Моногенные заболевания - это наследственные нарушения, вызванные мутациями в отдельных генах. Они могут наследоваться по аутосомно-доминантному типу, как в случае Huntington's disease (HD) [1], синдрома Марфана [2] и нейрофиброматоза (NF1 и II) [3], или по аутосомно-рецессивному типу, примерами которого являются Cystic Fibrosis (CF) [4], β -талассемия [5] и спинальная мышечная атрофия (СМА) [6]. Другие важные моногенные заболевания сцеплены с половыми хромосомами и включают синдром Хрупкой Х хромосомы[7], мышечную дистрофию Дюшенна (DMD) [8] и гемофилию [9]. Такие заболевания, которых может быть до 5000 [10], могут быть редкими, каждое из них встречается с частотой 1:200 000 новорожденных, хотя небольшое количество из них гораздо более распространено [11]. Однако в совокупности они могут поражать более 6% мирового населения - сотни миллионов людей [12] - и поэтому их лечение и лечение представляют собой огромную глобальную проблему. Кажущаяся простота моногенных заболеваний скрывает значительную генетическую и фенотипическую гетерогенность: одно такое заболевание может быть вызвано сотнями или тысячами мутаций в одном гене (см., например, базу данных мутаций трансмембранного регулятора проводимости CF (CFTR), в которой перечислено более 2100 вариантов [13]). Такая гетерогенность приводит к концепции тератипов, когда к подтипам моногенного заболевания, вызванного сходными вариантами, объединенными в функциональные классы, могут применяться сходные методы лечения [14,15]. Такой подход в настоящее время успешно применяется в случае CF, где для лечения широкого спектра генотипов в настоящее время доступны несколько низкомолекулярных препаратов-модуляторов, которые связываются с мутантным белком CFTR и влияют на его трафик или функцию в плазматической мембраны (PM) для получения благоприятного эффекта. Однако, несмотря на то, что большинство людей с CF (pwCF) имеют право принимать эти препараты [16], по оценкам, во всем мире только 12% людей, имеющих право на эти препараты, фактически принимают их [17], возможно, из-за их высокой стоимости [18]. Не менее важно и то, что эти препараты, несмотря на их перспективность, не направлены на все генотипы, и это остается главной проблемой в лечении моногенных заболеваний. На самом деле, несмотря на более чем столетний период разработки лекарств на основе малых молекул, фармакологические подходы считаются эффективными только в 10% или менее случаев моногенных заболеваний [19], и точно так же только около 10% генов производят белки-мишени, пригодные для лечения [20].

На рисунке 1 мы сравниваем различные современные терапевтические стратегии лечения генетических заболеваний путем воздействия на ДНК, РНК или белок, кодируемый пораженным геном. Подходы, основанные на нуклеиновых кислотах, обещают действовать на более ранних стадиях развития болезни, чем препараты малых молекул, нацеленные на белки, - усиливая, корректируя или восстанавливая экспрессию генов еще до того, как белок будет транслирован. Более того, природа сопряжения оснований нуклеиновых кислот открывает перспективы создания специфических для мутаций препаратов, которые могут заполнить пробелы в охвате генотипов, оставленные доступными в настоящее время низкомолекулярными препаратами, и расширить терапевтические возможности и преимущества, доступные в настоящее время пациентам. В этом обзоре мы покажем, как два терапевтических подхода, основанных на мРНК, способны произвести революцию в лечении моногенных заболеваний. В первом случае антисмысловые олигонуклеотиды (ASO, также называемые AON) могут быть использованы в контексте персонализированной медицины для исправления или обхода ошибок при обработке мРНК, вызванных редкими, специфическими для пациента вариантами сплайсинга или преждевременного терминирующего кодона (PTC). Во-вторых, любую мутантную последовательность в любом (рецессивном) гене болезни можно обойти, введя новую мРНК, тем самым восстановив производство здорового белка и обойдя весь каскад причин заболевания.



Figure 1. Comparison of current therapeutic strategies for genetic diseases targeting DNA, RNA and Protein. Some categories refer specifically to drugs developed for CF [16].

Принцип действия ASOs был продемонстрирован несколько десятилетий назад [21] в исследовании, в котором репликация вируса саркомы Роуса (RSV) в фибробластах цыплят блокировалась тридекамерами, комплементарными 3' и 5'-последовательностям вирусной 35S РНК. С тех пор достижения в области химии олигонуклеотидов и механизмов доставки в сочетании с разнообразием возможных механизмов действия привели к появлению в клинике по меньшей мере 10 препаратов для лечения моногенных заболеваний [22]. Как будет показано ниже, различные стадии процессинга РНК могут быть заблокированы с помощью ASOs, что позволяет осуществлять различные модуляции экспрессии генов, которые могут быть полезны в случае определенных мутаций [23]. Например, варианты сплайсинга, происходящие в интронных консенсусных сплайсинговых мотивах, могут привести к аберрантному сплайсингу мРНК, кодирующих усеченные и нефункциональные белки. Аберрантный сплайсинг может быть исправлен с помощью ASO, разработанных для блокирования взаимодействия между пре-мРНК и сплайсосомой, тем самым уменьшая влияние мутировавшей последовательности [24]. Приведенные здесь примеры, которые приводят к восстановлению или замене экспрессии белка, обобщены в таблице 1.

Существует несколько примеров экспериментальных сплайс-модулирующих ASO при CF. Мы протестировали стратегию ASO для коррекции аберрантного сплайсинга, вызванного вариантом c.2657+5G→A (наследственное название: 2789+5G→A) в интроне 16, который приводит к образованию транскриптов, лишенных экзона 16, а также транскриптов дикого типа (wt). Были разработаны ASOs, комплементарные пре-мРНК интрона 16 мутантной области, и их влияние на сплайсинг было оценено на уровне РНК и белка, на внутриклеточную локализацию белка и функцию с использованием стабильно экспрессированного c.2657+5G→A мутантного минигена CFTR в клетках HEK293 Flp-In. Данные РНК из мутантных клеток, обработанных ASO, показали почти полное (95%) восстановление включения экзона 16 и связанное с этим увеличение уровней правильно локализованного белка PM CFTR с усилением функции [25].

Другим распространенным вариантом сплайсинга в CFTR является c.3718-2477C→T (наследственное название: 3849+10kbC→T), который создает новый 5' сайт сплайсинга в интроне 22, что приводит к включению криптического экзона с PTC. Две группы показали, что ASOs, переключающие сплайсинг, эффективно блокируют аберрантный сплайсинг в первичных клетках дыхательных путей из pwCF с этим вариантом [26,27]. В первом исследовании лечение ASO привело к долгосрочному улучшению активности CFTR в эпителиальных клетках бронхов человека (HBE), о чем свидетельствовало восстановление секреции хлоридов (Cl-) и апикальной мембранной проводимости. Более того, ASO был более эффективен в восстановлении секреции Cl-, чем лечение потенцирующим CFTR препаратом, который в настоящее время доступен пациентам [26]. В другом исследовании ASO, доставленный путем свободного поглощения в клетки гомозиготного по варианту pwCF, значительно увеличил правильный сплайсинг мРНК и восстановил функцию CFTR до уровня wt-CFTR. Средний показатель восстановления функции CFTR в клетках, полученных от различных гетерозиготных pwCF, составил 43%, тем самым продемонстрировав потенциальную терапевтическую пользу ASO для pwCF, несущих варианты сплайсинга [27].

Несколько иной стратегии придерживались три группы для коррекции p.Trp1282X ( W1282X), варианта PTC в экзоне 23 гена CFTR [28-30]. В этом случае использовались сплайс-модулирующие ASOs, способствующие пропуску экзона 23, который находится в рамке и содержит 35 кодонов: его пропуск устраняет PTC из сплайсированной мРНК, позволяя завершиться трансляции на естественном стоп-кодоне. Было выявлено несколько ASOs, которые повышали уровень транскриптов CFTR экзона 23 в клетках 16-HBE, генетически модифицированных для экспрессии варианта p.Trp1282X, что приводило к образованию значительных уровней зрелого белка CFTR, который затем можно было стимулировать модуляторами для восстановления функции канала CFTR. Что еще более важно, ведущие ASOs, доставляемые путем свободного поглощения, были способны увеличить уровень транскриптов экзона 23 и восстановить функцию CFTR в первичных культурах назальных [28] или бронхиальных клеток [29] из p.Trp1282X-гомозиготных pwCF, что привело к образованию неполного, но функционального белка CFTR.

Трансляция мРНК p.Trp1282X-CFTR может привести к образованию усеченного белка CFTR с пониженной функцией, который, как и описанный выше белок экзон23-CFTR, может быть стимулирован модуляторами CFTR [31]. Однако присутствие PTC вызывает распад мРНК с помощью процессинга NMD, в результате чего транслируется очень мало мРНК p.Trp1282X-CFTR. Это привело к тому, что для данного варианта была принята другая стратегия спасения, опосредованная ASO, чтобы ингибировать NMD и увеличить трансляцию частично функционального белка p.Trp1282X-CFTR. NMD запускается, когда рибосома, остановившаяся в PTC, взаимодействует с белками в расположенных ниже по течению exon junction complexes (EJCs), которые осаждаются во время сплайсинга пре-мРНК. Было показано, что блокирование осаждения белковых комплексов EJC ниже по течению от p.Trp1282X с помощью коктейля ASO (по одному на каждый нижележащий EJC) действительно снижает NMD-опосредованную деградацию транскрипта CFTR, несущего PTC p.Trp1282X [32]. Этот подход увеличил уровни частично функционального CFTR, которые можно было стимулировать до терапевтически значимых уровней в генно-редактированных клетках 16-HBE с помощью модуляторов CFTR.

За пределами области CF уже существует несколько препаратов ASO, основанных на тех же принципах, которые были одобрены для лечения других моногенных заболеваний. В некоторых случаях целью вмешательства является предотвращение трансляции мРНК, чтобы отменить, а не восстановить экспрессию белка. Так обстоит дело с Mipomersen, используемым для лечения семейной гиперхолестеринемии (FH), где он связывает мРНК ApoB и вызывает деградацию, опосредованную RNase-H [33]. Было показано, что этот препарат успешно снижает уровень циркулирующего low-density lipoprotein (LDL)-С у пациентов с FH, но ассоциирует с печеночной токсичностью и высоким уровнем прекращения приема препарата у пациентов [34]. Inotersen - еще один одобренный препарат ASO, направленный на ген транстиретина (TTR) при аутосомно-доминантном заболевании - наследственном амилоидозе, связанном с транстиретином (hTTR). Инотерсен воздействует на мРНК TTR для подавления выработки неправильного печеночного белка TTR и, как показало исследование фазы 3, улучшает течение неврологического заболевания и качество жизни у людей с hTTR [35]. Действительно, после 3 лет лечения он замедлил прогрессирование полинейропатии hTTR [36], продемонстрировав in vivo эффективность ASO в терапевтическом ингибировании производства патогенного белка на основе РНК.

Для восстановления производства белка, нарушенного вариантами при моногенном заболевании, Nusinersenн был одобрен для лечения спинальной мышечной атрофии (SMA), аутосомно-рецессивного нервно-мышечного расстройства, обычно вызываемого вариантами в гене SMN1 [37]. Как и в одном из примеров, приведенных выше для CFTR, Нусинерсен действует индуцируя включения экзонов, маскируя альтернативные интронные сайты сплайсинга. Однако вместо того, чтобы воздействовать на ген заболевания, он улучшает сплайсинг экзона 7 в паралогичном гене SMN2, который естественным образом сплайсируется (и, таким образом, замолкает) из-за распространенного полиморфизма. Это повышает эффективность производства белка SMN2 и тем самым компенсирует генетический дефицит, вызванный вариантами в SMN1. Этот препарат ASO увеличил выживаемость и улучшил двигательную функцию у младенцев в ходе испытания фазы 3 [38]. Интересно, что препарат из малых молекул, Risdiplam, также направлен на механизм сплайсинга SMN2, усиливая связывание факторов сплайсинга, что также способствует включению экзона 7. Таким образом, два доступных метода лечения, направленных на мРНК, увеличивают экспрессию полноразмерного белка SMN2 через различные механизмы [39], чтобы компенсировать дефицит экспрессии SMN1.

Пропуск экзонов - это подход, используемый рядом препаратов ASO для лечения Duchenne muscular dystrophy (DMD), Х-сцепленного заболевания, при котором пораженный ген дистрофина (также сокращенно DMD) имеет много экзонов (максимум 79), которые естественным образом объединяются в большое разнообразие функциональных сплайс-вариантов [40]. Пропуск экзонов, содержащих варианты, удаление которых не влияет на открытую рамку считывания, может привести к образованию отредактированного, но частично функционального белка дистрофина [41], хотя этот подход может быть использован только для уменьшенного процента пациентов, несущих определенные варианты. Утвержденные препараты ASO с таким эффектом включают Casimersen (экзон 45) [42], Eteplirsen (экзон 51) [43],Golodirsen и Viltolarsen (оба экзон 53) [44], хотя все эти препараты показали недостаточную эффективность и некоторые проблемные побочные эффекты [45].

Table 1. Summary of Important Advances in ASO technology in monogenic diseases *.

Приведенные здесь примеры демонстрируют универсальность ASO в предоставлении ряда различных механистических решений для лечения заболеваний одного гена, часто путем нацеливания на очень специфические, редкие варианты, в большинстве случаев для усиления или замены, но иногда для подавления дефицитного белка.

Принцип трансфекции мРНК в клетки с помощью липосом уже давно используется в лабораториях молекулярной биологии, и в первой работе, описывающей эту процедуру [46], авторы в заключение пишут: "Метод РНК/липофектин может быть использован для прямого введения РНК в целые ткани (...), что открывает возможность того, что опосредованная липосомами трансфекция мРНК может предложить еще один вариант в растущей технологии доставки эукариотических генов, основанный на концепции использования РНК в качестве лекарства". Совсем недавно профиль мРНК как терапевтического агента резко возрос после успешной разработки и применения мРНК-вакцины COVID-19 во время недавней пандемии [47]. Как и генная терапия, мРНК-терапия рассматривается в качестве вариативно-диагностического подхода, который может быть использован практически при любом моногенном заболевании, при рецессивных аллелях. В ином контексте уже продемонстрирована осуществимость и безопасность доставки модифицированной молекулы мРНК (для снижения врожденных иммунных реакций и задержки ее деградации) в липидной наночастице (ЛНП) [48], это контрастирует с техническими трудностями, с которыми пришлось столкнуться при генотерапии. Векторы адено-ассоциированного вируса (AAV), которые стали наиболее перспективными инструментами для проведения генотерапии in vivo, подвержены как врожденным, так и адаптивным иммунным реакциям [49], а попадание вирусной ДНК в ядро для интеграции, помимо риска инсерционного мутагенеза, представляет дополнительные технические сложности. Здесь мы кратко представим некоторые последние достижения в области мРНК-терапии как короткого пути к замене белка при моногенных заболеваниях, а наиболее перспективные результаты обобщим в таблице 2.

CF снова является моногенным заболеванием, которое стало примером в отношении методических достижений. В одном из первых исследований было продемонстрировано двукратное увеличение cAMP-опосредованного Cl- тока и экспрессии апикального белка CFTR в клетках CFBE41o- и эпителиальных клетках носа человека, трансфицированных оптимизированной мРНК wt-CFTR [50]. Другое исследование показало, что модифицированная мРНК CFTR, упакованная в LNPs и введеная в клетки бронхиального эпителия (BE), полученные от пациентов с CF привела к увеличению мембранной локализации CFTR и функции Cl^- канала [51]. Более того, до 55% активности wt-CFTR восстанавливалось у нокаутных по CFTR мышей после назального применения этой мРНК, что демонстрирует ее потенциал in vivo.

О доклинических испытаниях мРНК CFTR на клеточных линиях и животных моделях сообщили коммерческие компании. Компания ReCode Therapeutics продемонстрировала, что ее мРНК RTX0001 хорошо переносится и демонстрирует восстановление функции CFTR после однократного и многократного введения дозы в первичные клетки HBE и в легкие мыши путем распыления SORT-LNP [52]. Компания Arcturus Therapeutics протестировала свою запатентованную систему доставки LUNAR LNP в моделях хорька с p.Gly551Asp (унаследованное название: G551D)-CFTR и мыши с p.Gly542X (унаследованное название: G542X)-CFTR. Они продемонстрировали значительное функциональное восстановление CFTR в бронхах хорька и назальном эпителии мыши in vivo (об этом сообщается в [53]). В настоящее время мРНК CFTR человека Arcturus ARCT-032 является предметом заявки на клинические испытания [54]. Клинические испытания препаратов мРНК CFTR были начаты, но им еще предстоит пройти определенный путь, прежде чем они принесут плоды. Первое испытание нерассеянной мРНК (MRT5005) в фазе 1/2 на человеке, хотя и сообщало об отсутствии неблагоприятных последствий после многократного дозирования, отметило положительное влияние на FEV1 (форсированный экспираторный объем за 1 с) только в одной когорте при однократном приеме [55,56].

Основным органом-мишенью CF для улучшения фенотипа заболевания являются легкие, которые могут быть уникальным объектом воздействия при ингаляции, несмотря на значительные барьеры, такие как слизь. Тем не менее, другие попытки терапии моногенных заболеваний с помощью мРНК были направлены на внутривенную доставку, а органы-мишени для экспрессии мРНК находятся в других местах, хотя уже было отмечено, что систематически доставляемые липосомальные частицы накапливаются в печени [57]. В исследовании терапевтической эффективности мРНК-терапии в моделях гемофилии В у мышей и не-человекообразных приматов использовались липидные и липидоподобные наночастицы для доставки транскриптов мРНК, кодирующих либо человеческий эритропоэтин (hEPO), либо белок фактора IX (hFIX). Было обнаружено, что обе мРНК депонируются в гепатоцитах, где они создают систему "депо" высокого уровня производства экзогенного белка, которая продолжалась в течение нескольких дней. Активность секретируемых белков была подтверждена фармакодинамически (экспрессия hEPO вызывала увеличение гематокрита) и терапевтически (экспрессия hFIX предотвращала кровопотерю в модели болезни гемофилии B) [58].

Метилмалоновая ацидемия (ММА) - аутосомно-рецессивное заболевание, чаще всего вызываемое вариантами гена метилмалонил-КоА мутазы (hMUT), который кодирует митохондриальный фермент, чей продукт, сукцинил-КоА, является ключевой молекулой в цикле Кребса. Внутривенное введение мРНК hMUT, инкапсулированной в LNPs, в двух различных мышиных моделях ММА привело к снижению метилмалоновой кислоты в плазме на 85% и повышению экспрессии и активности белка hMUT в печени, при этом повторное введение препарата привело к значительному улучшению выживаемости и увеличению веса [59]. В более долгосрочном исследовании лечение мРНК hMUT гипоморфных по ММА мышей привело к дозозависимой продукции ферментативно активного белка MUT в печени. Лечение тяжелых мышей с ММА привело к повышению выживаемости и роста, а также к улучшению биохимических отклонений. мРНК также хорошо переносилась и не вызывала побочных эффектов [60]. Результаты таких исследований, по-видимому, поддерживают развитие мРНК-терапии, особенно учитывая отсутствие альтернатив для лечения, в данном случае, разрушительного детского заболевания.

Последний пример касается дефицита аргиназы - редкого аутосомно-рецессивного метаболического заболевания, вызванного вариантами гена аргиназы 1 (ARG1). Недостаток этого фермента нарушает цикл мочевины и вызывает накопление аммиака и связанные с ним симптомы [61]. В настоящее время лечение дефицита аргиназы 1 заключается в соблюдении диеты, что может облегчить симптомы, но не предотвратить нейрокогнитивные нарушения. В исследовании эффективности мРНК ARG1 сначала была проведена доказательная экспрессия in vitro в фибробластах пациентов с дефицитом Arg1 для изучения увеличения экспрессии белка ARG1 после введения модифицированной мРНК ARG1. После того, как это было подтверждено иммунохимией ARG1 и измерениями биоактивности, мышам ввели однократную дозу инкапсулированной в LNPs мРНК ARG1. Увеличение экспрессии белка hARG1 и его специфической активности было измерено в печени и обнаруживалось до 168 ч после инъекции [62]. Эти предварительные результаты были многообещающими, и дополнительные данные были получены в ходе дальнейшего исследования на мышиной модели дефицита ARG1 [63]. В этом исследовании мышей лечили LNPs, инкапсулирующими человеческую кодон-оптимизированную мРНК ARG1 с интервалом в 3 дня. Все обработанные мыши выжили после 11 недель, не обнаружив гипераммонемии или потери веса, в то время как контрольные, не получавшие лечения, погибли на 22-й день. Активность аргиназы печени у мышей с дефицитом ARG1 достигала 54% от массы тела, а признаков гепатотоксичности обнаружено не было. Результаты данного исследования представляют собой доклиническое доказательство того, что дефицит аргиназы у людей может быть излечим путем доставки мРНК ARG1 с помощью наночастиц, нацеленных на печень.

Table 2. Summary of important advances in mRNA therapeutics for monogenic diseases.

Принцип использования терапии на основе РНК для лечения нарушений одиночных генов был хорошо продемонстрирован в этих и других исследованиях. В случае ASOs уже одобрено несколько препаратов, и как для ASOs, так и для вакцинных или невакцинных мРНК большое количество клинических испытаний в настоящее время находится на стадии планирования, набора или активной фазы (см., например, сайт клинических испытаний США [64]). Однако остаются некоторые хорошо известные проблемы, которые всесторонне обсуждаются в недавнем обзоре [65]. Стабильность и иммуногенность полезной нагрузки молекулы РНК, а также доставка в ядро в случае ASO [66], были решены путем использования модифицированных нуклеотидов [67], но все еще имеют большой потенциал для оптимизации [68]. В настоящее время для доставки РНК-терапевтических препаратов используются липидные и липидоподобные наночастицы, но хотя они могут быть пригодны для доставки в дыхательные пути и печень, для других органов-мишеней могут потребоваться альтернативные целевые подходы [69]. Неблагоприятные лекарственные реакции и токсичность также остаются проблемой среди немногих одобренных препаратов этой категории: гепатотоксичность, почечная токсичность и реакции гиперчувствительности связаны с несколькими одобренными препаратами ASO [45]. Тем не менее, такая информация, несомненно, будет использована при разработке более безопасных и эффективных препаратов в новой многообещающей области терапии, которая в ближайшем будущем может расширить доступность лекарств для многих людей, чьи заболевания в настоящее время остаются без лечения.