекции плазмиды прайм-редактирования (той же, что использовалась в первом эксперименте). В результате была получена мышь с высокой степенью делеции G (38,2%), у которой наблюдался фенотип ядерной катаракты. Они также показали, что эта мутация может передаваться в последующих поколениях и что потомство фенотипически наследует катаракту. Авторы также проверили наличие внецелевых indels и мутаций, но не обнаружили их. Lin et al. [37,38] также попытались восстановить эту делецию в клеточной линии N2a, содержащей G-делецию. С помощью PE3 им удалось исправить эту делецию в 33% клеток.

Lv et al. [38] работали над исправлением методом праймирования c. 2234_2237del в ORF15 RPGR, вызывающего Х-сцепленный пигментный ретинит (XLRP) - заболевание, приводящее к слепоте. Авторы использовали усовершенствованный праймер, в котором 20 нт сайта узнавания Csy4 были объединены с pegRNA. Это позволило уменьшить комплементарную пару между PBS на 3' конце pegRNA и частью спейсера на 5? конце pegRNA. Для pegRNA использовали спейсер длиной 20 нт, PBS длиной 14 нт и RTT длиной 14 нт. Обработав этими конструкциями клетки HEK293-mRO (клетки, имеющие c. 2234_2237del), они получили 12,05% редактирования.

Hong et al. [41] работали над исправлением методом прайм-редактирования двух мутаций (c.3631C > T и c.2005C > T) в гене COL7A1, вызывающих рецессивный дистрофический буллезный эпидермолиз (RDEB). Эти мутации вызывают потерю функции белка коллагена VII типа (С7) и приводят к хрупкости кожи. Праймирование проводилось ex vivo на фибробластах, полученных от пациента, после чего они были трансплантированы иммунодефицитным мышам. Для праймирования авторы использовали PE3 и pegRNA, содержащую 22 нт спейсер, 13 нт PBS и 14 нт RTT (табл. 4). Помимо исправления мутации, pegRNA также вводили в "молчащую" мутацию в PAM. Для первой мутации (c.3631C > T) редактирование проводилось на 10 нт ниже по течению от сайта nicking, а sgRNA nicked на 60 нт ниже по течению. Для второй мутации (c.2005C > T) редактирование проводилось на 12 пт ниже по течению от сайта nicking, а sgRNA nicked на 56 пт выше по течению. Авторы успешно исправили 10,5% клеток, содержащих первую мутацию, и 5,2% клеток, содержащих вторую мутацию. In vitro уровень экспрессии белка С7 достигал 55% в лизатах клеток и 37% в супернатанте культуры. Адгезионные свойства фибробластов и способность к пролиферации (которые снижаются при потере функции этого белка) также были улучшены в отредактированных фибробластах. Поскольку коррекция первой мутации оказалась наиболее эффективной, этап трансплантации in vivo проводился только с этими клетками. Таким образом, восстановление функции белка можно было изучить in vivo. Во-первых, после внутрикожной инъекции белок локализуется правильно, т.е. в дермально-эпидермальном соединении (DEJ). Через две недели после инъекции было обнаружено, что человеческий белок C7 функционирует и локализуется линейно в DEJ.

Таблица 4. Праймерные исследования по исправлению или введению генетических мутаций, вызывающих кожные заболевания.

Затем авторы восстановили трансплантаты человеческой кожи из полученных от пациента кератиноцитов и фибробластов на спине иммунодефицитных мышей. Этот эксперимент продемонстрировал, что в результате генной коррекции кожи восстановилось отложение белка С7 и образование якорных фибрилл в DEJ. Было показано, что уровень экспрессии белка С7 в 35% достаточен для обеспечения механической стабильности кожи в гипоморфной мышиной модели DEJ [43]. Hong et al. [41] восстановили экспрессию белка С7 до 49%, что означает, что лечение может быть достаточно эффективным для обеспечения терапевтического улучшения. Авторы также отметили, что белок правильно депонировался вдоль DEJ и что отредактированные фибробласты демонстрировали повышенную пролиферацию по сравнению с не-редактированными клетками. Последнее обстоятельство может объяснить, почему уровень восстановления С7 выше, чем ожидаемый процент от частоты редактирования на уровне геномной ДНК.

Petri et al [42] изучали введение путем прайминг-редактирования мутации P301L в гене TYR (P302L у рыбок данио). Эта мутация ответственна за окулокожный альбинизм и не может быть введена в клетки с помощью редактирования оснований. В данном исследовании использовалась стратегия PE3, а компоненты редактирования оснований доставлялись в виде рибонуклеопротеидов (RNP). Соотношение pegRNA:PE-белок составляло 4:1, а молярное соотношение pegRNA/sgRNA - 10:1. Использовали pegRNA со спейсером 20 нт, PBS 10 нт и RTT 15 нт. Сайт редактирования находился в позиции +3, а сгРНК, использованная для PE3, разрезала позицию ?83. Такая комбинация позволила получить 8% редактирования. Однако Петри и др. [42] наблюдали значительное количество непреднамеренных indels. В некоторых эмбрионах наблюдались делеции, инсерции, замены, потенциальные дупликации RTT и потенциальные встраивания лески pegRNA.

Возможности прайм-редактирования были опробованы на двух мышечных заболеваниях: Мышечной дистрофии Дюшенна, вызванной мутацией в гене DMD, и спинальной мышечной атрофии, вызванной мутацией в гене SMN2 (табл. 5).

Chemello et al. [44] работали над генотерапией мутаций в гене DMD с целью индуцирования пропусков экзонов для восстановления рамки считывания и, соответственно, экспрессии дистрофина. Они тестировали in vitro pegRNA, содержащую 20 нт спейсер, 13 нт PBS и 15 нт RTT, с PE3 и sgRNA, разрезающей 52 нт ниже по течению. В клетках iPSC ΔEx51 они достигли 54% редактирования. Затем они дифференцировали эти клетки в кардиомиоциты для проверки влияния на восстановление дистрофина. Отредактированные клетки экспрессировали 39,7% дистрофина по сравнению со здоровым контролем. Поскольку в больных клетках наблюдались нарушения аритмии, авторы проверили работу обработанных клеток по сравнению с больными и здоровыми клетками. Клетки показали процент аритмичных кальциевых следов, сопоставимый со здоровыми клетками.

Mbakam et al. [45, 46] работали над исправлением путем прайминг-редактирования различных мутаций в гене DMD, вызывающих мышечную дистрофию Дюшенна. В своей первой статье Mbakam et al. [45] работали над вставкой специфических точечных мутаций в экзоны 9, 20, 35, 43, 55 и 61 гена DMD. Сначала они ввели следующие мутации с помощью PE2 в клетки HEK293T: C -> T в экзоне 9, C -> T в экзоне 35, G -> T в экзоне 20, C -> T в экзоне 43, A- > T в экзоне 55 и C -> T в экзоне 61. pegRNA для экзонов 9, 35 и 55 показали лучшие результаты при использовании PBS 13 нт и RTT 13 нт. Они обеспечили, соответственно, 4, 6 и 3,5% редактирования, а мутации находились, соответственно, в позициях +3, +1 и +3 от места разреза. pegRNA для экзонов 20 и 43 показали лучшие результаты при использовании PBS 13 нт и RTT 10 нт. Мутации находились, соответственно, в позициях +10 и +1 от места разреза, и авторы получили 5 и 3,5%, соответственно, для экзонов 20 и 43. Наконец, для экзона 61 лучшая pegRNA имела PBS 15 нт и RTT 13 нт, а сайт редактирования находился в позиции +5 от зарубки. Эта формула дала 6% редактирования. Далее авторы протестировали редактирование экзона 35 с помощью той же pegRNA, но с использованием стратегии PE3 с sgRNA, нацеленной на +57 нуклеотид от первого сайта зарубки (nick). В результате было получено 20% редактирования желаемой мутации. Кроме того, с помощью той же pegRNA, нацеленной на экзон 35, пытались мутировать PAM, чтобы избежать второго события редактирования праймера на уже отредактированном аллеле. Такая стратегия привела к 14% редактирования при использовании PE2 и 38% редактирования при использовании PE3. Затем авторы исследовали коррекцию путем прайминг-редактирования мутации c.428 G -> A в экзоне 61 гена DMD. Для этой коррекции они использовали PE3 с sgRNA, нацеленной на +60 нт от первого сайта зарубки, и pegRNA с интервалом 20 нт, PBS 14 нт и RTT 16 нт. Сайт редактирования находился в позиции +4 от места разреза. Компоненты прайм-редактирующей программы были введены электропорацией в миобласты человека, полученные от пациента с DMD с мутацией c.428 G -> A. Они получили 8% редактирования после одной обработки и 29% после четырех обработок.

В своей последней статье Mbakam et al. [46] работали над мутацией c.8713C -> T, расположенной в экзоне 59 гена DMD. Сначала они попытались внедрить эту мутацию в клетки HEK293T. Используя PE2 и pegRNA со спейсером 21 нт, PBS 14 нт и RTT 16 нт, они получили 6,5% редактирования. При использовании той же pegRNA, но с помощью PE3 и sgRNA, индуцирующей nick в положении +62, было получено 10,5% редактирования. Поскольку при использовании этой pegRNA редактирование происходило в положении +13, авторы попытались применить праймерный редактор, использующий другой PAM, чтобы место редактирования было ближе к нику. Они попробовали использовать SpCas9n-VQR, который распознает NGAN PAM (где сайт редактирования будет находиться в позиции +1), и SpCas9n-RY, который распознает NNN PAM ( сайт редактирования будет находиться в позиции +3). Даже если редактируемый участок находился ближе к nick, процент редактирования не увеличивался (каждый из них давал 5,5% редактирования). Далее авторы попробовали добавить "молчащую" мутацию в PAM (G -> T в положении +6), чтобы событие редактирования праймера не могло произойти более одного раза на аллель. Эта стратегия увеличила редактирование, достигнув 7,3% в случае PE2 и 11% в случае PE3.

Таблица 5. Исследования прайм-редактирования для исправления или введения генетических мутаций, вызывающих заболевания мышц и сердца.

Далее авторы проверили, может ли модификация нуклеотидов, отличных от PAM, повлиять на эффективность исправления желаемой мутации (в положении +13). Добавив мутацию в положении +19, они получили редактирование 21% желаемой мутации (в положении +13). В сочетании с другими сценариями, когда они мутировали нуклеотиды в других позициях, полученные ими результаты подтверждают, что модификация других нуклеотидов, расположенных рядом, также влияет на редактирование в целевом сайте. К сожалению, мутация, индуцированная в положении +19, не является "тихой" мутацией, поэтому не может быть использована в лечении. Однако мутация в PAM в положении +6 является "тихой" мутацией, поэтому она может быть использована при разработке лечения. Далее они протестировали включение в RTT в общей сложности трех мутаций (целевой мутации в положении +13, мутации в PAM в положении +6 и третьей дополнительной мутации (C -> T) в положении +2). При использовании этой pegRNA с PE2 было получено 28% редактирования нужной мутации (в положении +13). Использование PE3 с этой pegRNA позволило получить 42% редактирования. Авторы также протестировали комбинацию большего количества мутаций в RTT. Они заметили, что процент редактирования снижается при наличии в RTT в общей сложности пяти мутаций. Авторы также хотели проверить, может ли тип нуклеотидной модификации изменить эффективность редактирования. Они попробовали заменить нуклеотид C в позиции +13 на A, G или T. Одновременно они проверили замену нуклеотида T в позиции +3 на C, G или A. Комбинация C -> G в позиции +13 и T -> C в позиции +3 дала наилучший результат - эффективность редактирования составила 58%.

Mbakam et al.[46] также исследовали коррекцию мутации c.8713C -> T в линии клеток миобластов человека, несущих точечную мутацию c.8713C-> T. Они использовали систему PE3 с sgRNA, индуцирующей nick в положении +62, и pegRNA со спейсером 21 нт, PBS 14 нт и RTT 19 нт, содержащей коррекцию желаемой мутации (T -> C), молчащую мутацию в PAM (положение +6 (G -> T) и еще одну мутацию в положении +9 (T -> C). Они получили 17% редактирования для исправления нужной мутации (+13). Также была опробована та же pegRNA, но с использованием системы PE5^max. Система PE5^max позволяет осуществлять транзиторную экспрессию сконструированного белка, ингибирующего mismatch-repair [48]. Было показано, что наличие mismatch-repair ДНК (MMR) снижает эффективность редактирования праймера [49]. Таким образом, ингибирование системы MMR повышает эффективность редактирования праймера [50]. Используя систему PE5^max, Mbakam et al. [46] получили 21% редактирования и наблюдали 42% экспрессии белка DMD.

Qian 2021 et al. [51] изучали прайминг-редактирование при болезни Tay–Sachs. В популяции евреев-ашкенази 80% случаев этого прогрессирующего нейродегенеративного заболевания обусловлены вставкой из четырех оснований (TATC) в экзоне 11 гена HEXA [52]. Авторы ввели эту мутацию в эмбрионы кроликов для создания животной модели этого заболевания. Они получили 15,4% вставок TATC при использовании системы PE2 и 37,5% при использовании PE3 (табл. 6). Лучшая pegRNA имела PBS 12 нт и RTT 14 нт. Ткани кроликов были секвенированы, и в одной из них была определена эффективность мутации 68,17%. Авторы также проверили на наличие эффекта "вне-мишеней", но таковых не обнаружили.

Таблица 6. Исследования по праймовому редактированию для исправления или введения генетических мутаций, вызывающих нейродегенеративные заболевания.

Tremblay et al. [53] работали над введением путем прайм-редактирования защитной мутации (A673T) в гене APP. Было показано, что эта мутация предотвращает развитие болезни Альцгеймера за счет снижения расщепления APP бета-секретазой [55]. Авторам удалось внедрить эту мутацию в клетки HEK293T с частотой 6% при использовании PE2, 9,9% при использовании PE3 и 25% при мутации PAM и использовании PE3. Дополнительная sgRNA индуцировала nick в положении +79. Они также повторили последнюю процедуру редактирования праймера десять раз и получили 65% редактирования. Для этой pegRNA мутация находилась в положении +9, а спейсер, PBS и RTT имели длину 20 нт, 11 нт и 14 нт соответственно. Далее авторы также ввели в клетки HEK293T мутацию V717I, которая вызывает наследственную болезнь Альцгеймера. Используя pegRNA со спейсером 10 нт, PBS 16 нт и RTT 17 нт, они получили 7,5% редактирования с помощью системы PE3 и путем мутации PAM.

Geurts et al. [56] исследовали создание моделей органоидов человека для изучения муковисцидоза. Для создания мутировавших органоидов авторы использовали прайминг-редактирование для индуцирования мутации, вызывающей заболевание. После трансфекции плазмид, кодирующих PE3, pegRNA и ген устойчивости к hygromycin, были отобраны клоны, устойчивые к hygromycin. Они изготовили один органоид кишечника с мутацией F508del и другой с мутацией R785* гена CFTR - мутациями, вызывающими муковисцидоз. Хотя наиболее известные симптомы заболевания проявляются в дыхательной системе, пациенты с муковисцидозом также страдают от проблем с кишечником. Действительно, транспорт жидкости в кишечнике и органоиде полностью зависит от активности канала CFTR. Таким образом, органоиды кишечника являются хорошей моделью для изучения генной коррекции мутаций в гене CFTR, поскольку на них можно оценить функцию этого кальциевого канала.

Мутация F508del - одна из самых распространенных в гене CFTR, вызывающая муковисцидоз. Исправить ее путем редактирования оснований не представляется возможным [56]. Для исправления этой мутации также пытались использовать CRISPR/Cas9-опосредованный HDR. Однако эффективность была очень низкой [57]. Через две недели после электропорации компонентов редактирования оснований в органоиде был обнаружен клон, гетерозиготный по делеции F508, с восстановленной функцией канала. Эксперимент по исправлению мутации R785* был использован ими для проверки наличия вне-геномных эффектов. За исключением нескольких indels в области, где дополнительная sgRNA индуцировала одноцепочечный разрыв, значительных геномных различий при секвенировании всего генома выявлено не было.

Zhang et al. [58] опубликовали статью о применении праймового редактирования для мышиной модели мутации IVS-II-654, вызывающей бета-талассемию. Используя систему PE3 и молчащую мутацию в PAM, авторы успешно исправили предполагаемую мутацию у четырех мышей, что привело к эффективности 14,29%. Однако при этом у 32,14% мышей (девять мышей) возникли побочные правки. К счастью, проведенный ими анализ побочных изменений показал, что прайм-редактирование, вероятно, безопасно для человека. Авторы также показали, что у мышей бета-генотипа, получивших прайм-редактирование, больше не наблюдается гематологических симптомов.

Hou et al. [59] работали над первичным иммунодефицитом, названным Х-сцепленным тяжелым комбинированным иммунодефицитом (X-SCID). Это заболевание вызывается мутациями в гене рецептора интерлейкина-2 гамма (IL2RG). Сначала с помощью прайм-редактирования была создана модель заболевания in vitro путем введения мутации c. 458T > C в гене IL2RG в клетки K-162 и в здоровые донорские Т-клетки. Использовали систему PE2 и электропорацию мРНК PE2 и pegRNA. В клетках К-562 они достигли 31% редактирования. В здоровых донорских Т-клетках они достигли 26% редактирования. Они также использовали прайминг-редактирование для коррекции этой мутации в Т-клетках пациентов, которые несут мутацию с ревертантным соматическим мозаицизмом. У этих пациентов соматический ревертантный мозаицизм приводит к атипичному X-SCID с легкими клиническими симптомами. Однако частота встречаемости последовательности дикого типа в мозаичных Т-клетках пациентов после лечения не увеличилась. Такой результат можно объяснить соматической реверсией и ограниченной пролиферацией мутантных клеток in vitro. Однако авторы предположили, что праймовое редактирование может более эффективно исправлять эту мутацию в клетках пациентов без реверсивных мутаций.

Некоторые гены, такие как TP53, APC и KRAS, имеют предрасположенность к возникновению рака при мутации. Поэтому интересно изучить, возможна ли их коррекция с помощью прайм-редактирования (табл. 7).

Abuhamad et al. [60] предприняли попытку редактирования гена TP53. Для исправления мутации c.580 C > T, p.L194F в клеточной линии люминального рака молочной железы T47D они использовали прайм-редактирование с помощью PE3 [60]. При этом использовалась pegRNA с 21 нт спейсером, 15 нт PBS и 28 нт RTT. Кроме того, редактирование проводилось на 26 нт ниже по течению от места разреза. С помощью высокопроизводительного секвенирования Illumina они обнаружили всего 0,043% редактирования. Авторы также попробовали ввести мутацию в клетки HEK293T. Они вновь получили скудные результаты - 0,2% редактирования. Следует отметить, что в своих экспериментах они также использовали в качестве положительного контроля область HEK3, предложенную изобретателем технологии праймового редактирования - Anzalone et al [20]. Они использовали те же pegRNA и sgРНК, что и эти авторы. Эта pegRNA меняла С на G в позиции 26 ниже по течению от сайта разреза, то есть на том же расстоянии, что и pegRNA для мутации L194F. Однако Abuhamad et al. [60] получили 0,43% редактирования в линии T47D и 1,3% в HEK293T, что является мизерным процентом. Учитывая, что Anzalone et al. [20] с помощью этой pegRNA в клетках HEK293T получили показатель около 35%, можно поставить под сомнение эффективность протокола, использованного Abuhamad et al [60]. Выделение геномной ДНК проводили через семь дней после трансфекции. В культуре процент редактирования снижается по мере расширения клеток, так как нетрансфецированные клетки лучше пролиферируют. Процент редактирования мог бы быть выше, если бы они выделяли ДНК через 72 ч после электропорации, как это делали Anzalone et al [20] и некоторые другие авторы [25,38]. Кроме того, они выделили только десять клеточных клонов, что является недостаточным числом для окончательного вывода. Кроме того, уровень трансфекции в линии T47D был очень низким. Оптимизация методики или протокола трансфекции могла бы привести к лучшим результатам.

Jang et al. [61] работали над исправлением мутаций KRAS путем прайминг-редактирования. Мутация в этом гене является основной причиной многих видов рака. Они сконструировали уникальную pegRNA, способную исправлять 12 различных мутаций KRAS, шесть из которых составляют 94% всех известных мутаций KRAS. Сначала, чтобы проверить, может ли уникальная pegRNA исправлять 12 индексированных мутаций в 12-й и 13-й аминокислотах гена KRAS, авторы создали библиотечные клеточные линии HEK293T/17, содержащие 12 выбранных мутаций KRAS. Затем они сравнили эффективность различных pegRNA. Были протестированы несколько вариантов pegRNA с различными длинами PBS и RTT. Было установлено, что наилучшей является pegRNA с PBS 13 нт и RTT 16 нт. Затем они сравнили эффективность PE3 с PE2, и оказалось, что PE3 лучше. Авторы также проверили эффективность двух вариантов инженерных pegRNA (epegRNA): с мотивом РНК tmpknot и мотивом РНК tevopreQ1. Эти epegRNA содержат псевдокнот в конце 3' области. Эти мотивы предотвращают деградацию PBS- и RTT-последовательностей pegRNA под действием экзонуклеаз клетки. EpegRNA обеспечивали лучшее редактирование, чем классические pegRNA (табл. 6).

Таблица 7. Исследования праймерного редактирования по исправлению или введению генетических мутаций, предрасполагающих к раку.

Для исправления эндогенных мутаций KRAS сначала методом праймирования были получены линии клеток HEK293T/17, содержащие специфические мутации в 12-й и 13-й аминокислотах. Каждый клон был гетерогенным по мутации: две копии последовательности KRAS дикого типа и одна копия мутировавшей последовательности KRAS (хромосома 12, на которой расположен ген KRAS, у клеточной линии HEK293T/17 триплоидна). Далее авторы корректировали эндогенные мутации с помощью уникальной epegRNA. Так, для мутаций G12D и G13D наилучшим оказалось сочетание PE3 и epegRNA, содержащей мотив РНК tevopreQ1, что дало 25% и 32% редактирования, соответственно. Для мутаций G12V и G13C лучшей оказалась комбинация PE3 и epegRNA, содержащей мотив РНК tmpknot, что дало 24% и 32% редактирования, соответственно. Далее авторы протестировали свой праймер на двух клеточных линиях рака поджелудочной железы - CFPAC-1 и ASPC-1. Клетки CFPAC-1 имели четыре копии аллелей, несущих KRAS, один из которых содержал мутацию G12V, а клетки ASPC-1 - две копии аллелей, несущих мутацию KRAS G12D. Сначала был протестирован PE3 с уникальной epegRNA, содержащей мотив РНК tevopreQ1. В клетках ASPC-1 они дали активность коррекции всего 2,7%. Для улучшения редактирования они изменили праймер редактора на использование PE5^max. Это позволило улучшить результаты: процент редактирования увеличился до 11,4% в клетках CFPAC-1 и до 18,7% в клетках ASPC-1.

Petri et al. [42] исследовали введение путем редактирования праймера мутации G12V в гене KRAS. Эта мутация может приводить к раку и не может быть введена с помощью системы редактирования оснований. В этом исследовании использовалась стратегия PE3, а компоненты прайм-редактирования доставлялись в форме RNP. При этом использовалось соотношение pegRNA:PE-белок 4:1 и молярное соотношение pegRNA/sgRNA 10:1. Использовали peRNAg со спейсером 19 нт, PBS 11 нт и RTT 16 нт. Сайт редактирования находился в позиции +6, а дополнительная sgРНК - в позиции +55. С помощью этой системы было получено 14% редактирования. Однако Petri et al. [42] наблюдали значительные непреднамеренные indels. В некоторых эмбрионах наблюдались делеции и потенциальные встраивания каркаса pegRNA.

Geurts et al. [56] исследовали создание органоидов модели человека для изучения рака. Для создания мутировавших органоидов авторы использовали прайм-редактирование для индукции мутации, вызывающей заболевание. После трансфекции PE3 и pegRNA клоны отбирались вручную путем дополнительной трансфекции плазмиды, кодирующей ген устойчивости к hygromycin. Было создано несколько органоидов кишечника и гепатоцитов с мутацией в гене TP53 (например, R175H (c.524 G -> A), R249S (c.747 G -> T) или C176F (c.527 G -> T)). Также были созданы органоиды толстой кишки с мутацией в гене APC. Для моделей рака было протестировано в общей сложности 10 мутаций (восемь в гене TP53 и две в гене APC). Из 10 мутаций авторы смогли создать органоиды только для четырех из них. Странный результат они получили и при попытке создания органоида с мутацией R1450* (c.4348C > T) гена APC. Вместо введения мутации секвенирование выявило гомозиготную дупликацию 37 нуклеотидов непосредственно перед сайтом разрезания. Этот результат демонстрирует, что прайм-редактирование иногда может приводить к нежелательным изменениям в ДНК.

PE3 однозначно повысил эффективность прайм=- редактирования по сравнению с PE2. Редактирование с использованием PE3 может быть в 5,2 раза эффективнее, чем при использовании только PE2. Даже если существуют опасения, что PE3 может привести к увеличению количества мутаций вне мишени, некоторые исследования [28,30,37,51] не выявили никакого смещения мишени и доказали, что PE3 безопасен. Однако в других исследованиях были обнаружены некоторые мутации вне-мишени [42,56,58]. Поэтому очень важно проверять наличие мутаций вне-мишени, поскольку их частота, по-видимому, зависит от последовательности в мишени и используемой pegRNA. Было бы интересно изучить характер этих off-target мутаций, чтобы повысить безопасность системы редактирования праймеров. Исследования также показали, что данная технология все же более точна, чем классический CRISPR/Cas9. Anzalone et al. [20] предположили, что высокая точность объясняется необходимостью трех этапов гибридизации при прайм-редактировании. Первая гибридизация происходит между спейсером и целевой ДНК для связывания Cas9. Вторая - между PBS и целевой ДНК, причем это взаимодействие необходимо для запуска обратной транскрипции. Третья гибридизация происходит при разрешении заслонки (flap resolution), когда продукт RT связывается с целевой ДНК.

В большинстве исследований использовалась спейсерная последовательность длиной 20 нт, а в некоторых - 19, 21 или 22 нт. Размер PBS-последовательности также имеет решающее значение для эффективного редактирования праймера. Оптимальная pegRNA в большинстве исследований имела PBS длиной 13 нт, что соответствует рекомендациям Anzalone et al [20], которые рекомендуют начинать оптимизацию pegRNA с PBS длиной 13 нт. В некоторых исследованиях также были получены лучшие результаты при использовании PBS длиной 9, 10, 11, 12, 14, 15 или 16 нт, что свидетельствует о важности тестирования диапазона длин PBS-RTT для каждой мутации, подлежащей коррекции. Длина RTT представляется более гибкой, поскольку во многих случаях pegRNA с заданной длиной спейсера и PBS, но с разной длиной RTT работают одинаково. Для PE3 эффективность редактирования прайма была выше, когда дополнительная sgRNA располагалась ниже по течению от места разреза.

Мутирование PAM предотвращает повторное прайминг-редактирование уже отредактированного аллеля. Избегая связывания Cas9 с ДНК, он предотвращает потерю коррекции. Мутирование PAM было продемонстрировано многими группами [24,45,46,53,58] для повышения эффективности прайминг-редактирования. Наша группа [46] также продемонстрировала, что введение дополнительных мутаций (помимо мутации в PAM) в pegRNA может повысить эффективность редактирования прайма. Мы являемся единственной группой, которая опробовала эту стратегию для коррекции или введения патогенной для человека мутации. Последний подход позволяет значительно повысить эффективность редактирования и редактировать последовательности, которые ранее считались невозможными [46,62]. Мы также являемся единственной группой [45,53], которая пробовала повторять праймированные процедуры редактирования, и эта стратегия показала резкое улучшение редактирования. Таким образом, эти две стратегии следует использовать для оптимизации эффективности праймирования. Использование epegRNA (содержащих мотив РНК tevopreQ1 или tmpknot) также повышает эффективность прайминг-редактирования [61,62]. Их псевдокнот позволяет избежать деградации экзонуклеазами 3' области pegRNA [63].

Для повышения эффективности редактирования использовались различные версии редактора праймеров. Использование PE5^max повысило эффективность праймерного редактирования почти в семь раз по сравнению с PE3 в исследовании Jang et al [61]. Однако в работе Mbakam et al. [46] также использовался PE5^max, который увеличил эффективность редактирования только в 1,2 раза по сравнению с PE3. PE* также показал значительное увеличение эффективности редактирования. У PE2* и PE3* оптимизирован сигнал ядерной локализации, что повысило эффективность редактирования праймера до 3,36 раза in vitro и до 3,19 раза in vivo. Bock et al. [28] использовали intein-split PE2ΔRnH, и сравнили его с unsplit вариантом. Для гена dnmt1 они обнаружили, что нерасщепленная версия была в 3,88 раза эффективнее, чем расщепленная PE2ΔRnH. Для последовательности Pahenu2 несплайтовая версия успешно исправила мутацию, в то время как intein-split PE2ΔRnH не показала существенной коррекции. Это позволило сделать вывод о том, что приоритетным должен быть другой способ доставки, нежели сплит-PE в AAV.

Что касается метода доставки in vivo, то на сегодняшний день испытаны только микроинъекции (у эмбрионов), гидродинамические инъекции в хвостовой венец, субретинальные инъекции транссплайсинговых AAV2 (для таргетинга в глаз), AAV8 и AdV. Доставка с помощью AAV требует использования сплит-PE, что не является приоритетным вариантом, поскольку значительно снижает эффективность редактирования праймеров. Также следует избегать использования AdV in vivo, поскольку он вызывает важную иммунную реакцию. Инъекции можно делать только в органы, допускающие нерадикальную локальную доставку, например, в глаза, для которых можно использовать субретинальные инъекции [64]. Разработка нового способа доставки праймеров необходима для их возможного клинического применения. Некоторые технологии, которые уже использовались для доставки редактирования оснований или CRISPR/Cas9, такие как вирусоподобные частицы [65] или липидные наночастицы [32], было бы интересно оптимизировать для доставки праймерного редактирования.

Лечение ex vivo было очень эффективным еще и потому, что праймерное редактирование вводилось в клетки в культуре, а не в животных. Таким образом, трансплантация позволила вернуть генетически исправленные клетки животным. Например, она очень эффективна в случае печени, поскольку исправленные клетки обладают лучшим пролиферативным потенциалом, они могут заселить печень и сделать ее снова функциональной. Таким образом, выбор органа, в котором трансплантированные клетки могут заменить больные клетки, является более выгодным.

Bock et al. [28] показали, что праймовое редактирование было более эффективным в печени новорожденных мышей, чем в печени взрослых. Эту интересную тенденцию следует проверить на других мишенях, чтобы лучше понять этот феномен. Тип клеток, на которые направлено прайминг-редактирование, также влияет на его эффективность. Например, Anzalone et al. [20] заметили, что прайм-редактирование было очень эффективным в клетках HEK293T, но менее эффективным в других клеточных линиях, таких как K562 и HeLa. Одна из гипотез состоит в том, что клетки HEK293T частично дефектны в системе MMR [48,66], что способствует сохранению правки, осуществляемой праймовым редактированием.

Кроме того, форма доставки компонентов прайм-редактирования может существенно влиять на эффективность редактирования. Например, Li et al. [33] использовали прайм-редактирование для введения замен в гене SNCA hPSCs. Они сравнили эффективность при использовании PE2 в форме плазмиды, мРНК и РНК и получили эффективность редактирования около 5%, 26,7% и 1% соответственно. Практически во всех исследованиях, приведенных в данном обзоре, использовалась плазмидная форма. Однако Petri et al. [42] вводили компоненты праймерного редактирования в виде РНК, но не пытались сравнивать с доставкой плазмид или мРНК. Поэтому на основании этого эксперимента нельзя сделать никаких выводов. Hou et al. [59] и Zhang et al. [58] проводили свои эксперименты по редактированию праймера в форме мРНК, но не тестировали свои конструкции в форме плазмид или РНК. В своей диссертации Lung [27] сравнивал эффективность между использованием ДНК или РНК, но результаты существенно не отличались. Таким образом, было бы очень интересно сравнить эффективность редактирования праймера в плазмидной, мРНК и РНК-форме в одном и том же эксперименте для исправления других мутаций.

Как показали исследования, проанализированные в данном обзоре, праймовое редактирование демонстрирует отличный потенциал для лечения наследственных заболеваний. Поскольку эта технология появилась совсем недавно, необходимо внести коррективы, чтобы повысить ее эффективность и безопасность для возможного клинического применения. Например, необходимо усовершенствовать систему прайм-редактирования, чтобы избежать indels, когда в ДНК встраиваются нежелательные участки pegRNA. Для подтверждения безопасности праймового редактирования необходимо также провести геномные исследования вне мишеней. Потенциал праймерного редактирования находится только в начале своего развития, поскольку существует еще очень много генетических заболеваний, для лечения которых можно было бы использовать прайм-редактирование.