Программируемые системы редактирования РНК обычно состоят из двух компонентов: фермента ADAR и gRNA, которая гибридизируется с интересующей мРНК-мишенью, создавая таким образом субстрат dsRNA для ADAR. Первые попытки в области редактирования РНК основывались на избыточной экспрессии экзогенного ADAR или химерных ферментов, состоящих из деаминазного домена, слитого с RBPs, и сконструированных gRNAs для привлечения фермента к мишени.^9,15,65-69. Первоначально конструкции gRNAs обычно состояли из двух доменов: анти-смыслового домена, обычно длиной 20-40 нуклеотидов (нт), несущего С-совпадение напротив целевого аденозина, и домена рекрутирования, который приводил фермент ADAR к интересующей мРНК через взаимодействие белок-РНК. Кодированные с помощью ДНК gRNAs состояли из разнообразных рекрутирующих доменов, начиная от части естественно встречающейся шпильки пре-мРНК GRIA2 или crRNA:tracrRNA до стволовых петель BoxB и MS2, и использовались для рекрутирования либо ADAR2 дикого типа, либо для слияния каталитических доменов ADAR с Cas13, ΛN-пептидом и белками оболочки MS2, соответственно.^9,65,67,68. Доказательные исследования продемонстрировали использование аденозиндезаминаз, доставляемых с помощью AAV, в мышиных моделях мышечной дистрофии Дюшенна, дефицита орнитинтранскарбамилазы и синдрома Rett.^9,70. Хотя подходы, основанные на избыточной экспрессии ADAR, продемонстрировали терапевтический потенциал редактирования РНК, смешанная природа ADAR привела к транскриптомному вне-целевому редактированию A-to-I^9,15,71 с потенциально токсичными эффектами, наблюдаемыми у мышей.⁹ Для преодоления этой проблемы важно ограничить каталитическую активность избыточно экспрессированного фермента только целевой мРНК. Разделив домен деаминазы ADAR2 на два каталитически неактивных фрагмента, которые объединяются химерной gRNA на данной целевой мРНК мишени для транзиторного образования функционального фермента, мы добились более чем 100-кратного усиления специфичного редактирования РНК по сравнению со избыточной экспрессией полноразмерной деаминазы.⁷² Эта новая стратегия привела к значительному улучшению транскриптомной специфичности, а система split-ADAR2 была функциональна с RBPs человеческого происхождения для ограничения проблем иммуногенности. Дальнейшее усовершенствование ферментативной активности системы split-ADAR2 или дополнительные стратегии белковой инженерии, повышающие специфичность, могут повысить ее терапевтический потенциал.

Даже при улучшенной специфичности разработанных экзогенных белков, этот подход все еще будет сталкиваться с ограничениями упаковки для способов доставки (например, AAVs) и проблемами иммуногенности. Поэтому привлечение эндогенных ADAR для осуществления направленного редактирования РНК является предпочтительным подходом. Недавно мы продемонстрировали использование ДНК-кодированных gRNAs для привлечения эндогенных ADARs для редактирования РНК.⁹ Если gRNA с анти-смысловыми доменами длиной 20 нт были достаточны для привлечения избыточно экспрессированных ADARs, то увеличение длины, например, до 60 нт или более, позволило привлечь эндогенные ADAR.⁹ Это важное достижение технологии, поскольку оно открывает двери для потенциального терапевтического применения.

ДНК-кодированные gRNAs можно дополнительно оптимизировать, уделяя особое внимание экспрессии, стабильности и локализации. gRNAs обычно транскрибируются с промоторов pol III (например, U6) и не имеют 5' cap и 3' поли(А) хвоста, что делает их уязвимыми для 5' и 3' экзонуклеаз, тем самым уменьшая их время полураспада. Учитывая, что редактирование РНК - это преходящее событие, которое исчезает с оборотом мРНК, важно улучшить экспрессию и стабильность транскрибируемой gRNA U6. Циркуляризация РНК - одна из стратегий предотвращения переваривания экзонуклеазой и увеличения периода полураспада РНК. Для этого мы создали закодированные в ДНК циркулярные gRNAs, фланкируя длинные анти-смысловые домены рибозимами twister.^8,73 После транскрипции рибозимы twister само-расщепляются, оставляя специфические выступы, которые распознаются и лигируются повсеместно экспрессируемой РНК-лигазой RtcB с образованием циркулярной gRNA.⁷⁴ Использование циркулярных gRNAs значительно улучшило сохранение редактирования РНК по сравнению с линейными гРНК как in vitro, так и in vivo. В то время как редактирование 3' не-транслируемой области (UTR) PCSK9 в печени мыши не было обнаружено с помощью линейной gRNA, доставленной AAV, 11% редактирования было обнаружено с помощью циркулярной gRNA, доставленной AAV. При упаковке двух копий промотора U6 и циркулярной gRNA в AAV уровень редактирования РНК увеличился до 53% через 8 недель после инъекции.⁷⁴ Кроме того, круговые gRNAs, доставленные AAV, использовались для восстановления преждевременного стоп-кодона (W392X) в мРНК α-L-идуронидазы в печени мышиной модели синдрома Hurler посредством привлечения эндогенных ферментов ADAR, что привело к редактированию 12% РНК и частичному восстановлению активности фермента.^8,11. Хотя краткосрочные исследования не выявили токсичности у мышей, а уровень РНК-редактирования сохранялся до 8 недель после инъекции, необходимы более длительные исследования для оценки безопасности и долговечности циркулярных gRNAs, доставляемых AAV.

Альтернативной стратегией повышения стабильности gRNA является использование природных структур, устойчивых к экзонуклеазе, на 5' и/или 3' концах gRNA.^75-77 Достижения в области коротких интерферирующих РНК (siRNA) и CRISPR gRNAs продемонстрировали полезность этого подхода для повышения стабильности U6 транскрибируемой РНК.^78,79 Эти знания из области CRISPR gRNAs и анти-смысловых РНК могут быть применены для повышения эффективности ADAR-рекрутирующих gRNAs. Кроме того, необходимо приложить целенаправленные усилия для разработки пространственно-временной регуляции редактирования РНК. Использование тканеспецифических усиливающих элементов позволит модулировать активность РНК-редактирования в пространстве, а инженерная регуляция активности gRNAs с помощью малых молекул может обеспечить временной контроль.^80,81.

Хотя обилие gRNAs является важным фактором, влияющим на эффективность редактирования РНК, внутренние характеристики gRNAs, такие как внутримолекулярная вторичная структура и нуклеотидный состав, также играют важную роль во влиянии на активность gRNAs. Большинство транскрибируемых gRNAs относительно длинные (более 40 п.н.) и могут иметь сложную вторичную структуру. Вторичная структура gRNAs влияет на ее способность связывать мишень, а использование вычислительных инструментов для прогнозирования внутримолекулярной вторичной структуры может улучшить дизайн gRNAs. Кроме того, редактирование аденозинов на самой gRNA может повлиять на редактирование мишени аденозина. Редактирование РНК с помощью ADARs может происходить на обеих нитях РНК-дуплекса, тем самым изменяя последовательность самой gRNA. Это, в свою очередь, может повлиять на возможность ADAR-опосредованного редактирования дополнительных целевых транскриптов.⁸² И наоборот, вторичная структура целевой пре-мРНК и положение сайта редактирования в транскрипте, например, UTR или кодирующей области (CDS), также могут повлиять на редактирование. Как было замечено в области ASOs и RNAi, многие регионы мРНК поддаются или не поддаются нокдауну из-за доступности. Однако в этих стратегиях нокдауна есть возможность просмотреть всю мРНК, чтобы определить оптимальное место для нокдауна. Редактирование РНК может оказаться сложной задачей, если целевой аденозин находится в высокоструктурированной или недоступной области мРНК, что затрудняет его редактирование. Еще предстоит выяснить, могут ли более длинные gRNAs или gRNAs, использующие две или более прерывистые области гибридизации, изменять структуру целевой РНК, чтобы помочь получить доступ к аденозинам, расположенным в таких областях.⁷ Более системный подход, сравнивающий доступность ASOs и gRNAs-опосредованного редактирования РНК, поможет лучше понять ограничения, накладываемые структурой целевой мРНК. Кроме того, весь участок dsRNA, образующийся между gRNAs и целевой мРНК, становится субстратом для фермента ADAR. Таким образом, дальнейшая инженерия gRNAs необходима для достижения специфического редактирования аденозина-мишени.

Способность рекрутировать эндогенные ADAR ограничивает проблему внецелевого редактирования в масштабах транскриптома; однако обычно наблюдается побочное редактирование нецелевых аденозинов в комплексе gRNA-мишень. Как уже говорилось, ферменты ADAR обладают широкой активностью редактирования, о чем свидетельствует их роль в регуляции врожденного иммунного ответа на dsRNA и миллионы идентифицированных сайтов редактирования в транскриптоме.^51,83,84. Несмотря на смешанную природу ADAR, было выявлено множество природных субстратов, которые редактируются с высокой избирательностью и эффективностью с целью модуляции функции белка путем перекодировки на уровне аминокислот или изменения сплайсинга пре-мРНК.^85-87 Существует гипотеза, что вторичные структурные особенности dsRNA могут стимулировать эффективное и избирательное редактирование этих субстратов. Было показано, что вторичные структурные особенности ниже по течению от редактируемого аденозина в субстрате GRIA2 R/G повышают эффективность редактирования,²⁹ а добавление вторичных структур ограничивает беспорядочную природу активности ADAR в субстрате dsRNA.⁸⁸ Мутагенез и высокопроизводительный скрининг природных субстратов в пре-мРНК NEIL1, TTYH2 и AJUBA продемонстрировали влияние вторичной структуры на эффективность редактирования.⁸⁹. Кроме того, высокопроизводительный скрининг вторичных структур в длинных субстратах dsRNA выявил активность ADAR на 30 нт выше нарушения вторичной структуры и показал периодичность редактирования.⁸² Более того, ко-иммунопреципитация и секвенирование РНК показали периодичность подключения ADAR к природным субстратам с шагом в 50 нт.⁹⁰ Эти наблюдения могут быть использованы для разработки gRNAs с улучшенной специфичностью, необходимой для терапевтического применения. Однако эти особенности наблюдаются при взаимодействии цис-РНК, и пока неясно, насколько легко они переносятся на транс-взаимодействие gRNAs и РНК-мишени.

Недавно мы использовали вторичные структурные особенности для решения проблемы побочного редактирования. Мы впервые продемонстрировали, что идеально комплементарная gRNA, содержащая С-совпадение в аденозине-мишени, вызывает многочисленные побочные события редактирования под действием эндогенного ADAR. Другие исследователи показали, что включение G-несовпадения, расположенного на сторонних аденозинах, может снизить активность ADAR вне мишени, но при этом может пострадать эффективность РНК-редактирования целевого аденозина.¹⁰ В качестве альтернативного подхода мы включили внутренние петли в определенные позиции по всей длине gRNAs. Это устраняет беспорядочное редактирование РНК, не влияя на эффективность целевого аденозина,⁸ и аналогичный подход с использованием прерывистых участков гибридизации также улучшает специфичность.⁷ Другой подход продемонстрировал, что точные нуклеотидные делеции через побочные аденозины могут привести к улучшению специфичности кольцевых и линейных gRNAs.¹¹ Мы ожидаем, что дополнительные усовершенствования дизайна gRNAs позволят еще больше уменьшить побочное редактирование и повысить эффективность целевого редактирования.

В настоящее время существует ограниченный набор клинически проверенных инструментов для доставки полезной нагрузки ДНК; поэтому, несмотря на трудности, в области генотерапии в значительной степени полагаются на аденовирусы и AAV. Доклинические исследования in vivo, подтверждающие концепцию редактирования РНК на основе ADAR, использовали AAV для доставки кодируемых с помощью ДНК gRNAs в печень мыши. Естественный тропизм многих серотипов AAV позволяет использовать их для лечения заболеваний печени, мышц, ЦНС и глаз. Однако ADARs экспрессируются повсеместно, и продолжающиеся усилия по расширению тропизма и специфичности серотипов AAV являются активной областью исследований, которые могут позволить доставлять gRNAs в дополнительные типы тканей.^91-96 Например, эффективная доставка AAV в ЦНС требует инвазивных методов, таких как прямая инъекция в паренхиму мозга. Векторы доставки, способные эффективно преодолевать гематоэнцефалический барьер и трансдуцировать ЦНС, повысили бы безопасность и упростили бы разработку и проведение доклинических и клинических исследований. Однако системное введение AAV приводит к высокой трансдукции печени. Таким образом, снижение поглощения печени при увеличении трансдукции целевого органа может повысить безопасность и эффективность. Помимо вирусной доставки, для доставки полезной нагрузки ДНК могут использоваться невирусные подходы, такие как lipid nanoparticles (LNPs), но, как и в случае с AAV, основное поглощение происходит в печени. По мере совершенствования технологий доставки появятся новые терапевтические возможности для редактирования РНК.

ASOs - еще один широко используемый подход к терапевтическому редактированию РНК, основанный на десятилетиях работы в области химии олигонуклеотидов. ASOs постепенно претерпели три основных усовершенствования: внедрение химии фосфоротиоатной основы, использование модификаций сахара, таких как 2'-O-метил, и использование аналогов нуклеиновых кислот, таких как блокированные нуклеиновые кислоты (LNAs).⁹⁷ В сочетании эти усовершенствования повысили стабильность, эффективность, биораспределение, проникновение в клетки и безопасность, что привело к огромному росту терапевтических препаратов на основе олигонуклеотидов в последние два десятилетия. В настоящее время существует более 15 видов терапии на основе ASOs, которые прошли клинические испытания на поздних стадиях или получили одобрение Управления по контролю за продуктами и лекарствами.^98,99 Важно отметить, что уроки, извлеченные из области ASOs, могут быть использованы для разработки и клинического применения химически синтезированных gRNAs для терапевтического редактирования РНК.

Многие из проблем, широко распространенных в области ASOs, включая доставку, биораспределение, проникновение в клетки и безопасность, аналогично применимы к редактированию РНК. Кроме того, существует несколько проблем, уникальных для редактирования РНК, включая длину gRNAs, потенциально специфические взаимодействия фермента ADAR с химическим составом ASOs, а также ядерную доставку и локализацию. В контексте деградации, опосредованной RNase-H, или пропуска экзонов, а также siRNA для нокдауна, опосредованного RNAi, эффективны короткие олигосомы длиной ~20 нт. Однако ASOs для редактирования РНК, вероятно, потребуют не менее 30 нт,^12,13 а использование рекрутирующих доменов может еще больше увеличить длину до 60-90 нт.⁶ В дополнение к длине, идеальные структуры gRNAs, которые уравновешивают стабильность, способствуя связыванию ADAR и ферментативной активности, будут ключом к максимизации эффективности и специфичности редактирования РНК. Аналогичным образом, стабильность ASOs была оптимизирована с помощью "gapmers", которые изменяли структурные особенности, сохраняя при этом активность, направленную на РНКазу-Н.¹⁰⁰ Наконец, хотя активность РНКазы-Н может происходить в ядре или цитоплазме¹⁰¹ , а нокдаун, опосредованный RNAi, происходит в цитоплазме,¹⁰² большая часть редактирования РНК происходит одновременно с транскрипцией в ядре.¹⁰³ Таким образом, ядерная доставка и локализация химически модифицированной gRNA являются важными параметрами для достижения эффективного редактирования РНК.

Многие ключевые достижения ASOs были приняты в области редактирования РНК, и многочисленные лаборатории использовали ASO для привлечения эндогенных ADAR к редактированию целевых аденозинов in vitro и in vivo.^104-106 Первое применение было продемонстрировано с использованием экзогенного домена деаминазы ADAR, ковалентно связанного с ASO, который направлял домен деаминазы к целевой мРНК.⁶⁶ Основываясь на этой ранней работе, рекрутирование эндогенного ADAR было достигнуто с помощью химически модифицированных ASOs с анти-смысловым доменом, присоединенным к части шпильки GRIA2 R/G.6 Этот метод продемонстрировал редактирование РНК в нескольких мишенях мРНК в клеточных линиях и первичных клетках. Химические модификации включали 2'OMe группы на протяжении большей части ASO, за исключением 3nt мотива напротив мишени и отдельных мест в шпильке GRIA2 R/G; фосфоротиоаты на 5' и 3' концах, и LNA на 3' конце. Использование химических модификаций имело решающее значение для привлечения эндогенного ADAR, так как не-модифицированный ASO не приводил к обнаружению мест редактирования, если клетки не обрабатывались интерфероном-α для индукции экспрессии ADAR p150. Также было продемонстрировано редактирование двух терапевтически значимых мишеней: введение T701C в STAT1 для предотвращения фосфорилирования и передачи сигнала вниз по пути JAK-STAT,¹⁰⁷ и исправление мутации PiZZ (E342K) в SERPINA1, наиболее распространенной причине дефицита α1-антитрипсина (AATD).¹⁰⁸ Двадцать один процент редактирования STAT1 и 10%-18% редактирования кодона E342K в минигене кДНК SERPINA1 были достигнуты с помощью химически модифицированных ASOs. Интересно, что оптимальная конструкция ASO имела длину 91 нт, которая включала 38 нт анти-смыслового домена и 53 нт шпилечной структуры. Это намного длиннее, чем 20-нтовые ASOs, используемые для RNase-H-опосредованного нокдауна и пропуска экзонов, и более длинные конструкции могут усложнить доставку, производство и безопасность. Важно также отметить, что побочное редактирование наблюдалось в соседнем 3' аденозине мишени SERPINA1. Введение группы 2'OMe на парный урацил в ASO позволило уменьшить это побочное редактирование, хотя и с одновременным уменьшением редактирования на аденозине мишени. Аналогичный компромисс наблюдался при использовании несоответствий A-G для снижения побочного редактирования для gRNAs, кодируемых ДНК.¹⁰ Необходима дальнейшая работа для понимания основных принципов дизайна для оптимизации эффективности и селективности редактирования. В альтернативной стратегии использовался гораздо более длинный ASO длиной 100 нт с модификациями 2'OMe на 5' и 3' концах. Использование этой конструкции для нацеливания на транскрипт PPIB дало 20% редактирования в человеческих Т-клетках, в то время как немодифицированный ASO не дал обнаруживаемого редактирования.¹⁰ Эти исследования ясно продемонстрировали потенциал ASO в вызывании эффективного и специфического редактирования РНК с помощью эндогенного человеческого фермента ADAR.

Учитывая известные структурные детали следа ADAR и размер многих природных субстратов, приводящих к перекодировке аминокислот, которые часто содержат менее 30 п.н. dsRNA, неудивительно, что в последних публикациях длина ASO значительно сократилась. В одной из недавних публикаций было продемонстрировано использование 30-нт стереочистого ASO с фосфоротиоатной основой.¹² След конструкции соответствует каноническому асимметричному следу ADAR: примерно 5 п.н. на 5' стороне мишени для размещения 5' связывающей петли домена деаминазы и примерно 25 п.н. на 3' стороне мишени для размещения 3' связывающей петли домена деаминазы, а также dsRBDs. Кроме того, в конструкции ASO широко использовались 2'-фтор-модификации на 5' конце, 2'-O-метил на 3' конце и дезоксирибонуклеотиды напротив сайта редактирования, это указывает на то, что ADAR толерантен к этим модификациям в соответствующих местах. Стереочистые ASOs достигли надежного уровня редактирования в культуре тканей и in vivo. Конъюгат GalNac-ASO, нацеленный на печень, был внутривенно введен не-человекообразным приматам (NHP) и достиг до 50% редактирования неклинической цели в 3' UTR эндогенном транскрипте ACTB. Хотя целевой аденозин находится в мотиве UAG, благоприятствующем ADAR, эти данные по NHP подтверждают возможность трансляционного редактирования РНК. Однократная доза показала стойкое редактирование РНК через 50 дней после инъекции, что еще больше подчеркивает терапевтический потенциал конъюгатов GalNac-ASO. В контексте актуальной для заболевания мишени, стереочистые ASO достигли редактирования мутации SERPINA1 E342K до 75% in vitro. Укорочение gRNAs до 30 нт упростило производство, а отсутствие структуры набора шпильки означает, что взаимодействие ASO с ADAR зависит от гибридизации мишени и с меньшей вероятностью нарушает естественную функцию ADAR. Кроме того, меньшая длина снижает риск химической токсичности, которая, по-видимому, является эффектом класса при использовании химически модифицированных ASO в высоких дозах.¹⁰⁹

Знания о структуре и функции ADAR также могут быть использованы для более эффективного проектирования ASO. Умная конструкция "bump-hole" объединила мутант ADAR2 E488Y с ASO, содержащим абазисный сайт напротив целевого аденозина.⁶⁹ Из-за стерического столкновения мутант ADAR2 E488Y обладал низкой ферментативной активностью; однако абазисный сайт устранил это столкновение и ограничил его активность комплексом ASO-мишень, образованным при гибридизации с целевой мРНК. Эта стратегия может позволить использовать экзогенный ADAR при минимизации внецелевого редактирования, однако она сопряжена со сложностью доставки не-человеческого белка с риском анти-лекарственного ответа на ADAR2 E488Y. Совсем недавно эта же группа подробно описала рациональный дизайн ASO для привлечения эндогенных ADAR.¹³ Мутация ADAR2 E488Q была хорошо документирована для улучшения редактирования посредством водородной связи Q488 с сиротским основанием в независимой от рН манере.^31,110 Вдохновленные этим наблюдением, исследователи попытались улучшить водородную связь с сиротским основанием на ASO с ADAR2 E488 дикого типа. Действительно, включение цитидинового аналога 2'-дезокси-основания Benner's base Z (dZ), которое, как и предполагалось, оказывает благоприятный эффект на характер водородной связи с E488, улучшило кинетику скорости биохимической реакции ADAR1 и ADAR2 дикого типа в 3 раза. При тестировании на человеческих клетках ARPE-19 включение dZ в сиротское положение ASO улучшило редактирование сайта расщепления γ-секретазой в транскрипте APP с 6% до 19%. Еще многое предстоит узнать о принципах, лежащих в основе химических модификаций, и о том, как они влияют на привлечение субстрата ADAR и его дезаминирование, но эти результаты подчеркивают потенциал рационального дизайна ASO для улучшения взаимодействия и ферментной кинетики эндогенных ADAR.

Эти данные показывают, что ASO являются жизнеспособным и перспективным путем для терапевтического редактирования РНК. В краткосрочной перспективе жизнеспособными вариантами являются доставка ASO в печень, мышцы или почки или прямое введение в ЦНС. В отличие от длительного сохранения закодированных с помощью ДНК gRNAs в результате доставки AAV, период полураспада ASO позволяет редактировать РНК быстро и дозировать по мере необходимости, а доза может быть оптимизирована для точной настройки желаемого количества редактирования, необходимого для терапевтического эффекта. Текущая работа в области ASO по решению проблем, связанных с доставкой, биораспределением и проникновением в клетки, будет быстро предпринята и применена к редактированию РНК. Между тем, необходима дополнительная работа по оптимизации и стандартизации конструкций ASO для привлечения эндогенных ADAR.

Редактирование РНК обеспечивает множество привлекательных терапевтических применений, наиболее логичным из которых является исправление миссенс- и нонсенс-мутаций G-to-A, о которых в ClinVar (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/, доступ получен 13 апреля 2022 года) сообщается как о 7000 патогенных мутаций G-to-A. В поддержку терапевтического редактирования РНК было описано несколько убедительных исследований in vivo с использованием ADAR-опосредованного редактирования РНК для исправления миссенс- и нонсенс-мутаций. В мышиной модели синдрома Hurler эндогенный ADAR был привлечен для исправления нонсенс-мутации в транскрипте IDUA и восстановления функции белка.^8,11 В двух мышиных моделях синдрома Ретта редактирование РНК с помощью экзогенного ADAR позволило исправить как нонсенс- (MECP2W104X), так и миссенс- (MECP2R106Q) мутации.^20,70 Коррекция нонсенс-мутации в мышиной модели мышечной дистрофии Дюшенна mdx была достигнута с помощью экзогенного набора ADAR.⁹ Кроме того, РНК-редактирование миссенс-мутации сайта сплайсинга 5' в мышиной модели дефицита орнитин-транскарбамилазы spfash восстановило правильный сплайсинг in vivo,⁹ что подчеркивает способность технологии функционировать на уровне пре-мРНК. Наконец, значительное внимание было направлено на мутацию SERPINA1 E342K, которая вызывает AATD, и две независимые группы продемонстрировали более 40% редактирования РНК мутантной SERPINA1 в клетках человека с помощью ASOs.^6,12.

Помимо исправления точечных мутаций, воздействие на аденозинсодержащие мотивы, такие как сайты акцепторов сплайсов, TIS, сигналы полиаденилирования и сайты связывания микроРНК, может модулировать уровни мРНК и/или белков в терапевтических целях. ADAR играет естественную роль в регуляции сплайсинга,¹¹¹ а геномное редактирование сайтов сплайсинга способно модулировать сплайсинг,^112-114 усиливая обоснование для терапевтического таргетинга сайтов сплайсинга. Более того, ASO и анти-смысловые РНК, кодируемые ДНК, использовались для маскировки и блокирования функции сайтов сплайсинга,¹¹⁵ сайтов полиаденилирования,^116-118 TISs,¹¹⁹ вышележащих открытых рамок считывания,¹²⁰ и сайтов связывания микроРНК.¹²¹ Поэтому gRNAs, разработанные как для маскировки, так и для редактирования этих регионов, могут обеспечить аддитивный эффект. Действительно, многие из этих мотивов были жестко запрограммированы на геномном уровне путем редактирования ДНК^122-124 и обеспечили желаемый молекулярный эффект.

Можно также предположить дальнейшее применение редактирования РНК. Появление моноклональных антител¹²⁵ создало новый инструмент для блокирования функции белка и передачи сигналов путем связывания с растворимыми белками и мембранными белками, такими как фактор некроза опухоли¹²⁶ и HER2,¹²⁷ соответственно. Однако внутриклеточные белки недоступны для антител, а сложные мембранные белки, такие как ионные каналы и G-белок-связанные рецепторы, представляют собой проблему для поиска антител. ADAR-опосредованное редактирование РНК может вводить 17 различных аминокислотных замен, которые могут быть использованы для модуляции функции белка и отмены или усиления белок-белковых взаимодействий. Это может представлять особый интерес для белков, которые не поддаются терапии антителами. Например, РНК-редактирование участка расщепления BACE на APP было продемонстрировано в клетках ARPE-19,¹³ что является потенциальной мишенью для лечения болезни Альцгеймера.¹²⁸ Кроме того, эндогенный ADAR2 играет центральную роль в модуляции проницаемости ионных каналов,¹²⁹ и распространение этой функции на терапевтическое регулирование ионных каналов, таких как Nav1.7, представляет большой интерес.^130,131.

Вышеупомянутые терапевтические мишени также могут быть скорректированы на геномном уровне с помощью технологий редактирования ДНК; поэтому при выборе терапевтического подхода для любого заболевания необходимо учитывать соотношение риска и пользы редактирования ДНК и РНК. Прежде всего, ДНК-модифицирующие ферменты создают постоянные изменения, которые влияют на 100% транскрибируемых РНК как на целевых, так и на нецелевых участках. В отличие от этого, редактирование РНК носит преходящий характер в течение жизни редактируемой молекулы РНК и может быть настроено на желаемую долю редактируемых молекул РНК в клетке. Для терапевтических применений, требующих преходящего фармакодинамического эффекта, таких как лечение острой боли, ожирения, вирусной инфекции и воспаления, было бы нежелательно вносить постоянные изменения в геном. Таким образом, переходная модуляция экспрессии или функции белка путем редактирования РНК является преимуществом. Кроме того, настраиваемость РНК-редактирования может быть использована, когда желателен частичный нокдаун или частичная модуляция белка. Фактически, многие эндогенные субстраты ADAR dsRNA, редактируемые с целью перекодирования, демонстрируют значительный диапазон эффективности редактирования - от однозначных цифр до 100%.¹⁸ Некоторые организмы даже развили методы тонкой настройки редактирования РНК в зависимости от окружающей среды.^132-134 Исследования мутагенеза показали, что изменение вторичной структуры природных субстратов может увеличить или уменьшить редактирование,⁸⁹ что еще раз подчеркивает важность дизайна gRNAs для терапевтического применения редактирования РНК.

Редактирование РНК обладает уникальными преимуществами в плане безопасности и доставки по сравнению с редактированием ДНК. Несмотря на потенциал и ранний клинический успех технологий редактирования ДНК CRISPR-Cas,¹³⁵ проблемы безопасности сохраняются.¹³⁶ Редактирование РНК не вызывает необратимых изменений на геномном уровне, что позволяет избежать онкогенного риска, связанного с редактированием ДНК, и, как обсуждалось выше, позволяет проводить преходящее лечение острых состояний. Кроме того, одной gRNAs достаточно для привлечения эндогенного ADAR. В отличие от систем редактирования ДНК, которые основаны на использовании бактериальных белков или гиперактивных ферментов, которые несут риск иммуногенности^137,138 и создают проблемы с доставкой из-за своих размеров. Поскольку ADAR экспрессируется повсеместно, его потенциал в любом органе или типе клеток ограничен только доставкой gRNAs в клетку-мишень. Это включает в себя неделящиеся клетки, такие как нейроны в ЦНС, где отсутствие путей гомологически-направленной репарации (HDR) ограничивает использование некоторых технологий редактирования ДНК. ADAR-опосредованное редактирование РНК ограничено изменениями A-to-G, а попытки использовать APOBEC1 для редактирования РНК C-to-U менее продвинуты.¹³⁹ Напротив, усовершенствованные технологии редактирования ДНК, такие как редактирование оснований и праймирование, могут вносить мутации, недостижимые с помощью современных технологий редактирования РНК, и обходить необходимость HDR, требуемую традиционными методами CRISPR-Cas9. Способность к постоянным геномным изменениям также делает редактирование ДНК особенно привлекательным для быстро делящихся клеток или клеток-предшественников и широко используется в клеточной терапии ex vivo. В целом, учитывая многие отличительные особенности, описанные выше, редактирование РНК имеет большой потенциал в качестве терапевтического метода для широкого спектра сложных заболеваний и стало важной частью молекулярного инструментария биотехнологов.

Область редактирования РНК будет продолжать набирать обороты благодаря достижениям в технологии доставки, поскольку новые капсиды AAV и модификации ASOs расширяют тропизм и проникновение в различные ткани. Между тем, достижения в области открытия и дизайна gRNA могут открыть новые возможности. Расширение знаний о структуре ADAR и gRNAs позволит создавать более сложные конструкции, такие как перекодировка нескольких кодонов в транскрипте, как это наблюдается для природных субстратов.⁸⁷ Ограниченный размер груза кассеты экспрессии gRNAs может легко обеспечить мультиплексирование и редактирование нескольких транскриптов. Можно представить себе нацеливание на несколько путей или инженерию обоих интерфейсов межбелкового взаимодействия. Появился также потенциал для новых методов. Редактирование РНК используется для зондирования РНК, что позволяет регулировать экспрессию полезной нагрузки на транскрипционном этапе клетки-мишени.^140-142 Однако, чтобы претворить любую из этих возможностей в реальность, необходимо усовершенствовать ранние исследования, подтверждающие концепцию, чтобы перенести результаты в клинику.

Расширение понимания фундаментальной биологии и контроля редактирования РНК продвинуло эту технологию на порог клинического применения. Для успешного внедрения в клинику необходимо решить оставшиеся проблемы. Существует несколько нормативных руководств, в которых широко рассматриваются многие проблемы, с которыми сталкиваются спонсоры при разработке генотерапии и регенеративных препаратов.^143-153 Эти руководства охватывают новые платформенные технологии, такие как РНК-редактирование, и отражают текущие представления регуляторов об исследовательской фармакологии, неклинической безопасности, производстве/характеризации продукта и клинической оценке. Хотя эти руководящие документы в целом могут быть применены к редактированию РНК, остаются специфические для данной технологии вопросы, требующие тщательного рассмотрения в процессе разработки. Широкий обзор клинических аспектов представлен на рисунке 3.



Figure 3. Considerations to support the clinical development of RNA editing

Редактирование РНК должно быть исключительно селективным для целевой РНК-мишени, с биологически незначительным редактированием вне мишени. Это необходимо для достижения намеченной фармакологической активности и минимизации рисков безопасности. Для определения профиля специфичности любой конкретной gRNAs необходимы проверенные методы скрининга редактирования по и вне мишени. Глубокое секвенирование РНК может охарактеризовать глобальные изменения в клеточном транскриптоме и определить сигнатуру редактирования gRNAs.^51,154 Установление этой сигнатуры в соответствующих типах клеток и тканей под влиянием ожидаемого биораспределения данного способа доставки будет иметь решающее значение для прогнозирования риска клинической безопасности. Предыдущие исследования на мышах, в которых вводили экзогенный ADAR или гиперактивные формы ADAR, показали значительное увеличение внецелевого редактирования,^9,15,20,70 в то время как последние публикации, перенаправляющие эндогенный ADAR на интересующую мишень, показали минимальное внецелевое редактирование.^8,11,12 Если конкретные транскрипты демонстрируют повышенный уровень внецелевого редактирования, может потребоваться дальнейшая характеристика для понимания любых физиологических или токсикологических последствий. В некоторых случаях внецелевое редактирование может не влиять на экспрессию или функцию на уровне белка, например, в случае редактирования, приводящего к синонимичному изменению кодона, которое не изменяет структуру транслируемого белка. В других случаях вне-целевое редактирование может быть значительно разрушительным, например, при внесении не-синонимичной мутации, приводящей к усилению или ослаблению функции белка. Учитывая спектр последствий потенциального внецелевого редактирования, важно рассмотреть влияние этих правок в каждом конкретном случае, особенно учитывая, что различные пути будут иметь различную переносимость к возмущениям. Как минимум, необходимо установить связь между редактированием вне мишени и экспрессией белка, а затем провести функциональные исследования для изучения влияния на известные пути, идущие вниз по течению. Более широкие последствия вне-целевого редактирования на уровне тканей и организмов будут оцениваться в ходе токсикологических исследований, требуемых регулирующими органами, но анализ на соответствующих человеческих клетках может помочь в интерпретации результатов.

Подобно стратегиям, используемым для оценки внецелевых событий ДНК-редактирования,¹⁵⁵ методы глубокого секвенирования также могут быть использованы для определения того, произошли ли изменения в эндогенном эдитоме клетки в результате преимущественного привлечения ADAR к gRNAs-мишеням.⁸¹ Долгосрочное нарушение естественной функции ADAR может иметь иммунологические последствия и повлиять на ряд клеточных путей. Следует отметить, что в транскриптоме имеются миллионы сайтов редактирования A-to-I³⁹ , распределенных по тысячам субстратов dsRNA.¹⁵⁶ Маловероятно, что добавление одного субстрата нарушит активность ADAR; однако конструкции gRNAs, включающие рекрутирующий домен^6,7 , способны связывать ADAR независимо от гибридизации с мишенью. Это создает больший риск нарушения активности ADAR, особенно при высоком уровне экспрессии.

Кроме того, при оценке возможности вне-целевого воздействия важно учитывать относительный вклад ADAR1 и ADAR2 в терапевтическое редактирование. Каждый фермент способен эффективно и избирательно редактировать природные субстраты для перекодировки на аминокислотном уровне, однако существуют тонкие различия в их преимущественном редактировании в зависимости от контекста последовательности и вторичной структуры.^26,62 Например, терапевтическое редактирование в печени будет в первую очередь опираться на ADAR1, тогда как биораспределение в ткани с высокой экспрессией ADAR2 (например, мозг)⁴⁰ может привести к изменению эффективности редактирования или специфичности целевой мРНК. Обеспечение селективности gRNAs для целевого аденозина в среде ADAR1 и ADAR2 является важным моментом, особенно когда способы доставки могут быть недостаточно специфичными для целевой ткани (тканей). Созданные клеточные линии, экспрессирующие ADAR1 и ADAR2 в изоляции, могут быть ценным инструментом для оценки относительной специфичности каждого фермента для gRNAs-опосредованного редактирования целевой мРНК.⁷

Большое внимание уделяется количественной оценке редактирования РНК на уровне транскрипта, но не менее важно убедиться, что это приводит к соответствующему изменению белка, которое обеспечивает желаемый фенотипический результат. Часто предполагается, что исправление миссенс-мутации приведет к соответствующему уровню исправленного белка; однако это не всегда так. Хотя инозин интерпретируется как гуанозин, существует небольшая потеря верности, которая может варьироваться в зависимости от контекста последовательности, а наличие более одного инозина может затормозить трансляцию.¹⁵⁷ Поэтому при доклинической оценке безопасности и эффективности желательно количественно оценить как редактирование РНК, так и восстановление белка.

Доставка gRNAs, будь то с помощью ASO или ДНК-кодирования, является важным фактором для максимизации воздействия и активности в интересующих клетках и минимизации вне-целевого воздействия и экспрессии, которые могут привести к нежелательным побочным эффектам. Оптимальный подход к доставке должен обеспечивать эффективный тропизм, поглощение клетками, а также экспрессию и функцию, специфичные для конкретного типа клеток. Метод доставки влияет на неклинические, производственные, клинические и регуляторные аспекты разработки РНК-редактирующих препаратов. Сама gRNA достаточно компактна и может быть разработана как химически модифицированный олигонуклеотид, во многом аналогичный нескольким коммерчески одобренным образцам ASO.¹⁵⁸ Такой подход, вероятно, потребует многократного дозирования для достижения стойкого эффекта и может быть ограничен в терапевтическом применении на основании естественных фармакокинетических и биораспределительных свойств ASO. В качестве альтернативы можно использовать вирусные векторы, такие как AAV, для доставки кодированных ДНК gRNAs; это открывает возможности для постоянной экспрессии gRNAs с помощью всего одной дозы. Векторы AAV показали свою перспективность для длительной экспрессии генов по целому ряду показаний в клинике: в 2017 году в США были одобрены препараты для лечения наследственной дистрофии сетчатки, а в 2019 году - спинальной мышечной атрофии.¹⁵⁹ Капсиды AAV могут быть сконструированы таким образом, чтобы стимулировать тканеспецифический тропизм, что позволит осуществлять векторную доставку gRNAs с целевым биораспределением.¹⁶⁰ Перевод лекарственных препаратов на основе AAV сопряжен с хорошо известными проблемами в области производства и безопасности, которые необходимо учитывать при разработке.^161,162 В частности, иммунный ответ на векторы AAV обычно исключает повторное введение одному и тому же пациенту, а некоторые клинические испытания высоких доз привели к серьезным побочным явлениям. Однако в настоящее время изучается несколько стратегий, позволяющих обойти или ослабить влияние иммунного ответа, включая режимы иммуносупрессии, использование иммуноортогональных AAV и инженерию капсида для получения более низких доз.^163,164 Достижение максимальной доставки полезной нагрузки в клетки-мишени при минимизации воздействия на нецелевые клетки может снизить затраты на производство лекарств и требования к дозировке для пациентов, что может привести к снижению риска токсичности.

Независимо от выбранного метода доставки, ожидается, что всесторонняя характеристика биораспределения вектора и gRNAs в тканях и профиль экспрессии в соответствующих неклинических моделях позволят использовать первые дозы для человека. Поскольку транскриптомы в разных тканях различаются, данные о биораспределении могут выделить клетки и ткани, представляющие особый интерес при оценке эффективности и переносимости. Данные о биораспределении/экспрессии могут использоваться в сочетании с данными о редактировании на мишени и вне мишени в соответствующих модельных системах для прогнозирования требований к дозировке, необходимой для достижения терапевтического эффекта, и запаса безопасности для определения начальной клинической дозы и стратегии эскалации дозы. В некоторых случаях эти данные необходимо экстраполировать на несколько модельных систем. Например, модели здоровых крупных животных, обычно используемые для неклинических токсикологических исследований, могут не иметь нужных целевых мутаций, позволяющих считать эффективность РНК-редактирования по мишени, но они могут дать информацию о дозовом ответе и биораспределении gRNAs. Дозовый ответ для редактирования может быть экстраполирован на модель заболевания с соответствующей целевой мутацией, используя данные о биораспределении/экспрессии в тканях-мишенях для связи с показаниями модельных систем. Таким образом, стратегии терапевтического дозирования будут сильно зависеть от показаний и доступных модельных систем и станут важнейшей темой для обсуждения с регуляторными органами в ходе доклинической разработки.

С клинической точки зрения, каждое заболевание, орган-мишень и способ доставки влияют на план клинического развития и, в конечном счете, на информацию, которую можно получить в результате клинических испытаний на ранней фазе. Существует желание количественно оценить как редактирование РНК, так и влияние белков в биопсиях тканей для обоснования выбора дозы; однако сложность клинических биопсий в разных тканях различна. Например, биопсия печени связана с риском и проводится реже. Аналогично, биопсия из ЦНС, как правило, нецелесообразна. В случае с мышцами биопсия проводится более регулярно и может позволить провести сравнительный анализ редактирования РНК, коррекции или восстановления белков и фенотипических изменений в клиническом исследовании. Эта информация будет ключевой в исследованиях по увеличению дозы для определения минимальной дозы, необходимой для терапевтического воздействия. В тканях, где биопсия невозможна, понимание взаимосвязи между редактированием РНК, модуляцией белка и фенотипическим результатом должно быть четко установлено в доклинических исследованиях, и требуется тщательное рассмотрение при выборе соответствующей дозы и показаний для исследований на людях.

Коррекция миссенс- и нонсенс-мутаций является наиболее логичным применением для редактирования РНК. Многочисленные группы продемонстрировали доклинические данные, направленные на миссенс-мутацию в SERPINA1, приводящую к AATD^6,12 (как рассмотрено выше). SNV G-to-A, кодирующий мутацию E342K, затрагивает более 100 000 человек во всем мире¹⁰⁸ , что создает большую неудовлетворенную медицинскую потребность. Мутация вызывает токсическое усиление функции, и агрегированный белок накапливается в гепатоцитах. Кроме того, снижение секреции α1-антитрипсина (ААТ) из гепатоцитов в сыворотку крови приводит к накоплению эластазы нейтрофилов, естественного субстрата ААТ, в легких.¹⁰⁸ Из-за этого комбинированного усиления и потери функции в печени и легких попытки нокдауна, замены генов или белковой терапии оказались неудачными, поскольку они не затрагивают оба аспекта заболевания. AATD хорошо подходит для терапевтического редактирования РНК. Печень является идеальным органом-мишенью для доставки ДНК или РНК, а коррекция SNV на уровне РНК может сохранить эндогенные уровни экспрессии, снижая токсичность в печени и увеличивая секрецию в сыворотку. Наконец, был установлен четкий критерий более 11 µM AAT в сыворотке для восстановления его функции в легких. Это дает прекрасную возможность утвердить редактирование РНК в качестве нового терапевтического метода и удовлетворить большую неудовлетворенную медицинскую потребность.

По мере того, как редактирование РНК будет утверждаться в клинике, мы ожидаем, что оно будет использоваться для лечения показаний с меньшими когортами пациентов, что в конечном итоге позволит создать действительно персонализированную медицину, подобно недавним примерам с ASOs. В одном из примеров глубокое секвенирование педиатрического пациента, страдающего болезнью Batten's, выявило патогенный вариант сплайса в гене MFSD8, приводящий к преждевременному терминальному кодону. Быстро был разработан ASO, маскирующий криптический сайт акцептора сплайсинга и восстанавливающий использование канонического сайта акцептора сплайсинга. В течение 1 года после постановки диагноза препарат был разработан, изготовлен и введен одному пациенту, у которого после лечения уменьшились симптомы заболевания.¹⁶⁵ Существующие технологии доставки ДНК-полезной нагрузки пока не позволяют проводить индивидуализированное лечение, но простота синтеза ASO может облегчить мелкомасштабное производство, необходимое для более широкого внедрения персонализированной медицины. По мере совершенствования знаний о принципах конструирования gRNAs мы ожидаем, что подобные сценарии будут развиваться и для пациентов с редкими патогенными SNV G-to-A.

РНК-терапевтические препараты на основе ASOs и RNAi, позволяющие программировать нокдаун РНК, уже оказывают значительное влияние на медицину человека. Недавнее появление технологий на основе ADAR, которые добавляют программируемое редактирование РНК в молекулярный инструментарий, создало новые возможности в транскриптомной инженерии. Позволяя осуществлять прямую модуляцию эндогенных РНК-транскриптов на уровне нуклеотидов и, соответственно, модулировать РНК-субстраты или транслируемые ими белки на уровнях, соответствующих нативным стехиометрическим уровням, временной динамике и пространственному распределению in situ, эта технология открывает новые пути в прецизионной терапии. Кроме того, этот подход использует существующий в клетках механизм редактирования РНК, тем самым устраняя необходимость в экзогенных и иммуногенных белках для управления редактированием. В дополнение к возможности прямого исправления мутаций G-to-A, вызывающих заболевания, и нонсенс-мутаций, направленное редактирование РНК может также позволить модулировать стабильность РНК и сплайсинг. Кроме того, временная модуляция функции белков, например, активных сайтов белков или модуляция интерфейсов межбелкового взаимодействия, открывает двери для терапевтических направлений, начиная от регенеративной медицины и заканчивая онкологией. В сочетании с неотъемлемыми преимуществами того, что терапевтические препараты на основе РНК обладают настраиваемостью и обратимостью, а вне мишеней не являются постоянными, эти новые наборы инструментов на основе ADAR в сочетании с быстро совершенствующимися вирусными и невирусными способами доставки способны оказать широкое влияние на биотехнологии и терапевтические приложения.