Синдром Ретта (RTT, Mendelian Inheritance in Man [MIM] 312750) - это редкое генетическое заболевание, приводящее к тяжелой и прогрессирующей умственной отсталости, поражающее почти исключительно детей женского пола с частотой встречаемости примерно 1 на 15 000 живорожденных. Впервые он был описан в 1966 году Андреасом Реттом, психиатром из Австрии, который специализировался на нарушениях нейрального развития.¹ Однако только спустя два десятилетия RTT получил официальное признание после того, как шведский невролог Bengt Hagberg заметил пациентов с похожими симптомами и решил вместе с французскими и португальскими коллегами опубликовать статью с описанием этого синдрома.² Только на RTT приходится 10% случаев глубокой умственной отсталости генетического происхождения у женщин.³ RTT является тяжелым нарушением развития.^{4, 5} Женщины с RTT начинают жизнь внешне "здоровыми". Однако в возрасте от 6 до 18 месяцев у них происходит регресс ранних вех, ухудшаются моторные навыки, зрительный контакт, речь и двигательный контроль; затем у них развивается ряд неврологических симптомов, включая беспокойство, дыхательную дизритмию и судороги.⁵ Поскольку большинство случаев спорадические, выявление причинного локуса было сопряжено с трудностями. Первоначально RTT считался патологией исключительно нервной системы, включающей нейроны и астроциты, но в последние годы выяснилось, что RTT также является метаболической патологией нейронов, включающей холестериновые нарушения.^{6, 7}

В 1999 году группа Huda Zoghbi's выявила гетерозиготные патогенные варианты гена MECP2, расположенного в позиции Xq28 на длинном плече Х-хромосомы, у пациентов с RTT.^{4, 8} Этот ген кодирует одноименный белок, который распространен повсеместно, но экспрессируется в основном в нервной системе. MeCP2 имеет две основные изоформы: MeCP2-E1 и MeCP2-E2, различающиеся несколькими аминокислотными остатками (N)-конца.

MECP2-E2 был выделен первым и использован для определения общих ролей MECP2 в, нацеливании транскрипционных регуляторных комплексов и его влияния на болезнь при RTT.⁹ Позже было установлено, что MECP2-E1 является наиболее распространенной изоформой в мозге и что мутации экзона 1 вызывают RTT.⁹. Однако дифференциальные функции MeCP2-E1 и -E2 остаются практически неизученными, и до сих пор стратегии замены генов были направлены на реэкспрессию MeCP2-E1.¹⁰ По оценкам, более 95% типичных случаев RTT вызваны вариантом MECP2.¹¹ С тех пор как была выявлена связь между MECP2 и RTT, тысячи вариантов MECP2 были зарегистрированы у пациентов по всему миру.⁵ Эти варианты бывают разных типов: миссенс- и нонсенс-мутации, делеции и инсерции со сдвигом или без сдвига рамки считывания. Помимо вариантов, ассоциированных с RTT, хорошо известно, что некоторые полиморфизмы не связаны с заболеванием.⁵ Многие исследователи пытались установить ассоциации генотип-фенотип, чтобы предсказать развитие симптомов у пациентов. Известно, что некоторые варианты, такие как A140V, R133C или делеции карбокси (C)-терминального домена, приводят к умеренному фенотипу.^12-14 Напротив, другие варианты ассоциированы с тяжелыми формами RTT, например, варианты, влияющие на сигнал ядерной локализации белка MeCP2 или приводящие к укороченным белкам в результате вставки преждевременного стоп-кодона.¹⁵ Фенотипическая вариабельность также предопределяется профилем инактивации Х-хромосомы. Действительно, у самок одна из двух Х-хромосом случайным образом инактивируется в каждой клетке. Это явление (инактивация Х-хромосомы), открытое в 1961 году, объясняет большую тяжесть Х-сцепленных доминантных патологий у мужчин. У гетерозиготной самки, как правило, около половины клеток экспрессируют мутантный белок; у гемизиготных самцов, напротив, все клетки экспрессируют мутантный белок. Однако иногда профиль инактивации Х-хромосомы перекошен, и один аллель экспрессируется сильнее, чем другой. Этот перекос в инактивации может быть в пользу здорового или мутировавшего аллеля, отсюда вытекает сложность в проведении сильного корреляционного исследования между генотипом и фенотипом, где необходимо учитывать как тип мутации, так и степень инактивации Х-хромосомы. В дополнение к мутациям с потерей функции, приводящим к RTT, дупликация или трипликация локуса MECP2 приводит к тяжелой умственной отсталости, аутистическим чертам и двигательной дисфункции, что наблюдается у мужчин с синдромом дупликации MECP2.¹⁶ Регулирование дозы гена MECP2 должно быть тонко настроено, поскольку как его отсутствие (тяжелая энцефалопатия у детей мужского пола и RTT у женщин), так и его избыточная экспрессия (синдром дупликации MECP2) приводит к серьезным неврологическим последствиям.¹⁷

MeCP2 - один из наиболее обильно экспрессируемых белков, основным местом действия которого является ядро.¹⁸ Его экспрессия низка на ранних стадиях развития, но постепенно увеличивается в соответствии с ключевой ролью в дифференцировке, созревании, уточнении цепей и поддержании синапсов.¹⁹ В ранние постнатальные периоды в мозге его распределение уже кажется высоким и равномерным. У взрослого человека его уровень достигает максимума в корковых областях, гиппокампе, мозжечке и обонятельной луковице. С другой стороны, экспрессия MeCP2 также высока в легких и селезенке, но значительно ниже в почках, сердце, печени, желудке и кишечнике.²⁰ MeCP2 был условно нокаутирован в различных тканях, областях мозга и типах клеток. Несколько исследований показали, что удаление MeCP2 было особенно пагубным, когда это происходило в нейронах и астроцитах.²¹

Хотя MeCP2 считается эпигенетическим регулятором, его точная роль и биологические функции остаются спорными. Исторически сложилось так, что MeCP2 описывается как транскрипционный репрессор. Механизм, лежащий в основе этой канонической роли, включает связывание MeCP2 с метилированной ДНК через его метил-связывающий домен и уплотнение хроматина через взаимодействие с факторами и комплексами в домене репрессии транскрипции, такими как Sin3A, NCoR и SMRT (через домен взаимодействия NCoR1/SMRT). Эти факторы в дальнейшем служат каркасом для других ДНК-связывающих белков и привлекают деацетилазы гистонов, делая ДНК менее доступной для транскрипционных факторов.^22-24 Другие белки, взаимодействующие с MeCP2, включая ремодельеры хроматина, ДНК/гистоновые метилтрансферазы или хеликазы/АТФазы, вносят свой вклад в MeCP2-опосредованное подавление генов.²⁵ Эта модель подчеркивает важность MeCP2 в соединении связывания ДНК с подавлением генов. В пользу этой роли говорят вызывающие RTT мутации в метил-связывающем домене или домене взаимодействия NCoR1/SMRT, которые особенно вредны как у людей, так и у мышей.⁵ Примечательно, что у мышей, экспрессирующих минимальный белок Mecp2, состоящий из метил-связывающего домена, домена взаимодействия NCoR1/SMRT и линкерных областей, развивается лишь слабый RTT-подобный фенотип. В том же исследовании генетическая реактивация или вирусная доставка гена mini-Mecp2 облегчала симптомы у Mecp2-дефицитных мышей, что подчеркивает необходимость ДНК-связывающей и репрессивной функций MeCP2.²⁶ Помимо этой согласованной репрессивной роли, некоторые исследования предполагают активирующую роль в экспрессии определенных генов.²⁷ Интерпретации репрессивной или активирующей роли MeCP2 также были оспорены из-за способности MeCP2 распознавать метилированные пары оснований гуанин-цитозин и цитозин-аденин, гидроксиметилированные цитозины, и потому что эти модификации связаны либо с репрессией (метилированный цитозин-аденин/метилированный гуанин-цитозин), либо с активацией (гидроксиметилированные цитозины) транскрипции.²⁸

В течение многих лет предпринимались многочисленные усилия для однозначного определения целевых последовательностей MeCP2. Недавние работы показали, что репрессивное влияние MeCP2 на транскрипцию зависит от паттерна метилирования, установленного DNMT3A в цитозин-адениновых сайтах в раннем возрасте²⁹. Интригует то, что на фоне исследований, утверждающих связывание MeCP2 с гидроксиметилированными цитозинами и метилированными цитозинами в цитозин-адениновых сайтах, вопросы об обогащении таких модификаций в мозге, обогащении связывания MeCP2 с этими цитозин-адениновыми повторами в мозге и корреляции между цитозин-адениновыми повторами и MeCP2-зависимой экспрессией генов остаются весьма спорными.³⁰ Несколько лабораторий также пытаются определить, является ли активность MeCP2 геномной или ограничивается определенными генами, например, длинными генами (в среднем в 100 килобаз).^{18, 31} Помимо этих ролей репрессии/активации, функция MeCP2, по-видимому, распространяется и на пост-транскрипционный уровень. Было показано, что MeCP2 регулирует альтернативный сплайсинг через взаимодействие с транскрипционным фактором Y-box и подавляет процессинг микроРНК через изменение сборки комплекса Drosha-DGCR8.^{32, 33} Наконец, несколько исследований также указывают на участие MeCP2 в экспрессии генов посредством его влияния на структуру хроматина высшего порядка.²⁵

После обнаружения причинно-следственной связи между мутацией MeCP2 и RTT было создано множество клеточных и животных моделей. Существует множество моделей мышей, включая конститутивные или условные нокауты, knockin, гипоморфы и дупликации мыши.³⁴ Во многих аспектах эти мыши в точности повторяют соответствующие патологии. Модели мышей RTT кажутся здоровыми при рождении, но затем у них постепенно появляются патологические проявления, как это наблюдается у пациенток. Основные морфологические аномалии центральной нервной системы (ЦНС), связанные с RTT, - это общее снижение веса и объема мозга, а также уменьшение размера клеток нейронов и изменение электрических свойств нейронов.¹⁹ Недавно была показана роль MeCP2 в кортикогенезе.³⁵ Однако до сих пор нет доказательств дегенерации нейронов или апоптоза в соответствии с возможностью восстановления патологии у взрослых мышей.²⁵ Потеря MeCP2 также влияет на количество аксональных boutons и арборизацию аксонов.³⁷ Эти наблюдения показывают, что RTT является заболеванием нейрального развития, а не нейродегенеративным. Группа исследователей показала, что мыши с floxed MeCP2 являются гипоморфными и проявляются на 50% от уровня MeCP2 у мышей дикого типа. Эта работа помогла понять, какое количество MeCP2 необходимо для нормального функционирования организма.³⁸ Несмотря на нормальную кривую выживаемости и массу тела, а также отсутствие зажима задних конечностей, у гипоморфных мышей наблюдаются двигательные нарушения, недостатки в социальном поведении, строительстве гнезд, обучении и измененный характер дыхания. Эти результаты показывают, что экспрессия только половины уровня MeCP2 дикого типа недостаточна, чтобы избежать значительных аномальных фенотипических проявлений.

RTT до сих пор является неизлечимой патологией, единственное доступное лечение которой направлено на облегчение выраженных симптомов и улучшение качества жизни пациентов. Было предложено несколько фармакологических вмешательств, благодаря обнаружению мишеней, представляющих интерес в мышиных моделях RTT. Несмотря на редкость патологии, RTT представляет собой одно из редких заболеваний, которое является наиболее продвинутым в разработке фармакологических методов лечения: более 60 клинических испытаний завершены или находятся в процессе. Однако этих методов лечения недостаточно для излечения заболевания. В этом обзоре мы добровольно решили не рассматривать фармакологические подходы, а сосредоточиться на наиболее инновационных стратегиях, которые направлены только на то, чтобы позволить каждой клетке экспрессировать функциональный Mecp2 и потенциально вылечить патологию. Из-за важности MECP2 в процессе развития нейронов и временного окна его экспрессии долгое время считалось, что повреждения, вызванные его отсутствием, необратимы, несмотря на отсутствие гибели нейронов. Ключевое исследование под руководством Bird ответило на этот вопрос, продемонстрировав, что восстановление экспрессии Mecp2 у взрослых мышей с симптомами может обратить фенотип.³⁶ В свою очередь, специфическая элиминация MeCP2 у взрослых мышей продемонстрировала зависимость зрелого мозга от функций, связанных с MeCP2, и то, что потенциальное лечение должно проводиться на протяжении всей жизни.³⁹ Эти результаты способствовали разработке различных стратегий, направленных на возобновление экспрессии MeCP2 у мышей RTT, и разработке трансляционных подходов для лечения пациентов с RTT. Тем не менее, как было сказано выше, еще предстоит решить вопросы, связанные с точной настройкой дозы гена MeCP2 для восстановления физиологических уровней без риска его избыточной экспрессии.^{16, 17}.

Наиболее распространенный тип доклинических инновационных исследований касается генотерапии, которая может принимать несколько форм. Либо вводится новый генетический материал для компенсации недостатка мутировавшего белка (метод замены генов), либо модифицируется геном/транскриптом организма, пораженного заболеванием (редактирование генома или РНК). Среди доступных вирусных векторов, которые могут быть использованы для генотерапии у человека, адено-ассоциированные вирусы (AAV) быстро стали предпочтительным вариантом, учитывая их способность достигать долгосрочных профилей экспрессии как в делящихся, так и в неделящихся клетках, и предлагать клеточно-специфические тропизмы в зависимости от используемого серотипа. Кроме того, AAV вызывают очень слабый иммунный ответ in vivo, что делает их векторами с высоким профилем биобезопасности. На сегодняшний день ограниченное количество исследований in vitro и клеточных исследований позволило предложить использование лентивирусных векторов, экспрессирующих MeCP2.⁴⁰ Перенос этих стратегий на человека представляется более сложным, поскольку они не превосходят AAVs, и поэтому требуют дальнейшего изучения.

Первая опубликованная работа по генотерапии на мышиной модели RTT в 2013 году показала, что интрацеребральное введение одноцепочечного вектора AAV9-Mecp2 неонатальным Mecp2-KO (нокаут) мышам (P1-P3) индуцировало экспрессию MeCP2 в структурах мозга (до 41,5% трансдуцированных клеток) и улучшило фенотип мыши.⁴¹ Те же авторы вводили вектор scAAV9-pME (229 пар оснований)-Mecp2 внутривенно 30-дневным мышам Mecp2-KO. Эта инъекция повысила выживаемость мышей, прошедших лечение (хотя у мышей наблюдались признаки гепатотоксичности). Была проведена оценка биораспределения этого AAV (введенного в хвостовую вену), которая показала, что печень является наиболее трансдуцированным органом, за ней следуют сердце, селезенка, почки и ЦНС (основная мишень, хотя трансдуцировано менее 4% клеток).⁴¹ Эти очень низкие показатели трансдукции в мозге могут объяснить ограниченное улучшение фенотипа у обработанных мышей. Также в 2013 году в другом исследовании были показаны значительные улучшения у самцов Mecp2-KO и гетерозиготных самок мышей, которых на симптоматической стадии лечили вектором scAAV9-pME (700 base pair)-Mecp2.⁴² Несмотря на использование более высокой дозы, чем в работе Gadalla et al.,⁴¹ , увеличения смертности не наблюдалось (хотя авторы не оценивали потенциальные побочные эффекты). Однако они наблюдали усиленную трансдукцию AAV, иногда до 25% клеток экспрессировали MeCP2 в некоторых областях мозга мышей, обработанных Mecp2-KO. Эти различия могут быть связаны как с вводимой дозой, так и с конструкцией вектора, который имеет промотор в три раза длиннее, чем использовавшийся ранее, что позволяет лучше контролировать экспрессию трансгена.²⁹ В 2017 году было опубликовано еще несколько исследований.^{26, 43-45} Недавнее исследование нашей лаборатории подтвердило, что внутривенное введение AAV9, содержащего оптимизированную кодоновую версию Mecp2, гетерозиготным самкам привело к функциональным улучшениям, но также привело к печеночной патологии.⁴⁶

Действительно, RTT поражает исключительно женщин, которые являются генетическими мозаиками (~50% клеток экспрессируют MeCP2 дикого типа, 50% - мутантные). Важно отметить, что избыточная экспрессия MECP2 также является патогенной, поскольку пациенты с синдромом дупликации MECP2 страдают от нарушения нейрального развития и умственной отсталости.¹⁴ Поэтому необходимо избегать одновременного лечения здоровых и мутировавших клеток, что привело бы к избыточной экспрессии MeCP2 в клетках с базальным уровнем MeCP2. Исследования с использованием гипоморфных или избыточно экспрессирующих MeCP2 мышей направлены на выявление оптимальных уровней MeCP2, которые могут переноситься клетками.

После исследования 2013 года Gadalla et al. модифицировали свой вектор для снижения побочных эффектов со стороны печени.⁴⁴ Они использовали scAAV9.47-pMe (426 пар оснований)-Mecp2 с 3' не-транслируемой областью для включения ключевых регуляторных элементов и ограничения избыточной экспрессии MeCP2.³² Такая инъекция повысила выживаемость и массу тела обработанных мышей, не вызывая печеночной патологии, несмотря на высокую трансдукцию в печени.

Чтобы улучшить низкий уровень трансдукции AAV в мозге после системной инъекции, был создан AAV9-PhP.B. Этот новый AAV обладает способностью, не вызывая патологии, проникать в печень. Этот новый AAV обладает способностью после внутривенной инъекции избирательно трансдуцировать нейроны ЦНС.⁴⁷ Этот новый инструмент был использован в 2020 году для доставки "нестабильного" трансгена Mecp2 с уменьшенным периодом полураспада (для снижения риска избыточной экспрессии Mecp2) как в мужскую, так и в женскую модели RTT мышей.⁴⁸ Результаты этого исследования показали интересное фенотипическое улучшение благодаря высокой скорости трансдукции вектора в ЦНС. Иммунный ответ все еще наблюдался у инъецированных самцов с выработкой анти-Mecp2 антител, но не у гетерозиготных самок. Трансдукция в печень была подтверждена, и никаких побочных эффектов, связанных с потенциальной гепатотоксичностью, не наблюдалось.⁴⁸ Хотя результаты этого исследования весьма обнадеживающие, работа, показавшая эффективность PhP.B только на мышах C57Bl/6J, ограничивает трансляционный потенциал этого исследования.⁴⁹ Tillotson et al. предположили, что полная последовательность Mecp2 не является необходимой и что введение интрацеребрально scAAV9-pME (426 пар оснований)-Mecp2-усеченного гена самцам P1-P2 Mecp2-KO позволяет экспрессировать Mecp2 в 50% клеток мозга и значительно улучшить фенотип.²⁶ Эти результаты особенно интересны, поскольку различные исследования показали, что отсутствие регуляторных элементов из-за ограниченного пространства в AAV9 вызывало избыточную экспрессию токсичного Mecp2, в основном в печени. Поэтому возможность использования мини-трансгена Mecp2 позволила бы освободить пространство для введения различных дополнительных регуляторных элементов. Чтобы ограничить проблемы, связанные с избыточной экспрессией трансгена, команда разработала AAV с 3' не-транслируемой областью, несущей мишени микроРНК, которые регулируют экспрессию Mecp2. Например, мишени miRNA-122 снижают экспрессию трансгена в печени.⁵⁰ Их панель мишеней микроРНК называется miRARE (MiRNA-responsive autoregulatory element). Их конструкция pME (426 base pair)-Mecp2 truncated-miRARE затем была помещена в scAAV9, а также AAV.PhP.B.⁵⁰ Интратекальное введение самцам P30 Mecp2-KO в основном улучшало выживаемость. Однако добавление miRARE-подобных регуляторных последовательностей, по-видимому, является реальным преимуществом для лучшего контроля экспрессии трансгена.

Совсем другая стратегия ограничения эффектов избыточной экспрессии MeCP2 может заключаться в нацеливании ядерного транспорта MeCP2 для точной регулировки его содержания в ядере. Предыдущие исследования утверждали участие импортинов α3 и α4 в ядерном переносе MeCP2, а анализ in vivo показал специфический дефицит ядерного транспорта MeCP2 в гиппокампе мышей с удаленным импортином α5.^51-53. Импортины α подчеркивают перекрывающуюся специфичность груза in vitro и в гетерологичных системах, демонстрируя при этом изысканную специфичность in vivo.^53-56 Будущие исследования в этом направлении могут помочь разработать генетические и фармакологические стратегии для специфической модуляции ядерного транспорта MeCP2, которые могли бы сопровождать терапию замены гена MeCP2.

Благодаря прямому исправлению дефектного гена в клетке целевым, стабильным и постоянным способом, редактирование генома MECP2 дает возможность экспрессии здорового белка на эндогенном уровне, что позволяет избежать побочных эффектов избыточной экспрессии, наблюдаемых при стратегии замены. Для выполнения редактирования генома в клетку должна быть импортирована нуклеаза, способная разрезать геном там, где это необходимо, и сегмент ДНК или РНК, используемый для восстановления. Система CRISPR-Cas9, состоящая из фермента Cas9 и синтетически сконструированной направляющей РНК (gRNA), быстро стала самым популярным методом редактирования генов.⁵⁷ Cas9 и gRNA образуют рибонуклеиновый комплекс, способный распознавать и расщеплять целевую последовательность. После расщепления двухцепочечной ДНК разрез восстанавливается либо путем негомологичного соединения концов (NHEJ), либо путем гомологично направленной репарации, которая позволяет точно восстановить геном по шаблону донорской ДНК (рис. 1). Эта система эффективна, быстра и проста в использовании, что делает ее ведущим инструментом для лечения генетических заболеваний. Однако два предостережения ограничивают ее использование в генотерапии. Первое - это вне-целевые модификации последовательностей, которые отличаются от целевой последовательности всего на несколько нуклеотидов, что может привести к изменению важных генов (чем дольше экспрессируется Cas9, тем выше риск внецелевых модификаций).⁵⁸ Второе - для совместной экспрессии Cas9 и gRNA необходимо трансдуцировать в одну и ту же клетку двумя разными AAV, поскольку размер помещения в капсиду одного из них недостаточен. В настоящее время разрабатываются два подхода к редактированию генома для RTT. Beam therapeutics нацелена на персонализированную медицину путем воздействия на одноточечные мутации. Исследование на фибробластах пациентов и нейронах, полученных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, показало успех этого подхода для исправления мутации T158M.⁵⁹ Экспрессия Cas9 была ограничена путем добавления последовательности, распознаваемой Cas9, между его собственной последовательностью и промотором, чтобы обеспечить его само-расщепление. Этот двухвекторный подход позволил отредактировать в среднем около 45% клеток. В качестве альтернативы команда Jonathan Watts' из Массачусетского университета осуществляет редактирование экзонов путем замены экзонов 3 и 4. Этот подход позволил бы с помощью той же технологии исправить 97% мутаций, вызывающих RTT. Первое исследование in vitro, проведенное другой командой, показало эффективность от 20% до 30% в клеточных линиях, полученных от пациентов с RTT, для мутаций, расположенных в экзоне 4.⁶⁰ В этой работе они использовали два вектора, содержащие две gRNA, нацеленные только на мутировавший аллель, шаблон ДНК дикого типа для гомологически-направленной репарации большой части экзона 4 (2,5 килобазы) и Cas9. Эти интересные доказательства концепции все еще сталкиваются с ограниченной доступностью тканей ЦНС, как и в случае терапии замещения генов, и эта проблема усугубляется необходимостью ко-трансдукции двух векторов в одну и ту же клетку.



FIGURE 1 Innovative therapeutic developments in Rett syndrome. (a) DNA editing. Double-strand breaks guided by Cas9 and its guide RNA can be repaired by non-homologous end joining (NHEJ) or by homology-directed repair (HDR) in the presence of donor DNA. (b) RNA editing. A modified Cas13 fused to adenosine deaminase acting on RNA (ADAR) which deaminates an adenosine to an inosine at a specific target site. The inosine is then read as a guanine by the translation machinery. (c) X-chromosome reactivation. In female cells, one of the two X chromosomes is randomly inactivated to balance the expression of genes. Pharmacological strategies allow the reactivation of the inactive X (Xi) carrying the healthy Mecp2 gene.

Существует врожденный клеточный механизм, включающий ферменты (эдитазы или аденозиндеаминазы, действующие на РНК [ADARs]), которые могут редактировать мРНК, если во время транскрипции была допущена ошибка.⁶¹ В отличие от геномного редактирования, РНК быстро разрушается, и модификации не являются постоянными. Для нацеливания на конкретную РНК в некоторых исследованиях используется слияние доменов ADAR с белком, способным связываться с РНК, таким как Cas13, а также со специфической gRNA для целевой последовательности.⁶² Исторически единственным доступным способом редактирования были варианты G>A. Дезаминирование аденозина (A) в инозин (I) под действием эдитазы позволяет клетке считать основание гуанином (G) при трансляции мРНК в белок. Многие лаборатории модифицируют эдитазы, чтобы расширить их возможности, и теперь можно исправить 6 из 12 точечных мутаций: C>T, A>G, C>G, G>A, T>C, G>C. Из патогенных вариантов, вызывающих RTT, 36% - это варианты G>A или C>T, которые вносят стоп-кодоны.⁶³ Были сгенерированы мыши knockin с патогенным вариантом 317G>A (R106Q) в гене Mecp2.⁶³ In vitro репарация РНК и функциональность транслированного белка были продемонстрированы в культурах первичных нейронов мыши R106Q.⁶⁴ Эти нейроны были трансдуцированы AAV, содержащими гиперактивный фермент ADAR2, слитый с пептидом бактериофага, и направляющую последовательность. Затем та же группа успешно испытала технологию in vivo, введя вектор AAV в гиппокамп мышей P30.⁶⁵ Анализируя вне-целевые модификации, они насчитали не менее 2984 сайтов редактирования РНК, причем лишь немногие из них находились в последовательности, покрываемой gRNA, а скорее были распределены по всему транскриптому. Степень вне-целевого редактирования коррелирует с уровнем ADAR2, присутствующим в клетках. Вероятно, периферическое введение AAV (по сравнению с интрацеребральным) приводит к более низкому уровню ADAR в клетках и, таким образом, ограничивает вне-целевые модификации. Влияние такого редактирования РНК на фенотип мышиной модели еще не изучено. Как и в случае с другими технологиями, доступность AAVs в мозг будет ограничением. Также важно создать более эффективные ферменты, которые вызывают меньше модификаций вне цели, чтобы ограничить побочные эффекты.

Инактивация Х-хромосомы - это случайное явление, происходящее в женских клетках для баланса экспрессии генов, переносимых одной из двух Х-хромосом. Инактивация инициируется не-кодирующей РНК Xist и достигается путем метилирования и гетерохроматинизации инактивированной хромосомы.⁶⁶ Xist необходим для установления инактивации Х-хромосомы во время эмбриогенеза и ее поддержания на протяжении всей жизни.⁶⁷ Благодаря этому механизму только одна Х-хромосома активна, и гены, которые она несет, могут экспрессироваться в женских клетках. Учитывая случайность инактивации, самки, таким образом, являются мозаиками. RTT вызывается гетерозиготными вариантами, клетки случайным образом экспрессируют либо здоровый, либо мутировавший белок MeCP2. Обнаружение здоровых носителей мутации MECP2 в результате смещения инактивации Х-хромосомы⁶⁸ позволяет предположить, что реактивация не-мутированной Х-хромосомы у пациентов с RTT является перспективной терапевтической стратегией. Фармакологическое ингибирование факторов, ответственных за инактивацию Х-хромосомы, позволило реактивировать Х-хромосому, несущую здоровый аллель MECP2, в фибробластах пациентов и нейронах мышей, что привело к активации обеих Х-хромосом.⁶⁹ Чтобы определить побочные эффекты, связанные с активацией различных генов, переносимых Х-хромосомой, после активации обеих Х-хромосом в клетке, авторы исследовали самок мыши Stc1-/- с отсутствием случайной инактивации Х-хромосомы. Результаты показали, что эти мыши имели нормальную продолжительность жизни и, что удивительно, не экспрессировали избыточно большинство (98%) генов, переносимых Х-хромосомой. Это говорит о том, что компенсаторные механизмы могут предотвращать общую избыточную экспрессию генов. В 2018 году in vitro было показано, что совместное использование низкомолекулярного ингибитора метилирования ДНК и анти-смыслового олигонуклеотида против Xist позволяет реактивировать MECP2.⁷⁰ Однако при таком подходе реактивация не была специфичной для MECP2, а затрагивала всю Х-хромосому. Другая группа исследователей описала фармакологическую реактивацию Mecp2, переносимого неактивной Х-хромосомой, in vivo в нейронах коры головного мозга мыши путем интрацеребрального введения двух различных молекул, ACVR1 (рецептор активина А типа I) и PDPK1 (киназа пируватдегидрогеназы 1).⁷¹ С 2017 года лаборатории пытаются выявить другие регуляторы Xist, на которые можно было бы воздействовать фармакологически.⁷² Ингибиторы пути JAK/STAT, как было показано in vitro, реактивируют неактивную Х-хромосому.⁷³ Однако эффективность реактивации зависит от ткани и типа клеток.

Серой зоной остается реактивация Х-хромосомы в случае гипоморфных мутантных аллелей MECP2, таких как R133C. До сих пор увеличение экспрессии MeCP2 у самок мышей R133C могло исправить некоторые недостатки, но вызывало синдром дупликации MECP2, подобный фенотипам моторики, тревожности и памяти страха, но аналогичные стратегии у самок мышей T158M или R255X не "исправляли" эти фенотипы.^74-76 Таким образом, будет важно проверить терапевтическое воздействие реактивации Х-хромосомы в моделях мышей, экспрессирующих различные варианты Mecp2.

Также остаются некоторые вопросы о транскрипционной и пост-транскрипционной регуляции гена MECP2 в контексте реактивации инактивированной Х-хромосомы. Как уже говорилось выше, MeCP2 существует в виде двух изоформ, обладающих тканевой специфичностью, но также не дублирующих друг друга.⁷⁷ Кроме того, оба белка MeCP2 кодируются транскриптами с разной длиной 3' не-транслируемой области, которые подвержены регуляции на основе микроРНК.⁷⁸. В настоящее время генотерапия в основном сосредоточена на экспрессии MeCP2-E1, хотя трансгенное спасение дефицита MeCP2 может быть достигнуто с помощью любой из изоформ у мышей.⁷⁹ В этом контексте реактивация заглушенной Х-хромосомы должна позволить как возобновление экспрессии, так и оптимальную регуляцию MeCP2.

Наш обзор был посвящен многообещающим достижениям в области генотерапии. Большинство подходов, разработанных академическими лабораториями и промышленностью, направлены на замену MeCP2. Многие стратегии сталкиваются с проблемами, связанными с необходимостью точной регуляции уровня MeCP2, чтобы избежать вредных эффектов, связанных с его избыточной экспрессией. Редактирование генов и реактивация X обещают интересные стратегии, поскольку редактирование или возобновление экспрессии родного локуса обеспечивают эндогенную экспрессию MECP2; таким образом, они позволяют избежать риска развития фенотипов избыточной экспрессии синдрома дупликации MECP2. Кроме того, стратегии замены генов и редактирования генов все еще сталкиваются с ограничением эффективности трансдукции, и для улучшения доставки в мозг требуется дополнительная работа. В этом смысле сочетание доставки вирусных векторов с технологиями фокусированного ультразвука показало многообещающие результаты в области доставки в ЦНС.⁸⁰ Хотя эти различные стратегии показали обнадеживающие результаты в доклинических исследованиях, для разработки наилучшего генетического подхода требуется дальнейшая доработка. Также заманчиво посмотреть на новые разработки биоинформационных конвейеров, которые могут пролить свет на новые препараты-кандидаты, улучшающие фенотипы RTT.⁸¹ Мы считаем, что такой интегративный подход и быстрое развитие этих областей станут ключом к поиску лечения RTT.